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Immunology and Infection

Metodi di coltivazione delle spirochete di Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex e febbre recidivante Borrelia

Published: November 25, 2022 doi: 10.3791/64431
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 1, 2, 3
1Department of Biology, Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology, Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences, Institute of Parasitology
* These authors contributed equally

Summary

La coltura in vitro è un metodo di rilevamento diretto per la presenza di batteri viventi. Questo protocollo descrive i metodi per la coltura di diverse spirochete Borrelia, comprese quelle del complesso Borrelia burgdorferi sensu lato, della febbre recidivante delle specie Borrelia e della Borrelia miyamotoi. Queste specie sono esigenti e a crescita lenta, ma possono essere coltivate.

Abstract

La Borrelia è costituita da tre gruppi di specie, quelle del gruppo Borreliosi di Lyme (LB), noto anche come B. burgdorferi sensu lato (s.l.) e recentemente riclassificato in Borreliella, il gruppo della febbre recidivante (RF) Borrelia e un terzo gruppo di spirochete associate ai rettili. I metodi basati sulla coltura rimangono il gold standard per il rilevamento in laboratorio di infezioni batteriche sia per la ricerca che per il lavoro clinico, poiché la coltura di agenti patogeni da fluidi corporei o tessuti rileva direttamente agenti patogeni replicanti e fornisce materiale di partenza per la ricerca. Le spirochete Borrelia e Borreliella sono fastidiose e a crescita lenta, e quindi non sono comunemente coltivate per scopi clinici; Tuttavia, la cultura è necessaria per la ricerca. Questo protocollo dimostra la metodologia e le ricette necessarie per coltivare con successo spirochete LB e RF, comprese tutte le specie riconosciute del complesso B. burgdorferi s.l. tra cui B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis espirochete RF, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis e B. miyamotoi. Il terreno di base per la coltivazione di spirochete LB e RF è il mezzo Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II o BSK-H), che supporta in modo affidabile la crescita delle spirochete nelle culture consolidate. Per essere in grado di coltivare isolati di Borrelia appena isolati da campioni derivati da zecche o ospiti in cui il numero iniziale di spirochete è basso nell'inoculo, è preferibile il mezzo Kelly-Pettenkofer (MKP) modificato. Questo mezzo supporta anche la crescita di B. miyamotoi. Il successo della coltivazione delle spirochete RF dipende anche in modo critico dalla qualità degli ingredienti.

Introduction

Borrelia è un genere di batteri spirocheta che comprende tre cladi principali: il gruppo della borreliosi di Lyme (LB), il gruppo della febbre recidivante (RF) e un gruppo meno ben caratterizzato apparentemente limitato ai rettili. La tassonomia di Borrelia è in continua evoluzione con l'avvento di metodologie molecolari che consentono confronti tra genoma e proteoma, come è vero per la maggior parte degli altri gruppi tassonomici 1,2,3,4,5,6,7. Il gruppo LB (chiamato anche gruppo della malattia di Lyme) è stato tradizionalmente definito Borrelia burgdorferi sensu lato dopo il suo membro meglio caratterizzato Borrelia burgdorferi sensu stricto.  Questo articolo utilizza la terminologia attualmente più diffusa: LB, RF e gruppo associato ai rettili e descrive i protocolli di coltura per i gruppi LB e RF.

Come ci si aspetterebbe per un membro della famiglia delle Spirochaetaceae, Borrelia può adottare la caratteristica forma a spirale lunga e sottile, tipicamente lunga 20-30 μm e larga 0,2-0,3 μm. Tuttavia, le cellule di Borrelia sono altamente pleomorfe e possono assumere molte altre forme sia in coltura che in vivo 1,8 come risultato della loro complessa struttura cellulare e genetica. Nella sua forma spirochetale, la morfologia dell'onda sinusoidale planare risulta dai suoi endoflagelli assiali che ruotano nello spazio periplasmatico tra le membrane interne ed esterne. Questa struttura consente alle cellule di essere altamente mobili, con la membrana esterna contenente proteine che consentono alla cellula di interagire con i tessuti ospiti 9,10. L'espressione delle proteine della membrana esterna è strettamente regolata e influenza non solo l'invasione del tessuto ospite, ma anche l'interazione con il sistema immunitario dell'ospite11. Questa complessa espressione genica consente alle cellule Borrelia di fare la spola tra ambienti molto diversi di ospiti vertebrati e vettori invertebrati. Il genoma di Borrelia è insolito tra i procarioti, costituito da un cromosoma lineare piuttosto che circolare. Oltre al cromosoma lineare, le specie Borrelia contengono 7-21 plasmidi, alcuni lineari e alcuni circolari. I plasmidi ospitano la maggior parte dei geni necessari per l'adattamento e la virulenza dell'ospite, e si ritiene che i plasmidi circolari derivati dai profagi siano responsabili della maggior parte del flusso genico orizzontale tra le cellule spirochetali12,13. Coerentemente con un ruolo nell'adattamento dell'ospite, alcuni, forse molti o tutti, i membri del gruppo della borreliosi di Lyme perdono plasmidi nella cultura14. Il ceppo "adattato in laboratorio" meglio studiato di B. burgdorferi, B31, ha solo sette dei nove plasmidi trovati negli isolati selvatici di questa specie15. Allo stesso modo, B. garinii perde plasmidi in coltura16. Alcuni studi hanno dimostrato che le specie RF e B. miyamotoi conservano plasmidi quando coltivati14,17, ma recenti lavori dimostrano plasmidi alterati e infettività con la coltivazione in vitro a lungo termine 18.

I metodi basati sulla coltura rimangono il gold standard per la rilevazione di laboratorio delle infezioni batteriche, sia per la ricerca che per il lavoro clinico14,17. La coltura di agenti patogeni provenienti da fluidi corporei o tessuti rileva direttamente agenti patogeni replicanti e fornisce materiale di partenza per la ricerca14,17. Questo protocollo dimostra la metodologia e le ricette necessarie per coltivare con successo le spirochete del gruppo LB, nonché RF Borrelia e B. miyamotoi. Il terreno di base per la coltivazione delle spirochete Borrelia è il terreno di Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II o BSK-H disponibile in commercio), con o senza antibiotici per ridurre la crescita dei procarioti contaminanti. Questo mezzo è stato adattato da un mezzo originariamente utilizzato per supportare RF Borrelia19, ulteriormente modificato da Stoenner20 e poi da Barbour21. Da allora sono state sviluppate molte modifiche, ognuna con effetti sulla fisiologia batterica che possono influenzare la crescita, l'infettività e la patogenicità22. Questo mezzo supporta in modo affidabile la crescita delle spirochete nelle colture consolidate ed è stato utilizzato per isolare le spirochete da zecche, mammiferi e campioni clinici23. La variante più recente sviluppata, il terreno Kelly-Pettenkofer (MKP) modificato, può fornire un migliore successo di isolamento, morfologia e motilità quando si isolano nuovi isolati di Borrelia da campioni ambientali, quando il numero di spirochete presenti nel campione disponibile per seminare la coltura è basso23,24. In tutti i casi, il successo della coltivazione dipende in modo critico dal mezzo appena preparato e dall'uso di ingredienti appropriati; Non tutti gli ingredienti commerciali producono un mezzo di alta qualità. Le colture inoculate possono essere comodamente incubate senza agitazione in un incubatore convenzionale a 32-34 °C in presenza di una piccola quantità di ossigeno ambientale residuo. Le spirochete Borrelia sono anaerobe ma sono esposte in natura alle fluttuazioni delle concentrazioni di ossigeno e anidride carbonica e rispondono con cambiamenti nell'espressione genica26,27,28,29. Pertanto, l'espressione genica, la crescita e altri studi metabolici dovrebbero controllare i livelli di ossigeno e anidride carbonica con l'uso di un incubatore controllato dall'ossigeno o di una camera anaerobica. In coltura, le colture vengono controllate settimanalmente, o più spesso, per la presenza di spirochete con microscopia in campo oscuro o microscopia a contrasto di fase. Gli strisci di coltura possono essere colorati con macchie d'argento, immunoistochimica o attraverso l'uso di ceppi marcati con fluorescenza29,30. La PCR seguita dal sequenziamento del DNA è un metodo sensibile e specifico per rilevare e identificare geneticamente o confermare la specie Borrelia 30,31,32,33.

Esistono molte varianti minori del BSK-II, e alcune sono disponibili in commercio. Il protocollo descritto qui nella sezione 1 è stato adattato da Barbour (1984)21. Il mezzo liquido MKP è un mezzo sviluppato più di recente ed è descritto nella sezione 2. Viene preparato secondo un protocollo33,34 precedentemente riportato, che, analogamente al mezzo BSK, consiste in due fasi: preparazione del mezzo di base e preparazione del mezzo completo. Il terreno di coltura Borrelia può essere preparato con o senza antibiotici, come descritto nel paragrafo 3; gli antibiotici agiscono per ridurre i batteri contaminanti introdotti durante l'inoculazione con campioni clinici o ambientali, come descritto nella sezione 4; se inoculati con coltura pura di Borrelia sp., gli antibiotici potrebbero non essere necessari. La produzione di scorte di Borrelia a lungo termine è spesso importante e un protocollo per farlo è descritto nella sezione 5. La sezione 6 descrive l'uso di questi mezzi per isolare cloni puri di Borrelia sensu lato da campioni clinici o ambientali. Ci sono un certo numero di approcci possibili36; Di seguito è riportato uno trovato efficace. Il mezzo di placcatura utilizzato in questo protocollo è una modifica del mezzo di placcatura BSK-II37 e del mezzo MKP 34 (con siero di coniglio aumentato al 10%38).

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Protocol

Tutti gli studi che coinvolgono campioni ottenuti da soggetti umani sono stati approvati dall'Institutional Review Board dell'Università e / o della struttura medica pertinente e il consenso informato scritto è stato ottenuto dai partecipanti prima che i campioni fossero raccolti. Tutti gli studi che coinvolgono campioni ottenuti da animali sono stati approvati e condotti secondo le linee guida del Comitato etico istituzionale per gli animali. Se del caso, sono state ottenute le approvazioni per il campionamento ambientale.

NOTA: Il successo della cultura dipende in modo critico dalla qualità degli ingredienti. Il terreno commerciale BSK è disponibile e supporta in modo robusto la crescita di B. burgdorferi puro adattato in laboratorio e specie correlate in cui l'inoculo ad alte dosi può essere utilizzato per seminare la coltura. Per gli isolati di ceppi da materiale biologico primario, il mezzo appena preparato è preferito e spesso necessario.

Borrelia sp. sono agenti patogeni noti o sospetti e anche i tessuti umani o animali non sottoposti a screening possono essere un rischio biologico. La manipolazione di materiale potenzialmente infettivo richiede dispositivi di protezione individuale e tecniche sterili per la sicurezza degli sperimentatori. Inoltre, il mezzo è così ricco di sostanze nutritive che la coltura è facilmente contaminata. Il contenimento di livello 2 di biosicurezza è generalmente richiesto per questo lavoro e tutti i lavori con Borrelia sp. o campioni devono essere condotti in un armadio di sicurezza biologica.

1. Istruzioni per la realizzazione del supporto BSK-II

  1. Preparazione del mezzo BSK-II completo
    1. Ottenere reagenti per preparare 1 L del substrato, come mostrato nella tabella 1.
      NOTA: la purezza BSA (o mancanza di purezza) è fondamentale per una crescita ottimale. In particolare, la purezza BSA differisce tra produttore e lotto. Si prega di consultare la Tabella 2 per un elenco di prodotti più o meno riusciti. Ottenere diversi campioni da diversi fornitori, testarli per una crescita ottimale, quindi acquistare una grande quantità del lotto migliore è una strategia efficace per mitigare questo problema e produrre un buon mezzo.
    2. Inizia sciogliendo la BSA in un becher mescolando l'acqua, che richiederà almeno mezz'ora.
    3. Aggiungere tutti i prodotti chimici secchi e lasciarli sciogliere. Quindi aggiungere il CMRL.
    4. Regolare il pH del mezzo BSK-II a 7,6, se necessario, con 1 M NaOH.
    5. Aggiungere siero di coniglio al terreno BSK-II ad una concentrazione del 6%-10%. Filtrare (dimensione dei pori 0,22 μm) il mezzo BSK-II. La quantità richiesta di siero dipende dalla specie Borrelia . Utilizzare il 6% -7% per le specie e i ceppi RF e per Borrelia burgdorferi sensu lato. Se la crescita non è forte, aggiungere un altro siero di coniglio sterile all'1% -2% al mezzo.
    6. Congelare lo stock di terreno BSK-II in aliquote da 100 mL o 400 ml.
    7. Per i ceppi RF, è necessaria la gelatina. Aggiungere 100 ml di gelatina sterile al 7% (leggermente riscaldata per metterla in soluzione) a 400 mL di terreno Bsk-II. Riscaldare il BSK-II con gelatina a 37 °C per far sciogliere la gelatina prima di inoculare la coltura.
      NOTA: Il terreno può essere congelato (-20 °C) prima della sterilizzazione con filtro e dell'aggiunta di siero di coniglio e gelatina (per spirochete RF) o dopo la sterilizzazione con filtro e l'aggiunta di siero (e gelatina). Il mezzo è stabile se congelato a lungo. Se conservato in frigorifero, utilizzare il mezzo entro 1 mese. Le specie RF crescono meglio con terreno fresco, di solito non più di 1 settimana. Se non congelato, ispezionare visivamente la qualità del mezzo per la torbidità. Scartare il mezzo che sembra essere contaminato, ingredienti precipitanti o altrimenti dubbi.
    8. Se gli antibiotici devono essere aggiunti al substrato, aggiungerli alle aliquote appena fatte o precedentemente congelate; Quest'ultimo è l'approccio più flessibile. Utilizzare concentrazioni di antibiotici come descritto da Oliver et al.39.
    9. Durante lo scongelamento di un tubo del mezzo, pesare gli antibiotici in tubi sterili (autoclavati) da 1,7 ml o tubi conici sterili da 15 ml, utilizzando una bilancia di precisione. Preparare le soluzioni madre come segue: sciogliere 25 mg di amfotericina B in 10 ml di DMSO, 20 mg di fosfomicina in 1 ml di acqua distillata autoclavata e 50 mg di rifampicina in 1 ml di DMSO.
    10. Filtrare (filtri a siringa da 0,2 μm) gli antibiotici e trasferirli in un nuovo tubo di dimensioni adeguate.
    11. Diluire gli antibiotici in un rapporto di 1:1000 del mezzo per raggiungere la loro concentrazione finale. Per 500 mL di BSK, aggiungere 0,5 mL di soluzione madre di amfotericina B (2,5 mg/mL in DMSO), 0,5 mL di soluzione madre di fosfomicina (20 mg/ml in H2O sterile) e 0,5 mL di rifampicina (US: rifampicina) soluzione madre (50 mg/ml in DMSO).
    12. Utilizzare il mezzo o l'aliquota con antibiotico e congelare a -20 °C.
Costituenti Importo (/L)
BSA frazione V 50 g
CMRL-1066 (10x) 100 ml
Neopeptone 5 g
Hepes 6 g
Sale trisodico dell'acido citrico diidrato 0,7 g
Glucosio 5 g
TC Lievitolato 2 g
Acido piruvico (sale di Na) 0,8 g
N-acetil-D-glucoseamina 0,4 g
Bicarbonato di sodio 2,2 g
Acqua (elevata purezza) 900 ml

Tabella 1: Composizione di 1 L di terreno BSK-II.

Fonte Idoneità
Serva GmbH, Heidelberg, Germania Sì
Proliant Biologicals, Boone IA, USA Sì
Sigma (Millipore-Sigma & Sigma- Aldrich), St. Louis, MO, Stati Uniti No

Tabella 2: Fonti di BSA e idoneità per il mezzo BSK-II.

2. Istruzioni per fare MKP

  1. Preparazione del mezzo di base
    1. Pesare e sciogliere accuratamente tutti i componenti in polvere elencati di seguito nella tabella 3 in 3 /4 del volume finale di ddH2O (ca. 750 ml) agitando fino alla completa dissoluzione, che richiede ~ 1 h.
    2. Dopo completa dissoluzione, regolare il pH con NaOH a 7,6 e il volume a 1000 ml, quindi sterilizzare mediante filtrazione (filtro da 0,22 μm).
      NOTA: il terreno di base può essere conservato a -20 °C per un massimo di 3 mesi.
  2. Preparazione del mezzo completo MKP
    1. Miscelare tutti i componenti elencati nella Tabella 4 in modo sterile; Sterilizzare la gelatina in autoclave e maneggiare in modo sterile. Lavorare in un armadio di sicurezza biologica sterile e utilizzare un siero filtrato sterile.
    2. Aliquot MKP in provette da 50 ml. Mettere una piccola aliquota a 33 °C per diversi giorni, quindi controllare al microscopio in campo oscuro l'assenza di contaminazione.
      NOTA: Conservare il mezzo completo MKP a +4 °C per non più di 1 mese e non congelare. Il mezzo completo può essere ulteriormente sterilizzato mediante filtrazione utilizzando un filtro da 0,22 μm.
Costituenti Importo (/L)
CMRL-1066 (10x senza glutammina) 100 mL (se liquido)/9,7 g/L se in polvere
Neopeptone 3 g
Hepes 6 g
Acido citrico 0,7 g
Glucosio 3 g
Acido piruvico 0,8 g
N-acetilglucosamina 0,4 g
Bicarbonato di sodio 2 g

Tabella 3: Composizione di 1 L di terreno MKP (Kelly-Pettenkofer modificato) di base.

Costituenti Quantità (ml)
Mezzo di base 500
7% gelatina (in H2O) (appena autoclavata ma non calda) 100
Siero di coniglio 36
35% BSA 17.5

Tabella 4: Composizione del terreno completo MKP (Kelly-Pettenkofer modificato).

3. Coltura di Borrelia, con o senza antibiotici

  1. Eseguire tutte le fasi sperimentali in condizioni di lavoro sterili in un armadio di sicurezza biologica. Disinfettare la superficie e tutti i materiali con etanolo al 70% e trasferirli immediatamente nell'armadio di sicurezza biologica. Sterilizzare UV tutti i materiali non biologici nell'armadio di sicurezza biologica per 5 minuti prima dell'inizio del lavoro.
  2. Usa il mezzo più fresco possibile.
  3. Per iniziare una coltura, preriscaldare il terreno (33 °C - 37 °C) in un'incubatrice. Applicare agitando se necessario.
    NOTA: a seconda del volume del supporto, questo passaggio potrebbe richiedere diverse ore.
  4. Aggiungere ~1 mL di coltura Borrelia scongelata da un glicerolo o materiale simile, precedentemente conservato a -80 °C e scongelato a temperatura ambiente (RT), non appena è liquido, a 5-15 mL di mezzo BSK preriscaldato. Inoculare la coltura in un piccolo volume (5-15 ml di BSK) utilizzando flaconcini di vetro o plastica disponibili in commercio con tappi a vite. Riempire i tubi quasi pieni per creare un'atmosfera micro o anaerobica. Chiudere saldamente i tubi; se coltivato in questo modo, la CO2 non è necessaria.
  5. Coltivare specie RF (e B. persica) a 37 °C in un'incubatrice senza agitazione o agitazione. Coltivare specie di B. burgdorferi sensu lato a 33-34 °C.
  6. Monitorare la crescita della coltura di Borrelia utilizzando il contrasto di fase o la microscopia in campo oscuro con ingrandimento 200x-400x (Figura 3). Per garantire una distribuzione uniforme delle cellule, mescolare la coltura con una pipetta sierologica o per una maggiore miscelazione con una pipetta di trasferimento da 3 ml durante il pipettaggio su e giù.
    NOTA: I Borrelia sono più visibili a ingrandimenti più elevati (200X-400X), ma sono meglio numerabili con ingrandimento 200X su un emocitometro40. Il movimento e la morfologia di Borrelia sono indicativi della presenza di questi batteri.
  7. Per quantificare la crescita batterica, contare diversi (10) singoli piccoli quadrati nel modello a griglia a sedici campi dell'area di conteggio su entrambi i lati dell'emocitometro e della media. Moltiplicare il numero medio di cellule per piccolo quadrato con il fattore di conversione appropriato per l'emocitometro utilizzato per determinare la conta cellulare per ml.
  8. Monitorare la crescita batterica a intervalli di 1-2 giorni. La crescita esponenziale di Borrelia dipende dalla vitalità e dalla densità cellulare e può richiedere 1 settimana o più a 34 °C. Diluire le colture di fase esponenziale in un rapporto di 1:2 o 1:4 con il mezzo in un tubo da 1,7 mL prima di caricare sull'emocitometro. Includere un'adeguata considerazione del fattore di diluizione quando si determina la conta cellulare. Dopo l'uso, spruzzare le superfici e l'emocitometro con candeggina diluita (10%) e/o etanolo al 70%.
    NOTA: Borrelia è in crescita esponenziale quando le concentrazioni cellulari sono 1-5 x 107 cellule / ml. All'interno di questo intervallo, le cellule crescono bene.
  9. La coltura estesa esaurirà i nutrienti e cambierà il pH del mezzo, quindi è necessaria la subcoltura. In condizioni sterili in un armadio di sicurezza biologica, trasferire 1/10 del volume di coltura in una nuova provetta e riempirla con il nuovo terreno (una nuova aliquota dello stesso mezzo utilizzato per coltivare il passaggio precedente). Una diluizione 1:10 è ottimale. Se il volume della coltura deve essere modificato, regolare la quantità di inoculo di conseguenza e continuare l'incubazione. Il numero di passaggi aumenta ad ogni cambio di mezzo.
  10. Per l'estrazione del DNA o l'isolamento delle cellule di Borrelia, centrifugare la fase esponenziale Borrelia per 10 minuti a 4000 x g per pellettare i batteri. Gettare il surnatante in idonei rifiuti a rischio biologico. Elaborare i batteri pellettati con un kit di estrazione del DNA commerciale o risospendere i batteri in un mezzo appropriato per l'esperimento previsto.
  11. Alla fine di ogni manipolazione, sterilizzare tutte le apparecchiature con etanolo e radiazioni UV, come appropriato per l'apparecchiatura. Raccogliere i rifiuti liquidi, compresa la coltura in eccesso, in una bottiglia di rifiuti e aggiungere candeggina a una concentrazione finale del 10%. Porre questo flacone a -80 °C prima di eliminarlo. In alternativa, sterilizzare i rifiuti liquidi e la coltura senza candeggina o alcool in autoclave.

4. Conservazione a lungo termine delle colture Borrelia

  1. Preparazione del brodo di glicerolo della coltura Borrelia
    1. Prendere ~ 1,8 ml di aliquote di colture di fase esponenziale, concentrazioni cellulari ~ 107-10 8 cellule / ml e aggiungere glicerolo sterile a una concentrazione finale del 10% (concentrazioni del 5% -20% funzionano).
    2. Introdurre in flaconcini criogenici con tappo a vite da 2 ml. Conservare a -80 °C.
    3. Mantenere una scorta con almeno 10 tubi di ogni ceppo nel congelatore.
  2. Una ricetta di conservazione alternativa per produrre uno stock di glicerolo per la conservazione permanente
    1. Mescolare 2/3 di coltura Borrelia con 1/3 di glicerolo al 15% in brodo di Brucella . Utilizzare 2,8 g di brodo di Brucella sciolto in 100 ml di ddH2O, che è stato filtrato sterile (0,22 μm).
    2. Conservare lo stock di glicerolo dei campioni a -70 °C a -80 °C.

5. Isolamento delle spirochete da fonti ambientali o cliniche

NOTA: Se si isola materiale da fonti umane, animali o ambientali, è necessario ottenere l'etica della ricerca, la cura degli animali o la certificazione ecologica, a seconda dei casi.

  1. Coltivazione di Borrelia da zecche dure
    1. Raccogli femmine adulte, maschi e / o zecche ninfali.
    2. La superficie sterilizza tutti i campioni di zecche immergendoli in etanolo al 70% per 2 minuti e asciugandoli all'aria in un armadio di sicurezza biologica. Sezionare individualmente in più pezzi con un bisturi sterile. Mettere i pezzi in un tubo da 2 ml contenente 1,5 ml di terreno, integrato con antibiotici.
    3. Incubare le colture a 34 °C e verificare la presenza di spirochete mediante microscopia in campo oscuro o a contrasto di fase due volte alla settimana per le prime 2 settimane e successivamente settimanalmente per 6 settimane (più spesso per le spirochete RF). Campioni positivi alla coltura della sottocoltura in 5 ml dello stesso mezzo.
      NOTA: Le colture contaminate possono essere purificate in una certa misura mediante filtrazione utilizzando un filtro da 0,2 μm; Gli antibiotici possono essere necessari per risolvere completamente la contaminazione.
  2. Coltivazione di Borrelia da campioni di sangue
    NOTA: Il campione di sangue deve essere prelevato da un medico, veterinario o ricercatore qualificato, a seconda della fonte del materiale. Dovrebbero trascorrere meno di 24 ore a RT tra un campione e l'altro
    Rimozione e arrivo in laboratorio.
    1. Ottenere 10 ml di sangue, raccolto in provette di raccolta del sangue di vetro con destrosio citrato acido (ACD; "top giallo") come anticoagulante. Lasciare a temperatura ambiente. Si raccomanda che trascorrano meno di 24 ore tra la raccolta del sangue e l'inoculazione.
    2. Centrifugare il sangue con anticoagulante per 10 minuti a 200-400 x g per separare il plasma dalle cellule del sangue.
    3. Rimuovere delicatamente il plasma dalla provetta e inoculare 1 mL di plasma in 5 mL di mezzo completo MKP preriscaldato. MKP può essere integrato con antibiotici. Incubare colture a 33 °C con ispezione visiva giornaliera e microscopia settimanale in campo oscuro o a contrasto di fase fino a quando non si nota una crescita borreliale (più spesso per RF Borrelia), che può richiedere fino a 9 settimane.
      NOTA: se si utilizzano volumi di inoculazione maggiori o minori, mantenere il rapporto 1:5 tra inoculante e medio. Utilizzare sieri o plasma piuttosto che sangue intero.
  3. Coltivazione di Borrelia da biopsia cutanea
    1. La superficie sterilizza la biopsia cutanea (idealmente un cubo di 3 mm x 3 mm x 3 mm, cioè con etanolo al 70% e perossido di idrogeno). Posizionare il campione bioptico in soluzione fisiologica.
      NOTA: Un campione di biopsia deve essere prelevato da un professionista medico, veterinario o di ricerca qualificato, a seconda della fonte del materiale. Tra la rimozione del campione e l'arrivo in laboratorio dovrebbero trascorrere meno di 24 ore a RT.
    2. Tagliare il campione in due-sei pezzi più piccoli usando una lama sterile in una capsula di Petri di vetro sterile mentre si è immersi nella soluzione fisiologica. Trasferire tutti i campioni e ~1 mL della soluzione fisiologica salina in cui è stata conservata la biopsia cutanea in 5 ml di terreno preriscaldato integrato con antibiotici e incubare a 33 °C.
    3. In caso di crescita eccessiva di batteri contaminanti, aggiungere antibiotici come al punto 1.1.10 sopra, o aggiungendo due compresse di sulfametossazolo (23,75 mg; concentrazione finale 5 mg / ml) + trimetoprim (1,25 mg; 0,25 mg / ml) o Bactrim (concentrazione minima inibitoria >128 μg / ml), due compresse di amikacina (2 x 30 μg; concentrazione finale 12 μg / ml), e due compresse di fosfomicina (2 x 200 μg; concentrazione finale 80 μg/ml).
      NOTA: In tutti i casi, assicurarsi di rimanere al di sotto della concentrazione minima inibitoria di quell'antibiotico per la specie Borrelia per la quale si sta tentando la coltura41,42,43.
    4. Se la coltura è positiva per Borrelia, conservare la coltura per altri 3-4 giorni o fino a quando la quantità di Borrelia raggiunge 10+ spirochete in un campo di microscopio utilizzando un obiettivo 40X. Creare uno stock di glicerolo per la conservazione permanente.

6. Isolamento di popolazioni monoclonali di B. burgdorferi sensu lato spirochetes e B. miyamotoi da colture liquide mediante coltivazione su terreni solidi

  1. Per fare le piastre, riscaldare 300 ml di mezzo completo MKP 1.5X (senza gelatina). Inoltre, riscaldare 200 ml di agarosio all'1,7% (autoclavato in acqua deionizzata, conservato a RT e cotto a microonde prima dell'uso) a 55 °C. Mescolare entrambi i liquidi.
  2. Pipettare 15 ml di questa miscela in ciascuna delle 16 piastre di Petri profonde per ottenere l'oselayer di agar inferiore.
  3. Conservare il resto del mezzo a 55 °C a bagnomaria.
    NOTA: I Borrelia sono mescolati nello strato superiore di agarosio.
  4. In primo luogo, quantificare la densità di coltura Borrelia utilizzando un emocitometro e diluire alla densità desiderata in un mezzo liquido.
    NOTA: 500, 200, 100 e 50 spirochete per piastra funzionano bene.
  5. Dopo che le piastre inferiori si sono solidificate, aggiungere 10 ml della miscela di agarosio rimanente in un tubo da 15 ml contenente il numero appropriato di spirochete.
  6. Versare la sospensione sull'agarosio inferiore nella capsula di Petri etichettata.
    NOTA: Poiché le spirochete Borrelia sono sensibili alle alte temperature, occorre prestare attenzione per garantire che i batteri non siano esposti a 55 °C per un lungo periodo di tempo; Versare l'agar superiore immediatamente dopo averlo aggiunto alle cellule batteriche nel mezzo.
  7. Dopo che le piastre sono completamente solidificate, chiudere le piastre di Petri e posizionarle capovolte a 34-35 °C in CO2 al 2,5%.
    NOTA: Le colonie appariranno 1 settimana dopo la placcatura se la procedura ha esito positivo.
  8. Per vagliare ed espandere le singole colonie, selezionare singole colonie dalle piastre e metterle in 1,5 ml di MKP liquido modificato, o altro mezzo adatto, in provette di coltura sterili da 2 ml.
  9. Incubare le colture a 34 °C ed esaminare le spirochete mediante microscopia in campo oscuro o di fase. Utilizzare queste colture per analisi o scorte, fatte come descritto sopra.

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Representative Results

I terreni di coltura Borrelia BSK e MKP, e le varianti, sono terreni di coltura ricchi con ingredienti che devono essere preparati e sterilizzati in sequenza. Se preparato correttamente, il terreno BSK deve essere rosso-arancio e chiaro (Figura 1). La torbidità e le precipitazioni che persistono dopo il riscaldamento indicano ingredienti problematici, produzione media o contaminazione; Tale mezzo è meglio scartarlo. Se la gelatina viene aggiunta a BSK e con MKP, il mezzo sarà gelatinoso quando refrigerato; Al riscaldamento, sarà liquido, anche se leggermente viscoso.

La crescita delle pure culture Borrelia non cambierà la torbidità del mezzo. Tuttavia, la crescita di colture batteriche, Borrelia, così come i contaminanti, cambierà colore medio a causa dell'indicatore di pH. La crescita eccessiva da parte di altri batteri produrrà torbidità e materiali raggruppati (Figura 2).

La crescita della coltura può essere monitorata mediante contrasto di fase o microscopia in campo oscuro (Figura 3 e Figura 4). Le cellule borrelia nella fase esponenziale sono tipicamente sottili e attorcigliate e mobili in una certa misura. Man mano che le colture entrano nella fase stazionaria, i corpi rotondi sono sempre più evidenti (Figura 5). Gli isolati clinici o ambientali contengono spesso più ceppi e/o specie di Borrelia . Per isolare cloni puri, le colture liquide possono essere placcate per isolare le colonie monoclonali (Figura 6); A volte, possono essere necessari più cicli di isolamento della colonia.

Figure 1
Figura 1: Terreno BSK e MKP . (A) BSK (con antibiotici) con coltura pura di Borrelia burgdorferi. Con o senza B. burgdorferi il terreno rimane senza torbidità visibile ed è arancione-ambrato (il colore varia leggermente con gli ingredienti). (B) Terreno MKP, non vaccinato, scongelamento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Terreno BSK e MKP contaminato con crescita eccessiva di batteri concorrenti. Il mezzo è scolorito, torbido e nel tempo i batteri concorrenti muoiono e precipitano sul fondo del tubo. (A) Tubo BSK troppo cresciuto. (B) Vecchio tubo BSK con batteri contaminanti precipitati. (C) Tubo MKP con coltura (sinistra) e senza coltura (centrale) e coltura contaminata (destra). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Uso di un emocitometro per monitorare la crescita di Borrelia . Borrelia burgdorferi ceppo B31 (un sottoinsieme indicato da frecce) visualizzato su un emocitometro (una linea della piccola griglia è indicata dalla punta della freccia) con contrasto di fase 200X. Questo ingrandimento e processo consentono il monitoraggio delle colture e la stima della densità cellulare. La barra della scala è di 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Immagine in campo scuro di Borrelia burgdorferi. Immagine in campo scuro del ceppo SCW-53 di Borrelia burgdorferi , ad alta densità in fase esponenziale dopo 5-7 giorni di coltivazione in mezzo MKP (ingrandimento 400X). La barra della scala è di 20 μm. Questo ceppo è stato isolato dalla zecca dura Ixodes affinis, raccolta nella Carolina del Sud, negli Stati Uniti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Borrelia nelle culture antiche. Mentre le cellule di Borrelia entrano nella fase stazionaria nelle vecchie colture, le forme del corpo rotondo sono sempre più viste per sostituire la forma spirochetale. Questi possono essere forme dormienti o cellule morte. Pannello sinistro, tintura Dieterle; pannello centrale, colorazione immunoistochimica; e pannello di destra, ibridazione fluorescente in situ di una coltura Borrelia (presumibilmente B. burgdorferi in base all'origine, ma la specie e il ceppo non sono stati identificati molecolarmente) inoculata con urina canina. La raccolta dei dati nella Figura 5 è stata approvata dal Mrt. Allison University Animal Care Committee, numero di approvazione 16-1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Spirochete complesse Borrelia burgdorferi sensu lato. Colonie di Borrelia burgdorferi sensu lato complesso spirochete coltivate su terreno solido al fine di isolare popolazioni clonali pure. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

La coltura di laboratorio dei batteri è il trampolino di lancio per la ricerca. Il profondo vantaggio conferito dalla capacità di cultura è esemplificato dalla lotta, nel corso di oltre un secolo culminata solo recentemente nel successo, alla cultura Treponema pallidum, la spirocheta che è l'agente eziologico della sifilide44. Le spirochete Borrelia sono anche impegnative per la cultura, ma la cultura è possibile 23,24,34,44,45,46,47,48,49.

Le cellule borrelia sono meticolose e ogni specie e ceppo, e anche isolare differisce, sia geneticamente che attraverso l'adattamento all'ospite da cui sono state isolate 51,52,53,54,55. Quando si realizzano i media, l'uso di ingredienti appropriati fa un'enorme differenza nel vigore della cultura Borrelia o persino nella vitalità della cultura. L'uso di terreno appena preparato, altamente arricchito e correttamente conservato è essenziale per promuovere la crescita batterica ed è un requisito consolidato per la crescita batterica. Per Borrelia, il mantenimento di condizioni anaerobiche o microaerobiche è necessario per una buona crescita. Ciò può essere ottenuto semplicemente riempiendo i tubi verso l'alto, quindi c'è poca o nessuna aria rimasta nel tubo e far crescere le colture senza agitazione; Un controllo più rigoroso dell'ossigeno e dell'anidride carbonica può essere richiesto per l'espressione genica e gli studi correlati 26,27,28,29,30. L'aggiunta di antibiotici al terreno di coltura batterica può sembrare contro-intuitiva; l'uso di basse dosi di antibiotici nel mezzo Borrelia è quello di scoraggiare la crescita di batteri a crescita più rapida. Se la coltura viene inoculata con un isolato di Borrelia puro, non è necessaria l'aggiunta di antibiotici; Tuttavia, l'uso di antibiotici aggiunti è essenziale per scoraggiare la crescita eccessiva da batteri concorrenti quando si inoculano campioni clinici o ambientali. Il mezzo BSK può anche essere integrato con gelatina al 3% -7%. Questo è necessario per la crescita delle specie RF Borrelia 21. L'uso di BSK o MKP per la crescita delle specie Borrelia burgdorferi sensu lato dipende dalla fonte dell'isolato. Entrambi i terreni supportano la crescita di colture consolidate, ma MKP è stato trovato per funzionare meglio quando si seminano nuove colture con un basso numero di cellule Borrelia, come avviene con isolati clinici o ambientali23,24. Questo mezzo permette anche la cultura di B. miyamotoi56,57,58. In definitiva, c'è un elemento di arte nella scienza della crescita di microbi fastidiosi, ma è possibile con cura e persistenza.

La cultura di Borrelia è alla base dei progressi della ricerca biomedica. La cultura di Borrelia ha permesso la determinazione dell'intero genoma e del proteoma di molte specie di Borrelia, che ha permesso ai ricercatori di iniziare a svelare l'evoluzione e la biologia di queste spirochete54,58,59. Allo stesso modo, l'accesso alle colture pure di Borrelia consente la comprensione delle molte interazioni complesse di Borrelia con l'ospite mammifero e il vettore artropode 61,62,63,64,65, comprese le interazioni con il sistema immunitario dell'ospite11,65, consente di dedurre meccanismi di trasmissione 29,66, e fornisce lo strumento investigativo chiave per distinguere le cellule coltivabili, quindi necessariamente viventi, dai detriti cellulari, una distinzione che è fondamentale per svelare i meccanismi della patogenesi e i regimi di trattamento efficaci 8,67,68,69,70,71. Mentre la coltura in vitro di Borrelia può richiedere diverse settimane prima che le spirochete siano sufficientemente abbondanti per il rilevamento, limitando le applicazioni diagnostiche cliniche, la comprensione fondamentale della biologia di Borrelia, della genomica, delle interazioni ospite-patogeno e di molte altre applicazioni si è basata sulla capacità di isolare Borrelia pura. colture da isolati ambientali e di amplificare tali isolati attraverso la coltura per produrre materiale sufficiente per l'analisi biochimica e genetica. C'è una spinta sociale per una risposta rapida alle infezioni per supportare una diagnosi e un trattamento rapidi. L'altra componente di questa necessità, tuttavia, è la ricerca biomedica e biologica necessaria per una solida base su cui trattare e prevenire le malattie in modo appropriato e con successo. Sebbene impegnativa, la coltivazione in vitro delle spirochete Borrelia è possibile e può supportare queste esigenze.

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Disclosures

Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal Natural Science and Engineering Research Council of Canada e dalla Canadian Lyme disease Foundation (AB e VL), dal Consiglio svedese delle ricerche (SB, M-LF e IN), DAL PROGETTO TAČR GAMA 2 - "Support of application potential verification 2.0 at the Biology Centre CAS" (TP01010022) (MG e NR), e da una sovvenzione del Ministero della Salute della Repubblica Ceca NV19-05-00191 (MG e NR). Ringraziamo S. Vranjes (2021, Rudenko lab) per l'immagine in Figura 4 e J. Thomas-Ebbett (2021, Lloyd lab) per le immagini in Figura 5. Ringraziamo tutti i ricercatori che hanno contribuito al campo e ci scusiamo con coloro il cui lavoro non siamo stati in grado di citare a causa di limitazioni di spazio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item - any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item - any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item - any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item - any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item - any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item - any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item - any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item - any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item - any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item - any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item - any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item - any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important - see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item - any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item - any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item - any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item - any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item - any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item - any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item - any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item - any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top - ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item - any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item - any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item - any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item - any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item - any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item - any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item - any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item - any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item - any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item - any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item - any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item - any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item - any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item - any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item - any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item - any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item - any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item - any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item - any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item - any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item - any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item - any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item - any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item - any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item - any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item - any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item - any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item - any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item - any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item - any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item - any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item - any supplier will do

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Immunologia e infezione numero 189
Metodi di coltivazione delle spirochete di Borrelia <em>burgdorferi</em> Sensu Lato Complex e febbre recidivante <em>Borrelia</em>
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Berthold, A., Faucillion, M. L.,… More

Berthold, A., Faucillion, M. L., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).

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