Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Intestinal epitelregenerering som svar på joniserande bestrålning

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64028
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University, 2Department of Physiology and Biophysics, Renaissance School of Medicine at Stony Brook University

Summary

Mag-tarmkanalen är ett av de mest känsliga organen för skador vid radioterapeutiska cancerbehandlingar. Det är samtidigt ett organsystem med en av de högsta regenerativa kapaciteterna efter sådana förolämpningar. Det presenterade protokollet beskriver en effektiv metod för att studera tarmepitelets regenerativa kapacitet.

Abstract

Tarmepitelet består av ett enda lager av celler men innehåller flera typer av terminalt differentierade celler, vilka genereras av aktiv proliferation av tarmstamceller belägna i botten av tarmkrypter. Men under händelser med akut tarmskada genomgår dessa aktiva tarmstamceller celldöd. Gammabestrålning är en allmänt använd kolorektal cancerbehandling, som, även om den är terapeutiskt effektiv, har bieffekten att tömma den aktiva stamcellspoolen. Faktum är att patienter ofta upplever gastrointestinalt strålningssyndrom medan de genomgår strålbehandling, delvis på grund av aktiv stamcellsutarmning. Förlusten av aktiva tarmstamceller i tarmkrypter aktiverar en pool av typiskt vilande reservtarmstamceller och inducerar dedifferentiering av sekretoriska och enterocytprekursorceller. Om inte för dessa celler skulle tarmepitelet sakna förmågan att återhämta sig från strålbehandling och andra sådana stora vävnadsförolämpningar. Nya framsteg inom härstamningsspårningsteknik möjliggör spårning av aktivering, differentiering och migration av celler under regenerering och har framgångsrikt använts för att studera detta i tarmen. Denna studie syftar till att avbilda en metod för analys av celler i musens tarmepitel efter strålskada.

Introduction

Det mänskliga tarmepitelet skulle täcka ungefär ytan på en halv badmintonbana om den placerades helt platt1. Istället komprimeras detta enda cellskikt som skiljer människor från innehållet i deras tarmar i en serie fingerliknande utsprång, villi och indragningar, krypter som maximerar tarmarnas yta. Epitelets celler skiljer sig längs en krypt-villusaxel. Villusen består huvudsakligen av näringsabsorberande enterocyter, slemutsöndrande bägarceller och de hormonproducerande enteroendokrina cellerna, medan kryptorna huvudsakligen består av defensinproducerande Paneth-celler, aktiva stamceller och reservstamcellersamt stamceller 2,3,4,5. Vidare genererar den dubbelriktade kommunikationen som dessa celler har med stroma- och immuncellerna i det underliggande mesenkymala facket och lumenets mikrobiota ett komplext nätverk av interaktioner som upprätthåller tarmhomeostas och är avgörande för återhämtning efter skada 6,7,8.

Tarmepitelet är den snabbaste självförnyande vävnaden i människokroppen, med en omsättningshastighet på 2-6 dagar 9,10,11. Under homeostas delar aktiva stamceller vid basen av tarmkrypter (kryptbaskolonnceller), markerade av uttrycket av leucinrika upprepade innehållande G-proteinkopplad receptor 5 (LGR5), snabbt och tillhandahåller stamceller som differentieras till alla andra tarmepitellinjer. På grund av sin höga mitotiska hastighet är aktiva stamceller och deras omedelbara förfäder särskilt känsliga för gammastrålningsskador och genomgår apoptos efter bestrålning 5,12,13,14. Vid deras förlust genomgår reservstamceller och icke-stamceller (subpopulation av förfäder och vissa terminalt differentierade celler) i tarmkrypter aktivering och fyller på basalkryptfacket, vilket sedan kan rekonstruera cellpopulationer av villi och därmed regenerera tarmepitelet15. Med hjälp av härstamningsspårningstekniker har flera forskargrupper visat att reservstamceller (vilande) kan stödja regenerering vid förlust av aktiva stamceller 13,16,17,18,19,20,21,22. Dessa celler kännetecknas av närvaron av polykamkomplexprotein 1 onkogen (Bmi1), mustelomeras omvänd transkriptasgen (mTert), Hop homeobox (Hopx) och leucinrikt upprepat protein 1-gen (Lrig1). Dessutom har det visats att icke-stamceller kan fylla på tarmkrypter vid skada 23,24,25,26,27,28,29,30,31. I synnerhet har det visats att föregångare till sekretoriska celler och enterocyter genomgår dedifferentiering vid skada, återgår till stamliknande celler och stöder regenerering av tarmepitelet. Nya studier har identifierat celler som uttrycker flera markörer som har förmågan att förvärva stamliknande egenskaper vid skada (såsom DLL +, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Överraskande visade Yu et al. att även mogna Paneth-celler (LYZ +) kan bidra till tarmregenerering37. Förutom att orsaka apoptos av tarmepitelceller och störa epitelbarriärfunktionen resulterar bestrålning dessutom i dysbios av tarmfloran, immuncellsaktivering och initiering av ett proinflammatoriskt svar och aktivering av mesenkymala och stromaceller38,39.

Gammastrålning är ett värdefullt terapeutiskt verktyg vid cancerbehandling, särskilt för kolorektala tumörer40. Bestrålning påverkar emellertid signifikant tarmhomeostas genom att inducera skador på cellerna, vilket leder till apoptos. Strålningsexponering orsakar flera störningar som saktar ner patientens återhämtning och kännetecknas av slemhinneskada och inflammation i den akuta fasen och diarré, inkontinens, blödning och buksmärta på lång sikt. Denna panoply av manifestationer kallas gastrointestinal strålningstoxicitet. Dessutom kan strålningsinducerad progression av transmural fibros och / eller vaskulär skleros endast manifestera år efter behandlingen38,41. Samtidigt med själva skadan inducerar strålning ett reparationssvar i tarmceller som aktiverar signalvägar som är ansvariga för att initiera och orkestrera regenerering42. Strålningsinducerad tunntarmssjukdom kan härröra från strålbehandling av bäcken eller buk som ges till andra organ (såsom livmoderhals, prostata, bukspottkörtel, rektum)41,43,44,45,46. Tarmbestrålningsskada är således en betydande klinisk fråga, och en bättre förståelse av den resulterande patofysiologin kommer sannolikt att främja utvecklingen av interventioner för att lindra gastrointestinala komplikationer i samband med strålbehandling. Det finns andra tekniker som gör det möjligt att undersöka det regenerativa syftet med tarmepitelet förutom strålning. Transgena och kemiska murina modeller för att studera inflammation och regenerering därefter har utvecklats47. Dextrannatriumsulfat (DSS) inducerar inflammation i tarmen och leder till utveckling av egenskaper som liknar inflammatoriska tarmsjukdomar48. En kombination av DSS-behandling med den pro-cancerframkallande föreningen azoxymetan (AOM) kan resultera i utveckling av kolitassocierad cancer48,49. Ischemi-reperfusionsinducerad skada är en annan metod som används för att studera tarmepitelets regenerativa potential. Denna teknik kräver erfarenhet och kirurgisk kunskap50. Dessutom orsakar de ovan nämnda teknikerna andra typer av skador än strålning och kan leda till involvering av olika regenereringsmekanismer. Dessutom är dessa modeller tidskrävande, medan strålningstekniken är ganska kort. Nyligen har in vitro-metoder som använder enteroider och kolonoider genererade från tarmen och tjocktarmen använts i kombination med strålskada för att studera mekanismerna för tarmregenerering51,52. Dessa tekniker rekapitulerar dock inte helt det organ de modellerar53,54.

Det protokoll som presenteras innehåller en beskrivning av en murin modell av gammastrålningsskada i kombination med en genetisk modell som, efter tamoxifenbehandling, tillåter spårning av släktlinjer som härrör från reservstamcellspopulationen (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Denna modell använder en 12 Gy bestrålning av hela kroppen, vilket inducerar tillräckligt stor tarmskada för att aktivera reservstamceller samtidigt som den möjliggör efterföljande undersökning av tarmregenerativ förmåga inom 7 dagar efter skada55.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla möss var inrymda i avdelningen för laboratoriedjurresurser (DLAR) vid Stony Brook University. Stony Brook University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) godkände alla studier och förfaranden som involverade djurämnen. Försök med försökspersoner utfördes strikt i enlighet med det godkända djurhanteringsprotokollet (IACUC #245094).

OBS: Musstammarna B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) och B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) erhölls kommersiellt (se materialförteckning) och korsades för att erhålla Bmi1-Cre ER; Rosa26eYFP (Bmi1ctrl) möss, som beskrivits tidigare56,57,58.

1. Bostäder av Bmi1-Cre ER; Rosa26 eYFP-möss

  1. Håll mössen i en djuranläggning vid en temperatur som sträcker sig från 68-72 ° F och fuktighet från 30-70%, i en 12 h / 12 h ljus / mörk cykel, med vatten och normal chow ad libitum.
  2. Före experimenten, bekräfta mössgenotyper med hjälp av en standard PCR-genotypningsteknik57,58.

2. Beredning av djur och material

  1. Överför möss till experimenthusets rum minst 7 dagar före experiment för att låta mössen acklimatisera sig.
  2. Matcha försöks- och kontrolldjur enligt kön och ålder.
  3. Utsätta kontrolldjuren för tamoxifeninducerad Cre-medierad rekombination men inte för bestrålning (skenbehandling, 0 Gy) samtidigt som man säkerställer att försöksdjuren får tamoxifeninjektionen och utsätts för gammabestrålning.
  4. Förbered tamoxifenlösningen. Resuspendera tamoxifen pulver i steril majsolja i en koncentration av 30 mg / ml. Sonicate i 3 min i cykler om 30 s ON och 30 s OFF med 60% amplitud och rotera sedan i mörkret i 1 h vid rumstemperatur (RT). Tamoxifenlösning kan frysas vid −20 °C men får inte frysas/tinas mer än en gång. Förbered helst en ny lösning varje gång och förvara den inte.
    Tamoxifen är ljuskänslig. Vik in den med tennfolie under rumstemperaturrotation.
    VARNING: Tamoxifen är ett potentiellt farligt ämne: hälsofara (GHS08) och miljöfara (GHS09).
  5. Bered stamlösning av 5-etynyl-2′-deoxiuridin (EdU). Resuspendera EdU-pulver i 1/5 av den totala volymen steril dimetylsulfoxid (DMSO) och tillsätt långsamt de återstående 4/5 av den totala volymen sterilt ultrarent vatten. När den är helt upplöst, ät och förvara vid -20 °C.
    VARNING: 5-etynyl-2′-deoxiuridin (EdU) och dimetylsulfoxid (DMSO) är potentiellt farliga ämnen: hälsofara (H340 och H631 respektive H227, H315 respektive H319). EdU kan orsaka genetiska defekter och misstänks skada fertilitet eller ofödda barn, och DMSO kan orsaka hud- och ögonirritation.
  6. Bered reagenser för vävnadsuppsamling och fixering: späd etanol för att bereda en 70-procentig vattenlösning, kyl ned DPBS till 4 °C och bered modifierad Bouins fixeringsbuffert (50 % etanol och 5 % ättiksyra i destilleratH2O) och 10 % buffrat formalin.
    VARNING: Etylalkohol är ett potentiellt farligt ämne: Hälsofara (H225-H319), brandfarligt (GHS02) och orsakar akut toxicitet (GHS07). Ättiksyra är ett potentiellt farligt ämne: hälsofara (H226-H314), brandfarligt (GHS02) och frätande (GHS05). Formalin är ett potentiellt farligt ämne: hälsofara (H350, H315, H317, H318, H370) och frätande. Formalin kan orsaka cancer, hud- och ögonirritation, skador på organ och allergiska hudreaktioner.
  7. Förbered den utrustning som behövs för avlivning enligt en godkänd metod (t.ex. CO2-kammare ), en mössdissektionskit (sax, pincett), petriskålar, en 16 G sondnål fäst vid en 10 ml spruta för att spola tarmarna och histologiska kassetter.

3. Total kroppsgammabestrålning (TBI) och vävnadsinsamling

  1. Två dagar före gammabestrålningsexponering, injicera försöksdjuren med en enda dos tamoxifen för att inducera Cre-medierad rekombination och BMI1 / EYFP + celllinjespårning. Väg varje djur och beräkna en dos på 40 mg/kg kroppsvikt tamoxifen som återsuspenderats i majsolja. Desinficera bukområdet med 70% etanol och administrera tamoxifen intraperitonealt med en 27G nål fäst vid en 1 ml spruta.
  2. Observera djur under följande 48 timmar för att utesluta potentiell tamoxifentoxicitet.
  3. Överför mössen till bestrålningsrummet enligt den lokala institutionens anvisningar.
  4. Beräkna den tid för bestrålningsexponering som frigörs av 137Cs-källan enligt den aktuella exactordosraten. Om t.ex. den aktuella dosraten är lika med 75,9 rad/min (0,759 Gy min−1 = 75,9 cGy m−1) beräknas exponeringstiden i minuter som önskad dos/0,759. För att bestråla djuren till en dos på 12 Gy TBI är exponeringstiden ~ 15,81 min (15 min och 48 s).
  5. Desinficera provkammaren i gammastrålaren med 70% etanollösning; Placera den absorberande mattan och djuren inuti provkammaren.
    OBS: Skambehandlade djur ska placeras i bestrålningsrummet men inte utsättas för gammabestrålning.
  6. Placera locket och stäng kammaren.
  7. Programmera gammastrålningen så att djuren exponeras för 12 Gy TBI.
    1. Slå på maskinen genom att vrida nyckeln till START-läge.
    2. Ange operatörsnumret med ett numeriskt tangentbord och bekräfta genom att trycka på ENTER.
    3. Ange PIN-koden med ett numeriskt tangentbord och bekräfta genom att trycka på ENTER.
    4. Tryck på 1 för alternativ.
    5. Tryck på 1 för timerinställningar.
    6. Tryck 1 för bestrålningstid.
    7. Ange timerinställningen för nästa cykel med hjälp av ett numeriskt tangentbord (hh:mm:ss-format) och bekräfta genom att trycka på RETUR.
    8. Bekräfta inställningarna en gång till genom att trycka på ENTER.
    9. Gå tillbaka till hemmenyn genom att trycka på CLEAR 2x.
    10. Tryck på START för att initiera exponeringen.
  8. Lämna rummet för aktiv exponering. Maskinen stannar automatiskt efter att den förinställda tiden har gått ut och börjar pipa.
    VARNING: Cesium-137 (137Cs) är ett dödligt farligt ämne (hälsorisk: H314). Extern exponering för stora mängder 137C kan orsaka brännskador, akut strålningssjuka och till och med dödsfall.
  9. Stäng av maskinen genom att vrida nyckeln till STOP-läge.
  10. Öppna provkammaren, ta av locket, överför djuren tillbaka till buren och desinficera provkammaren med 70 % etanollösning.
  11. Överför djuren tillbaka till det konventionella inhysningsrummet och observera deras tillstånd efter behandlingen.
  12. Övervaka djurens vikt varje dag och avliva dem omedelbart (trots den planerade tidpunkten) om några symtom på förändrat välbefinnande, nöd eller viktminskning som överstiger 15% av startkroppsvikten observeras.
  13. Tre timmar före planerad dödshjälp desinficera bukområdet och injicera mössen med 100 μL EdU-stamlösning (administrerat intraperitonealt) med hjälp av en 28G insulinspruta.
  14. Samla proximala tarmar vid 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h och 168 h efter bestrålning.
    1. Utför CO2 eutanasi enligt heminstitutionens standarder.
      VARNING: Koldioxid är ett farligt ämne (H280). Innehåller gas under tryck; kan explodera vid uppvärmning. Kan förskjuta syre och orsaka snabb kvävning.
    2. Dissekera sedan den proximala delen av tunntarmen, ta bort bifogade vävnader, spola med kall DPBS med en 16 G rakmatningsnål fäst vid en 10 ml spruta, fixera med modifierad Bouins fixativa buffert med en 16 G rak matningsnål fäst vid en 10 ml spruta, skär upp i längdriktningen och rulla de proximala tarmarna med hjälp av swiss-roll-tekniken som beskrivits tidigare59.
  15. Placera vävnaderna i en histologisk kassett och låt stå i 24-48 timmar vid rumstemperatur i en behållare med 10% buffrat formalin. Formalinets volym bör vara tillräcklig för att helt täcka de histologiska kassetterna. När inkubationstiden går, överför de histologiska kassetterna till behållaren fylld med 70% etanol med hjälp av pincett. Fortsätt sedan med inbäddning av vävnadsparaffin.
    OBS: Inbäddning av vävnadsparaffin utfördes av Research Histology Core Laboratory vid Stony Brook University. Förfarandet kan stoppas här och paraffinblock kan förvaras vid rumstemperatur.
    VARNING: Formalin är ett potentiellt farligt ämne: Hälsofara (H350, H315, H317, H318, H370) och frätande. Formalin kan orsaka cancer, hud- och ögonirritation, skador på organ och allergiska hudreaktioner.

4. Histologisk analys

  1. Kyl ner de histologiska kassetterna som innehåller de paraffininbäddade vävnadsproverna genom att lägga dem på is i minst 1 timme. Förbered 5 μm tjocka sektioner för färgning med hjälp av en mikrotom. Varje vävnad ska skivas horisontellt för att täcka hela det rullade provet.
    1. Efter att ha klippt paraffinblocket, överför vävnadssektionerna till ett vattenbad uppvärmt till 45 °C och placera sektionerna på laddade objektglas. Lämna bilderna på ett galler över natten vid rumstemperatur för att torka.
      OBS: Proceduren kan stoppas här och bilderna kan förvaras vid rumstemperatur.
  2. Placera rutschkanorna i en glidhållare och grädda i en ugn på 65 °C över natten. Rutschkanorna kan gräddas en kortare tid, 1-2 h. Detta är dock inte tillrådligt när det gäller nyklippta (mindre än 1 månad gamla) snittglas.
    OBS: Placera den manuella glidfärgningssatsen under den kemiska huven och utför inkubationerna med xylen, etanol och hematoxylin under den kemiska huven.
  3. Nästa dag, kyl ner bilderna genom att placera dem i en glidhållare under den kemiska huven i 10 minuter.
  4. Avparaffinisera vävnaderna genom att placera glidhållaren i en behållare fylld med 100% xylen i 3 minuter. Upprepa inkubation med färsk 100% xylen.
    OBS: Från det ögonblicket, se till att proverna hålls våta hela tiden.
    VARNING: Xylen är ett potentiellt farligt ämne: brandfarligt (GHS02), orsakar akut toxicitet (GHS07) och en hälsofara (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). De potentiella farliga effekterna är att det är dödligt vid förtäring eller kommer in i luftvägarna och kan orsaka hud-, ögon- och andningsirritation. Dessutom kan det påverka motoriska funktioner genom att orsaka dåsighet eller yrsel och orsaka organskador vid långvarig eller upprepad exponering.
  5. Rehydrera sektioner i en etanolgradient genom att placera glidhållaren sekventiellt i behållare fyllda med följande lösningar: 100% etanol, 2 min; 95% etanol, 2 min; 70% etanol, 2 min.
  6. Överför glidhållaren till behållaren fylld med destillerat vatten och skölj i rinnande destillerat vatten i 2 minuter.
  7. Placera glidhållaren i en behållare fylld med hematoxylinlösning och fläcka i 5 minuter (under den kemiska huven).
  8. Överför glidhållaren till behållaren fylld med kranvatten och skölj i rinnande kranvatten tills hematoxylinfärgningen blir blåaktig, vanligtvis efter 2 minuter.
  9. Överför glidhållaren till behållaren fylld med 5% (w/v) litiumkarbonatlösning. Doppa 10x.
    VARNING: Litiumkarbonat är ett potentiellt farligt ämne som orsakar akut toxicitet (GHS07) och en hälsofara (H302 - H319). Det är skadligt vid förtäring, skadligt vid hudkontakt och orsakar allvarlig ögonirritation.
  10. Överför glidhållaren till behållaren fylld med destillerat vatten och skölj i rinnande destillerat vatten i 2 minuter.
  11. Placera glidhållaren i en behållare fylld med eosin och fläck i 5 minuter.
  12. Överför glidhållaren till behållaren fylld med 70% etanol och skölj kort (10 s).
  13. Dehydrera sektionerna genom att placera glidhållaren sekventiellt i behållarna fyllda med etanolgradientlösningar: 95% etanol, 5 dips; 100% etanol, 5 dips.
  14. Rensa objektglasen genom att placera glidhållaren i behållaren fylld med 100% xylen i 3 minuter. Upprepa inkubation med färsk 100% xylen.
  15. Ta ut bilden ur stället, torka området runt vävnaderna med en pappershandduk och beroende på provets storlek, tillsätt en droppe eller två xylenbaserat monteringsmedium på provets yta. Montera genom att försiktigt placera ett täckglas ovanpå glasskivan (var försiktig så att du inte lämnar några luftbubblor). Tryck försiktigt om det behövs. Hela ytan på glaset ska täckas och förseglas.
  16. Torka glasen genom att lämna dem under den kemiska huven över natten. Vanligtvis stelnar monteringsmediet på mindre än 24 timmar. För att säkerställa att objektglasen är torra kan ett provglas göras. Använd en tom bild, placera en droppe av monteringsmediet och lämna under den kemiska huven över natten. Nästa dag, tryck på droppen och kontrollera om den stelnar.
  17. När glasen torkar ut, analysera vävnadens histologi med hjälp av ett ljusmikroskop eller ett mer avancerat mikroskop med en ljusfältkanal.
    1. Placera en mikroskopbild på scenen, flytta tills provet är i mitten av synfältet, justera fokus med fokusknappen och använd en 10x och / eller 20x förstoringsobjektiv för att analysera histologin i jämförelse med kontrollvävnader (bestrålad sken).
    2. Om mikroskopet är utrustat med en kamera, ta bilder också.
      OBS: Proceduren kan stoppas här; Objektglasen kan förvaras i rumstemperatur och analyseras senare. Håll inte bilderna längre än 30 dagar eftersom färgningen långsamt bleknar bort.

5. Färgning av immunofluorescens

  1. Kyl ner de histologiska kassetterna som innehåller paraffininbäddade vävnadsprover genom att lägga dem på is i minst 1 timme. Förbered 5 μm tjocka sektioner för färgning med hjälp av en mikrotom. Varje vävnad ska skivas horisontellt för att täcka hela det rullade provet.
    1. Efter att paraffinblocket har skurits, överför vävnadssektionerna till ett vattenbad som värmts till 45 °C och placera sektionerna på laddade objektglas. Lämna bilderna på ett galler över natten vid rumstemperatur för att torka.
      OBS: Proceduren kan stoppas här och bilderna kan förvaras vid rumstemperatur.
  2. Placera rutschkanorna i en glidhållare och grädda i en ugn på 65 °C över natten. Rutschkanorna kan gräddas en kortare tid, 1-2 h. Detta är dock inte tillrådligt när det gäller nyklippta (mindre än 1 månad sedan) snittbilder.
    OBS: Placera den manuella glidfärgningssatsen under den kemiska huven och utför inkubationerna med xylen, etanol ochH2O2/metanol under den kemiska huven.
  3. Nästa dag, kyl ner bilderna genom att placera dem i en glidhållare under den kemiska huven i 10 minuter.
  4. Avparaffinisera vävnaderna genom att placera glidhållaren i en behållare fylld med 100% xylen i 3 minuter. Upprepa inkubation med färsk 100% xylen.
    OBS: Från det ögonblicket, se till att proverna hålls våta hela tiden.
  5. Släck endogent peroxidas genom att inkubera objektglasen i 30 minuter i en behållare fylld med 2% väteperoxidlösning i metanol under den kemiska huven.
    VARNING: Metylalkohol är ett potentiellt farligt ämne: Hälsofara (H225-H301, H311, H331-H370), brandfarligt (GHS02) och orsakar akut toxicitet (oral, dermal, inandning) (GHS08). Väteperoxid är ett potentiellt farligt ämne: frätande (GHS05) och orsakar akut toxicitet (GHS07).
  6. Rehydrera sektionerna i en etanolgradient genom att placera glidhållaren sekventiellt i behållare fyllda med följande lösningar: 100% etanol, 3 min; 95% etanol, 3 min; 70% etanol, 3 min.
  7. Överför glidhållaren till en behållare fylld med destillerat vatten och skölj i rinnande destillerat vatten i 2 minuter.
  8. För att hämta antigenerna, överför glidhållaren till en behållare med 250 ml citratbuffertlösning (10 mM natriumcitrat, 0,05% Tween-20, pH 6,0) och koka vid 110 °C i 10 minuter med en decloaking kammare.
  9. Överför hela behållaren till kylrummet och låt gradvis svalna under 30 minuter.
  10. Efter 30 minuter, byt ut citratbuffertlösningen med destillerat vatten och skölj i rinnande destillerat vatten tills alla flytande paraffinbitar har tagits bort.
  11. Ta ut bilderna ur hållaren (en i taget), knacka på en pappershandduk och torka försiktigt området runt provet med en pappershandduk. Rita en sluten form runt provet med en penna som ger en hydrofob barriär (PAP-penna). Placera i en fuktad kammare.
  12. Blockera med 5 % bovint serumalbumin (BSA) i TBS-Tween genom att tillsätta 200 μl av lösningen på ytan av ett prov. Se till att det inte finns något läckage. Inkubera vid 37 °C i en fuktad kammare i 30 minuter.
  13. Ta bort blockeringslösningen genom att knacka på glasskivan på en pappershandduk. Lägg tillbaka i en fuktad kammare. Tillsätt 100 μl av lämplig koncentration av de primära antikropparna som återsuspenderats i en blockerande buffert och inkubera vid 4 °C med försiktig gungning över natten. För BMI1 / EYFP, använd kyckling anti-GFP (utspädning 1: 500); för Ki-67, använd kanin anti-Ki-67 (utspädning 1:200).
  14. Ta bort antikroppslösningen genom att knacka på glasskivan på en pappershandduk; placera objektglasen i en bildhållare och överför dem till behållaren som är fylld med TBS-Tween. Tvätta bilderna med skakning i 5 min. Upprepa 3x. Använd en ny del av TBS-Tween-bufferten varje gång.
  15. Ta ut glasen ur hållaren (en i taget), ta bort överflödig tvättlösning genom att knacka på glasskivan på en pappershandduk och placera i en fuktad kammare. Tillsätt 100 μl av lämplig koncentration av sekundära antikroppar som återsuspenderats i en blockerande buffert och inkubera vid 37 °C i 30 minuter. Sekundära antikroppar bör konjugeras med en fluorofor. För BMI1 / EYFP, använd åsna anti-kyckling Alexa Fluor 647 (utspädning 1: 500); för Ki-67, använd getantikanin Alexa Fluor 488 (utspädning 1:500).
  16. Ta bort antikroppslösningen genom att knacka på glasskivan på en pappershandduk; placera objektglasen i en bildhållare och överför dem till behållaren som är fylld med TBS-Tween. Tvätta bilderna med skakning i 5 min. Upprepa 3x. Använd en ny del av TBS-Tween-bufferten varje gång.
  17. Ta ut glasen ur hållaren (en i taget), ta bort överflödig tvättlösning genom att knacka på glasskivan på en pappershandduk och placera i en fuktad kammare. Tillsätt 100 μL av EdU-färgningslösningen beredd enligt tillverkarens instruktioner och använd Alexa Fluor 555 fluorofor.
  18. Ta bort EdU-lösningen genom att knacka på glasskivan på en pappershandduk; placera objektglasen i en bildhållare och överför dem till behållaren som är fylld med TBS-Tween. Tvätta bilderna med skakning i 5 min. Upprepa 2x. Använd en ny del av TBS-Tween-bufferten varje gång.
  19. Ta ut bilderna ur hållaren (en i taget); Ta bort överflödig tvättlösning genom att knacka på glasskivan på en pappershandduk och placera i en fuktad kammare. Utför motfärgning av Hoechst 33258 genom att tillsätta 100 μl Hoechst 33258-lösning (spädning 1:1000 i TBS-Tween) på provexemplarets yta. Inkubera i mörker vid rumstemperatur i 5 minuter.
  20. Ta bort Hoechst 33258-lösningen genom att knacka på glasskivan på en pappershandduk; placera objektglasen i en bildhållare och överför dem till en behållare fylld med TBS-Tween. Tvätta bilderna med skakning i 5 min.
  21. Ta ut bilden ur glidhållaren, torka området runt vävnaderna med en pappershandduk och beroende på provets storlek, tillsätt en droppe eller två vattenbaserat monteringsmedium på provets yta. Montera genom att försiktigt placera ett täckglas ovanpå glasskivan (var försiktig så att du inte lämnar några luftbubblor). Tryck försiktigt om det behövs. Hela ytan på glaset ska täckas och förseglas.
  22. Torka glasen genom att lämna dem i mörkret vid rumstemperatur över natten. Vanligtvis stelnar monteringsmediet på mindre än 24 timmar. För att säkerställa att objektglasen är torra kan ett provglas göras. Använd en tom bild; Placera en droppe av monteringsmediet och lämna under den kemiska huven över natten. Nästa dag, tryck på droppen och kontrollera om den stelnar.
  23. När objektglasen torkar ut kan färgade vävnader analyseras med hjälp av ett fluorescensmikroskop utrustat med emissionsvåglängdsfilter som möjliggör visualisering av Ki-67, EdU och BMI1 / EYFP-färgning (535 nm, 646 nm respektive 700 nm).
  24. Placera en mikroskopbild på scenen, flytta tills provet är i mitten av synfältet, justera fokus med fokusratten och använd 10x och / eller 20x förstoringsobjektivet för att analysera färgningen i jämförelse med kontrollvävnader (bestrålad sken). Om mikroskopet är utrustat med en kamera kan bilder också tas. Ta bilder för varje kanal separat och slå samman senare.
    OBS: Proceduren kan stoppas här; objektglasen kan förvaras vid 4 °C och analyseras senare. Håll inte bilderna längre än 14 dagar eftersom färgningen långsamt bleknar bort.

6. TUNEL färgning

  1. Kyl ner de histologiska kassetterna som innehåller paraffininbäddade vävnadsprover genom att lägga dem på is i minst 1 timme. Förbered 5 μm tjocka sektioner för färgning med hjälp av en mikrotom. Varje vävnad ska skivas horisontellt för att täcka hela det rullade provet.
    1. Efter att ha klippt paraffinblocket, överför vävnadssektionerna till ett vattenbad uppvärmt till 45 °C och placera sektionerna på laddade objektglas. Lämna bilderna på ett galler över natten vid rumstemperatur för att torka.
      OBS: Proceduren kan stoppas här och bilderna kan förvaras vid rumstemperatur.
  2. Placera rutschkanorna i en glidhållare och grädda i en ugn på 65 °C över natten.
    OBS: Bilderna kan bakas under en kortare tid, 1-2 timmar. Det är dock inte tillrådligt när det gäller nyklippta (mindre än 1 månad sedan) snitt. Placera den manuella glidfärgningssatsen under den kemiska huven och utför inkubationerna med xylen och etanol under den kemiska huven.
  3. Nästa dag, kyl ner bilderna genom att placera dem i en glidhållare under den kemiska huven i 10 minuter.
  4. Avparaffinisera vävnaderna genom att placera objektglashållaren i en behållare fylld med 100% xylen i 3 minuter. Upprepa inkubation med färsk 100% xylen.
    OBS: Från denna punkt, se till att proverna hålls våta hela tiden.
  5. Rehydrera sektionerna i en etanolgradient genom att placera glashållaren sekventiellt i behållare fyllda med följande lösningar: 100% etanol, 3 min; 95% etanol, 3 min; 90% etanol, 3 min; 80% etanol, 3 min; 70% etanol, 3 min.
  6. Överför glidhållaren till en behållare fylld med destillerat vatten och skölj i rinnande destillerat vatten i 1 min.
  7. Ta ut bilderna ur hållaren (en i taget), knacka på en pappershandduk och torka försiktigt området runt provet med en pappershandduk. Rita en sluten form runt provet med en penna som ger en hydrofob barriär (PAP-penna). Placera i en fuktad kammare.
  8. Inkubera med DNasfritt proteinas K. Tillsätt 100 μl DNasfritt proteinas K-lösning (spädning 1:25 i DPBS) på provets yta i den hydrofoba barriären. Inkubera vid rumstemperatur i en fuktad kammare i 15 minuter.
    VARNING: Proteinas K är ett potentiellt farligt ämne: Hälsofara (H315 - H319 - H334).
  9. Ta bort proteinas K-lösningen genom att knacka på glasskivan på en pappershandduk; placera bilderna i en bildhållare och överför till behållaren fylld med DPBS. Tvätta bilderna med skakning i 5 min. Upprepa 2x. Använd varje gång en ny del av DPBS.
  10. Bered TUNEL-reaktionsblandningen: Blanda etikettlösningen (1x) med enzymlösningen (10x). Pipett väl.
  11. Ta ut bilderna ur hållaren (en i taget); Ta bort överflödig tvättlösning genom att knacka på glasskivan på en pappershandduk och placera i en fuktad kammare. Tillsätt 50 μl TUNEL-reaktionsblandning på provets yta och inkubera i mörker vid 37 °C i en fuktad kammare i 60 minuter. För en negativ kontroll, använd endast etikettlösning (utan TdT).
  12. Ta bort TUNEL-lösningen genom att knacka på glasskivan på en pappershandduk; placera bilderna i en bildhållare och överför till en behållare fylld med DPBS. Tvätta bilderna med skakning i 5 min. Upprepa 2x. Använd varje gång en ny del av DPBS.
  13. Ta ut bilderna ur hållaren (en i taget); Ta bort överflödig tvättlösning genom att knacka på glasskivan på en pappershandduk och placera i en fuktad kammare. Utför motfärgning av Hoechst 33258 genom att tillsätta 100 μl Hoechst 33258-lösning (spädning 1:1000 i TBS-Tween) på provexemplarets yta. Inkubera i mörker vid rumstemperatur i 5 minuter.
  14. Ta bort Hoechst 33258-lösningen genom att knacka på glasskivan på en pappershandduk; placera bilderna i en bildhållare och överför till behållaren fylld med DPBS. Tvätta bilderna med skakning i 5 min.
  15. Ta ut bilden ur bildhållaren; Torka området runt vävnaderna med en pappershandduk, och beroende på provets storlek, tillsätt en droppe eller två vattenbaserade monteringsmedier på provets yta. Montera genom att försiktigt placera ett täckglas ovanpå glasskivan (var försiktig så att du inte lämnar några luftbubblor). Tryck försiktigt om det behövs. Hela ytan på glaset ska täckas och förseglas.
  16. Torka glasen genom att lämna dem i mörkret vid rumstemperatur över natten. Vanligtvis stelnar monteringsmediet på mindre än 24 timmar. För att säkerställa att objektglasen är torra kan ett provglas göras. Placera en droppe av monteringsmediet och låt stå i mörkret vid rumstemperatur över natten. Nästa dag, tryck på droppen och kontrollera om den stelnar.
  17. När objektglasen torkar ut kan färgade vävnader analyseras med hjälp av ett fluorescensmikroskop utrustat med emissionsvåglängdsfilter som möjliggör visualisering av TUNEL-färgning (535 nm).
  18. Placera en mikroskopbild på scenen, flytta tills provet är i mitten av synfältet, justera fokus med fokusknappen och använd en 10x och / eller 20x förstoringsobjektiv för att analysera färgningen i jämförelse med kontrollvävnader (bestrålad sken). Om mikroskopet är utrustat med en kamera kan bilder också tas. Ta bilder för varje kanal separat och slå samman senare.
    OBS: Proceduren kan stoppas här; Objektglas kan förvaras vid 4 °C och analyseras senare. Håll inte bilderna längre än 14 dagar eftersom färgningen långsamt bleknar bort.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Användningen av 12 Gy totalkroppsbestrålning (TBI) i kombination med murin genetisk härstamningsspårning möjliggör en grundlig analys av konsekvenserna av strålskador i tarmen. För att starta, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-möss fick en enda tamoxifeninjektion, vilket inducerar förbättrat gulfluorescerande protein (EYFP) uttryck inom en Bmi1 + reservstamcellspopulation. Två dagar efter tamoxifeninjektionen genomgick mössen bestrålning eller skenbestrålning. Tre timmar före dödshjälp injicerades mössen med EdU. Efter dödshjälp samlades tunntarmsprover in för analys vid 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h och 7 dagar efter bestrålning. Representativa hematoxylin- och eosinbilder (H&E) (figur 1) från ovannämnda tidsförlopp illustrerar tarmepitelets svar på skada. Tidpunkten 0 h illustrerar homeostatiskt tarmepitel (figur 1); detta följs av den apoptotiska fasen - kännetecknad av en förlust av celler i kryptfack mellan 3 timmar och 48 timmar (figur 1). Sedan följer den regenerativa fasen, där mycket proliferativa celler kan hittas som befolkar krypterna mellan 72 timmar och 96 timmar (figur 1). Slutligen leder detta till normaliseringsfasen, här representerad av 7-dagarspunkten (figur 1).

Figur 2 illustrerar förändringar i proliferativ status hos intestinala kryptceller bedömda genom immunofluorescerande färgning av EdU (markör för celler i S-fas) och Ki-67 (markör för celler i G1-, S- och G2/M-faser), medan härstamningsspårning (EYFP+-celler) markerar celler som härrör från Bmi1+-reservstamceller. Under homeostas (figur 2, 0 h sham) är de Bmi1+-positiva cellerna markerade med uttrycket av EYFP begränsade till +4-+6-positionen i krypter. Under den apoptotiska fasen (24 timmar och 48 timmar) minskar antalet EYFP-positiva celler (figur 2). Den regenerativa fasen (72 h och 96 h) kännetecknas av snabbt prolifererande Bmi1+-positiva celler och deras förfäder (figur 2); Vid 7 dagar efter bestrålning har ytterligare spridning och migration fyllt på tarmkryptcellerna och återställt tarmepitelintegriteten (figur 2).

Hos skambestrålade möss (kontroll) fläckar EdU och Ki-67 EYFP-negativa proliferativa celler i tarmkrypterna, typiska för normal tarmhomeostas, som sträcker sig från aktiva stamceller genom transitförstärkande zonen (figur 2). Strålningsskador orsakar förlust av mycket proliferativa celler under den apoptotiska fasen, vilket framgår av minskningen av EdU- och Ki-67-färgning (figur 2). Aktiveringen av reservstamceller (i detta exempel EYFP-märkta Bmi1+ -positiva celler) och deras proliferation resulterar i en ökning av EdU- och Ki-67-positiva celler som är tydligt synliga vid 72 timmar och 96 timmar efter skada, där krypter nästan uteslutande består av celler som är samfärgade med EYFP, EdU och Ki-67. De observerade nivåerna av proliferation normaliseras 7 dagar efter skada (figur 2).

För att illustrera apoptos orsakad av strålskador utfördes TUNEL-färgning och representativa bilder ingår i figur 3. Under homeostas (figur 3) genomgår få celler apoptos, typiskt för den normalt snabba tarmepitelomsättningen. En tydlig ökning av TUNEL-färgning kan observeras sent i den apoptotiska fasen (24 timmar och 48 timmar) efter bestrålning (figur 3). Under den regenerativa fasen minskar TUNEL-färgningen stadigt i de regenererande krypterna och är återigen nästan frånvarande när krypterna har normaliserats (figur 3). Det presenterade protokollet beskriver en enkel och lättillgänglig immunofluorescerande färgningsmetod som använder en enkel och allmänt använd kombination av märkningstekniker (TUNEL, EdU, Ki-67, EYFP) som kan ge insikter i tarmcellernas beteende efter skada (här bestrålning). Detta tillvägagångssätt kan användas för att studera mekanismerna som reglerar regenerativa processer i tarmepitelet under specifika omständigheter. Att använda detta och liknande tillvägagångssätt kommer att belysa alternativa regenerativa processer efter olika tarmförolämpningar och vidare möjliggöra undersökning av terapeutiska strategier för förebyggande av förlust av barriärfunktion.

Figure 1
Figur 1: Representativa bilder av hematoxylin och eosin (H&E)-färgade sektioner av tunntarmsvävnader efter ett tidsförlopp efter bestrålning av hela kroppen. Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-möss fick en dos tamoxifen 2 dagar före 12 Gy bestrålning av hela kroppen eller skenbestrålning. Möss offrades och tunntarmsvävnader samlades vid tidpunkter som anges i figuren. Alla bilder togs med 10x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Representativa bilder av immunofluorescerande färgning av tunntarmssnitt efter bestrålning. Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-möss fick en dos tamoxifen 2 dagar före 12 Gy bestrålning av hela kroppen eller skenbestrålning. Möss offrades och tunntarmsvävnader samlades vid tidpunkter som anges i figuren. Vävnadssnitt färgades med EdU för att markera celler i S-fas (rosa) och med Ki-67 för att markera celler i G0-, S- och G2/M-faser (gul). EYFP (grön) markerar Bmi1+ -celler och deras förfäder och demonstrerar härstamningsspårning. Sektionerna motfärgades ytterligare med DAPI (blå) för att visualisera kärnor. Data visas som sammanslagna bilder vid 10x förstoring och infällningar av enskilda fläckar vid 20x förstoring (dessa härstammar från 10x bilder). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Representativa bilder av immunofluorescerande TUNEL-färgning av tunntarmssnitt vid bestrålning. Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-möss fick en dos tamoxifen 2 dagar före 12 Gy bestrålning av hela kroppen eller skenbestrålning. Möss offrades och tunntarmsvävnader samlades vid tidpunkter som anges i figuren. TUNEL (röd) fläckar apoptotiska celler. Dessa bilder motfärgades med DAPI (blå) för att visualisera kärnor. Bilderna som visades togs med 20x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll beskriver en robust och reproducerbar strålskademodell. Det möjliggör en exakt analys av förändringarna i tarmepitelet under 7 dagar efter skada. Det är viktigt att de valda tidpunkterna återspeglar avgörande stadier av skada och kännetecknas av tydliga förändringar i tarmen (skada, apoptos, regenerering och normaliseringsfaser)60. Denna bestrålningsmodell har fastställts och noggrant utvärderats, vilket visar en lämplig manifestation av skada för att efterlikna den som upplevs av patienter som genomgår strålbehandling61. Mer än hälften av patienterna med kolorektal cancer och gynekologisk cancer genomgår strålbehandling i buken 40,62,63. Trots avancerade metoder för målinriktad strålbehandling upplever patienterna bestrålning av frisk tarmvävnad, vilket ger patofysiologi som är mycket lik den som observerats med den totala kroppsbestrålningsmodellen som presenteras här. Därför kan den strålningsmodell som beskrivs här potentiellt hantera konsekvenserna av oavsiktlig strålningsexponering av patienter och / eller medicinsk personal och är därför avgörande för människors hälsa.

Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-mössmodellen bär tamoxifeninducerbar Cre under transkriptionskontroll av musen Bmi1 (Bmi1 polycomb ring finger oncogene) promotor. Dessutom bär dessa möss en R26-stop-EYFP-sekvens, där STOP-kodonet flankeras av loxP-sidor följt av Enhanced Yellow Fluorescent Protein-genen (EYFP) införd i Gt (ROSA) 26Sor-locus. Uttrycket av EYFP blockeras av en uppströms loxP-flankerad STOP-sekvens men kan aktiveras av tamoxifeninducerade, Cre-medierade riktade deletioner, vilket möjliggör härstamningsspårning av Bmi1-uttryckande celler, en reservstamcellsspecifik subpopulation av kryptceller. Strålningsprotokollet i kombination med Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-mössmodell har tidigare använts för att studera transkriptionsfaktorernas roll vid reglering av tarmregenerering18,56. De representativa resultaten som presenteras i figur 1 till figur 3 visar resultat som liknar dem som presenteras i de senaste publikationerna18,56.

Notera, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-möss är bara en av flera transgena djurmodeller som används för att studera tarmregenerering. Andra murina härstamningsspårningsmodeller har kombinerats med strålning för att visa rollerna för specifika celler och vägar i tarmepitelets regenerativa kapacitet 18,26,32,33,34,35,36,37,56,64,65,66,67 . Dessa modeller är utformade för att undersöka rollen för olika populationer av reserverade stamceller, utforska prekursorerna till sekretoriska och enterocytlinjer och studera funktionen av specifika gener inom varje subpopulation av tarmepitelcellerna. Kombinerade resultat från dessa undersökningar kommer att bidra till att utöka förståelsen för tarmepitelets regenerativa förmåga.

Viktigt, med mindre modifieringar, bör denna teknik möjliggöra undersökning av relationerna mellan mikrobiota och olika epitelial-, stromal- och immuncellpopulationer vid strålskada. Att introducera distinkta härstamningsspårande djurmodeller gör det möjligt att studera realtidsbeteende och interaktionen mellan olika subpopulationer av celler efter skada. Alternativt kan färgning av vävnader ersättas med RNA-sekvensering, encells-RNA-sekvensering, fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) eller proteomisk analys för att få mer djupgående kunskap om rollen av specifika cellinjer under tarmregenerering efter skada68,69. Denna skademodell kan användas för att testa nya behandlingsmetoder avsedda att minimera biverkningarna av bestrålning, förkorta återhämtningstiden och förbättra kvaliteten på patientvården70. Även om strålningsmodellen som beskrivs här kan fungera som ett användbart verktyg för att studera regenerering av tarmepitelet, har den också flera begränsningar. Totalkroppsstrålningsdosen resulterar alltid i efterföljande hematopoetiskt syndrom, vilket hindrar undersökningen av tarmregenerering. Detta kan avvärjas genom benmärgstransplantation. Vidare kan modifieringen av ett protokoll för enbart bukskada potentiellt förbättra några av biverkningarna av bestrålningen71. Denna modell kräver dock ytterligare steg som kan påverka tarmsvaret på skadan (t.ex. anestesi). För övrigt producerar bukstrålning strålningsinducerat gastrointestinalt syndrom (RIGS) utan hematopoetiskt syndrom, som skiljer sig från helkroppsbestrålning (WBI), genom att WBI producerar liknande GI-symptomologi men inkluderar partiell förlust av hematopoetisk funktion efter skada71,72.

Observera att genetiskt modifierade djurmodeller som de som beskrivs i detta protokoll är sofistikerade och möjliggör härstamningsspårning av specifika celler. Dessa modeller, även om de är mycket fördelaktiga, kräver dock ytterligare ansträngningar för att underhålla. Transgena djurmodeller som möjliggör villkorliga gendeletioner är svåra att generera, och deras tidiga radering vid skada kanske inte lätt kan uppnås. Dessutom tillåter de flesta transgena modeller endast en villkorlig deletion eller inaktivering av en gen av intresse men är inte inducerbara och kan därför inte återställa genfunktionen och kan hindra studierna. Dessutom kräver transgena djurmodeller vanligtvis behandling med ytterligare kemikalier (t.ex. tamoxifen, doxycyklin) för att uppnå inaktivering eller överuttryck av genen av intresse. Behandlingar med dessa substanser kan till viss del förändra svaret i tarmepitelet eller öka skadans svårighetsgrad 73,74,75,76. Dessutom kan induktionen av härstamningsspårning med tamoxifen införas närmare tidpunkten för strålningsskada för att förbättra märkningen av cellerna som är involverade i regenerering (t.ex. 6-24 timmar före skada). Således är det möjligt att ersätta en transgen modell med vildtypsmöss och en kombination av IF-färgning (t.ex. Ki-67, PCNA, EdU, TUNEL, Caspase 3). Denna modell möjliggör analys av tarmens regenerativa kapacitet, även om den inte tillåter studier av en specifik subpopulation av cellerna.

Protokollet som beskrivs i detta manuskript har flera viktiga steg. Det är av yttersta vikt att se till att friska möss används för experiment, eftersom de kommer att utsättas för strålning och behandling med kemikalier. Om experiment med olika mössgrupper utförs dagar, veckor eller månader från varandra är det bra att följa samma tidslinje, t.ex. tamoxifeninjektioner vid samma tidpunkt på dagen. Bestrålningsprocessen bör göras omedelbart och möss ska omedelbart återföras till sina ursprungliga burar. Dessutom kan mjukad mat och mycket vatten bidra till att förbättra några av de negativa effekterna av strålning. Swiss-roll-tekniken föreslås för att möjliggöra omfattande analys av tarmvävnaden59. Denna teknik är inte trivial, och tidigare försök bör göras för att säkerställa att oklanderlig kvalitet på vävnaden för färgning uppnås. Alla lösningar för möss, experiment och färgning bör beredas färskt och förvaras under lämpliga förhållanden. När man arbetar med antikroppar är det viktigt att testa glas med positiva och negativa kontroller och om möjligt använda antikroppar med samma katalognummer och partinummer. Immunofluorescensglas ska förvaras vid 4 °C och avbildas inom 1 vecka efter beredning. Långvarig lagring, även vid −20 °C, kan leda till signalförlust. H&E-glas kan förvaras vid rumstemperatur eftersom det inte finns någon oro för förlust av fluoroforstabilitet.

Sammanfattningsvis är den härstamningsspårande strålningsskademodellen som presenteras här en reproducerbar och relevant modell för att spåra tarmcellernas öde efter förolämpning och kan kombineras med olika murina modeller och molekylära tekniker för att förbättra förståelsen av tarmepitelets patofysiologi. Insikt i de molekylära och cellulära mekanismerna som styr tarmepitelregenerering kan leda till utveckling av nya behandlingar och fördelaktiga terapeutiska ingrepp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna vill erkänna Stony Brook Cancer Center Histology Research Core för experthjälp med beredning av vävnadsprover och avdelningen för laboratoriedjurresurser vid Stony Brook University för hjälp med djurvård och hantering. Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health DK124342 som tilldelades Agnieszka B. Bialkowska och DK052230 till Dr. Vincent W. Yang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659 -
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight VWR 20068-630 -
27G x 1/2" needle BD 305109 -
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe Covidien 1188128012 -
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) Santa Cruz Biotechnology sc284628A 10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific 22-026-213 -
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J The Jackson Laboratory Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J The Jackson Laboratory Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock Millipore-Sigma 3116956001
Chicken anti-GFP Aves GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen Thermo Fisher Scientific C10638 -
Corn oil Millipore-Sigma C8267 -
Decloaking Chamber Biocare Medical DC2012 -
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100 light sensitive
DNase-free proteinase K Invitrogen C10618H diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647 Jackson ImmunoResearch 703-605-155
DPBS Fisher Scientific 21-031-CV -
Eosin Fisher Scientific S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Millipore-Sigma F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor Best Theratronics Ltd. - 0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488 Jackson ImmunoResearch 111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3 Millipore-Sigma GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific Fisher Scientific 23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) Thermo Fisher Scientific H3569 dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical Fisher Scientific 18-603-252 -
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) Millipore-Sigma 11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini Fisher Scientific DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific L119-500 0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL VWR 89215-218 -
Methanol VWR BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF Fisher Scientific NC1675398 -
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade Capitol Scientific AAP-281000ACSCSLT -
Rabbit anti-Ki67 BioCare Medical CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium Fisher Scientific 22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree Fisher Scientific 50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate Fisher Scientific S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit VWR 25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm] VWR  48311-703
Tamoxifen Millipore-Sigma T5648 30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle Sakura 4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades Sakura 4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura 4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid Sakura 4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid Sakura 4457
Tween 20 Millipore-Sigma P7949
Unisette Processing Cassettes VWR 87002-292 -
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-081
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
  2. vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
  3. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 466-471 (2012).
  6. Liao, Z., Hu, C., Gao, Y. Mechanisms modulating the activities of intestinal stem cells upon radiation or chemical agent exposure. Journal of Radiation Research. 63 (2), 149-157 (2022).
  7. Meyer, A. R., Brown, M. E., McGrath, P. S., Dempsey, P. J. Injury-Induced Cellular Plasticity Drives Intestinal Regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (3), 843-856 (2022).
  8. Owens, B. M., Simmons, A. Intestinal stromal cells in mucosal immunity and homeostasis. Mucosal Immunology. 6 (2), 224-234 (2013).
  9. Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
  10. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. The American Journal of Anatomy. 141 (4), 537-561 (1974).
  11. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nature Medicine. 27 (1), 45-48 (2021).
  12. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  13. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  14. Tirado, F. R., et al. Radiation-induced toxicity in rectal epithelial stem cell contributes to acute radiation injury in rectum. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 63 (2021).
  15. Tetteh, P. W., Farin, H. F., Clevers, H. Plasticity within stem cell hierarchies in mammalian epithelia. Trends in Cell Biology. 25 (2), 100-108 (2015).
  16. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  17. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 179-184 (2011).
  18. Orzechowska, E. J., Katano, T., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Interplay among p21(Waf1/Cip1), MUSASHI-1 and Kruppel-like factor 4 in activation of Bmi1-Cre(ER) reserve intestinal stem cells after gamma radiation-induced injury. Scientific Reports. 10 (1), 18300 (2020).
  19. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  20. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nature Cell Biology. 14 (4), 401-408 (2012).
  21. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  22. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  23. Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
  24. Castillo-Azofeifa, D., et al. Atoh1(+) secretory progenitors possess renewal capacity independent of Lgr5(+) cells during colonic regeneration. The EMBO Journal. 38 (4), 99984 (2019).
  25. Van Landeghem, L., et al. Activation of two distinct Sox9-EGFP-expressing intestinal stem cell populations during crypt regeneration after irradiation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (10), 1111-1132 (2012).
  26. Roche, K. C., et al. SOX9 maintains reserve stem cells and preserves radioresistance in mouse small intestine. Gastroenterology. 149 (6), 1553-1563 (2015).
  27. Barriga, F. M., et al. Mex3a marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  28. May, R., et al. Brief report: Dclk1 deletion in tuft cells results in impaired epithelial repair after radiation injury. Stem Cells. 32 (3), 822-827 (2014).
  29. Tetteh, P. W., et al. Replacement of lost Lgr5-positive stem cells through plasticity of their enterocyte-lineage daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
  30. Bohin, N., et al. Rapid crypt cell remodeling regenerates the intestinal stem cell niche after Notch inhibition. Stem Cell Reports. 15 (1), 156-170 (2020).
  31. Li, N., et al. Single-cell analysis of proxy reporter allele-marked epithelial cells establishes intestinal stem cell hierarchy. Stem Cell Reports. 3 (5), 876-891 (2014).
  32. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  33. Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (23), 8965-8970 (2012).
  34. Hayakawa, Y., et al. BHLHA15-positive secretory precursor cells can give rise to tumors in intestine and colon in mice. Gastroenterology. 156 (4), 1066-1081 (2019).
  35. Yan, K. S., et al. Intestinal enteroendocrine lineage cells possess homeostatic and injury-inducible stem cell activity. Cell Stem Cell. 21 (1), 78-90 (2017).
  36. Chandrakesan, P., et al. Intestinal tuft cells regulate the ATM mediated DNA damage response via Dclk1 dependent mechanism for crypt restitution following radiation injury. Scientific Reports. 6, 37667 (2016).
  37. Yu, S., et al. Paneth cell multipotency induced by Notch activation following Injury. Cell Stem Cell. 23 (1), 46-59 (2018).
  38. Moussa, L., et al. Bowel radiation injury: Complexity of the pathophysiology and promises of cell and tissue engineering. Cell Transplantation. 25 (10), 1723-1746 (2016).
  39. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
  40. Tam, S. Y., Wu, V. W. C. A review on the special radiotherapy techniques of colorectal cancer. Frontiers in Oncology. 9, 208 (2019).
  41. Shadad, A. K., Sullivan, F. J., Martin, J. D., Egan, L. J. Gastrointestinal radiation injury: Symptoms, risk factors and mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 19 (2), 185-198 (2013).
  42. Serrano Martinez, P., Giuranno, L., Vooijs, M., Coppes, R. P. The radiation-induced regenerative response of adult tissue-specific stem cells: Models and signaling pathways. Cancers. 13 (4), 855 (2021).
  43. Stacey, R., Green, J. T. Radiation-induced small bowel disease: Latest developments and clinical guidance. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 5 (1), 15-29 (2014).
  44. Pan, Y. B., Maeda, Y., Wilson, A., Glynne-Jones, R., Vaizey, C. J. Late gastrointestinal toxicity after radiotherapy for anal cancer: A systematic literature review. Acta Oncologica. 57 (11), 1427-1437 (2018).
  45. Elhammali, A., et al. Late gastrointestinal tissue effects after hypofractionated radiation therapy of the pancreas. Radiation Oncology. 10, 186 (2015).
  46. You, S. H., Cho, M. Y., Sohn, J. H., Lee, C. G. Pancreatic radiation effect in apoptosis-related rectal radiation toxicity. Journal of Radiation Research. 59 (5), 529-540 (2018).
  47. Jiminez, J. A., Uwiera, T. C., Douglas Inglis, G., Uwiera, R. R. Animal models to study acute and chronic intestinal inflammation in mammals. Gut Pathogens. 7, 29 (2015).
  48. Snider, A. J., et al. Murine model for colitis-associated cancer of the colon. Methods in Molecular Biology. 1438, 245-254 (2016).
  49. Clapper, M. L., Cooper, H. S., Chang, W. C. Dextran sulfate sodium-induced colitis-associated neoplasia: A promising model for the development of chemopreventive interventions. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (9), 1450-1459 (2007).
  50. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  51. Fujimichi, Y., Otsuka, K., Tomita, M., Iwasaki, T. Ionizing radiation alters organoid forming potential and replenishment rate in a dose/dose-rate dependent manner. Journal of Radiation Research. 63 (2), 166-173 (2022).
  52. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4alpha as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  53. Nagle, P. W., Coppes, R. P. Current and future perspectives of the use of organoids in radiobiology. Cells. 9 (12), 2649 (2020).
  54. Taelman, J., Diaz, M., Guiu, J. Human Intestinal Organoids: Promise and Challenge. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854740 (2022).
  55. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
  56. Kuruvilla, J. G., et al. Kruppel-like factor 4 modulates development of BMI1(+) intestinal stem cell-derived lineage following gamma-radiation-induced gut injury in mice. Stem Cell Reports. 6 (6), 815-824 (2016).
  57. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nature Genetics. 40 (7), 915-920 (2008).
  58. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
  59. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  60. Booth, C., Tudor, G., Tudor, J., Katz, B. P., MacVittie, T. J. Acute gastrointestinal syndrome in high-dose irradiated mice. Health Physics. 103 (4), 383-399 (2012).
  61. Lu, L., Jiang, M., Zhu, C., He, J., Fan, S. Amelioration of whole abdominal irradiation-induced intestinal injury in mice with 3,3'-Diindolylmethane (DIM). Free Radical Biology & Medicine. 130, 244-255 (2019).
  62. Karlsson, J. A., Andersen, B. L. Radiation therapy and psychological distress in gynecologic oncology patients: Outcomes and recommendations for enhancing adjustment. Journal of Psychosomatic Obstetrics & Gynecology. 5 (4), 283-294 (1986).
  63. Yang, J., Cai, H., Xiao, Z. X., Wang, H., Yang, P. Effect of radiotherapy on the survival of cervical cancer patients: An analysis based on SEER database. Medicine. 98 (30), 16421 (2019).
  64. Giroux, V., et al. Mouse intestinal Krt15+ crypt cells are radio-resistant and tumor initiating. Stem Cell Reports. 10 (6), 1947-1958 (2018).
  65. Kim, C. K., et al. Kruppel-like factor 5 regulates stemness, lineage specification, and regeneration of intestinal epithelial stem cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 587-609 (2020).
  66. Sheng, X., et al. Cycling stem cells are radioresistant and regenerate the intestine. Cell Reports. 32 (4), 107952 (2020).
  67. Gross, S., et al. Nkx2.2 is expressed in a subset of enteroendocrine cells with expanded lineage potential. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (12), 975-987 (2015).
  68. Sato, T., et al. Characterization of radioresistant epithelial stem cell heterogeneity in the damaged mouse intestine. Scientific Reports. 10 (1), 8308 (2020).
  69. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7 (6), 38965 (2012).
  70. Bohin, N., et al. Insulin-like growth factor-1 and mTORC1 signaling promote the intestinal regenerative response after irradiation injury. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 797-810 (2020).
  71. Romesser, P. B., et al. Preclinical murine platform to evaluate therapeutic countermeasures against radiation-induced gastrointestinal syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (41), 20672-20678 (2019).
  72. Gu, J., et al. At what dose can total body and whole abdominal irradiation cause lethal intestinal injury among C57BL/6J mice. Dose Response. 18 (3), 1559325820956783 (2020).
  73. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
  74. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 365-367 (2019).
  75. Bohin, N., Carlson, E. A., Samuelson, L. C. Genome toxicity and impaired stem cell function after conditional activation of CreER(T2) in the intestine. Stem Cell Reports. 11 (6), 1337-1346 (2018).
  76. Boynton, F. D. D., Ericsson, A. C., Uchihashi, M., Dunbar, M. L., Wilkinson, J. E. Doxycycline induces dysbiosis in female C57BL/6NCrl mice. BMC Research Notes. 10 (1), 644 (2017).

Tags

Biologi nummer 185
Intestinal epitelregenerering som svar på joniserande bestrålning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Orzechowska-Licari, E. J., LaComb,… More

Orzechowska-Licari, E. J., LaComb, J. F., Giarrizzo, M., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation. J. Vis. Exp. (185), e64028, doi:10.3791/64028 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter