Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מודל בידוד חברתי: מודל מכרסם לא פולשני של מתח וחרדה

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64567
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Titus Family Department of Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, University of Southern California, 2Homer Stryker M.D. School of Medicine, Western Michigan University

Summary

מוצג כאן מודל עכברי חרדה המושרה על ידי בידוד חברתי (SI) המשתמש בעכברי C56BL/6J מסוג פראי כדי לגרום ללחץ והתנהגות דמוית חרדה עם טיפול מינימלי וללא הליכים פולשניים. מודל זה משקף דפוסי חיים מודרניים של בידוד חברתי והוא אידיאלי לחקר חרדה והפרעות נלוות.

Abstract

הפרעות חרדה הן אחד הגורמים המובילים למוגבלות בארצות הברית (ארה"ב). הטיפולים הקיימים כיום אינם תמיד יעילים ופחות מ-50% מהמטופלים משיגים הפוגה מלאה. שלב קריטי בפיתוח נוגד חרדה חדשני הוא לפתח ולהשתמש במודל של בעלי חיים, כגון עכברים, כדי לחקור שינויים פתולוגיים ולבדוק מטרות של תרופות, יעילות ובטיחות. הגישות הנוכחיות כוללות מניפולציה גנטית, מתן כרוני של מולקולות מעוררות חרדה, או מתן לחץ סביבתי. שיטות אלה, עם זאת, לא יכול לשקף באופן מציאותי חרדה המושרה לאורך חיי היומיום. פרוטוקול זה מתאר מודל חרדה חדש, המחקה את הדפוסים המכוונים או הלא מכוונים של בידוד חברתי בחיים המודרניים. מודל החרדה הנגרמת על ידי בידוד חברתי ממזער את הסחות הדעת והפולשנות הנתפסות ומשתמש בעכברים מסוג C57BL/6 פראיים. בפרוטוקול זה, עכברים בני 6 עד 8 שבועות (זכר ונקבה) שוכנים בנפרד בכלובים אטומים כדי לחסום חזותית את הסביבה החיצונית, כגון עכברים שכנים, למשך 4 שבועות. לא מסופקות העשרות סביבתיות (כגון צעצועים), חומר המצע מופחת ב-50%, כל טיפול בתרופה ניתן בצורת אגר, והחשיפה/טיפול בעכברים ממוזערת. עכברים מבודדים חברתית שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה מפגינים התנהגות דמוית חרדה גדולה יותר, תוקפנות, כמו גם ירידה בקוגניציה.

Introduction

הפרעות חרדה מייצגות את המעמד והנטל הגדול ביותר של מחלות נפש בארצות הברית (ארה"ב), עם עלויות שנתיות נלוות העולות על 42 מיליארד דולר 1,2,3. בשנים האחרונות, חרדה ומתח העלו את שכיחות ההתאבדויות וההתאבדויות ביותר מ-16%4. חולים עם מחלות כרוניות פגיעים במיוחד להשפעות משניות לא מכוונות של מצוקה נפשית או תפקוד קוגניטיבי מופחת5. הטיפולים הנוכחיים לחרדה כוללים פסיכותרפיה, תרופות, או שילוב שלשניהם 6. עם זאת, למרות משבר זה, פחות מ -50% מהחולים משיגים הפוגה מלאה 6,7. לתרופות נוגדות חרדה כגון בנזודיאזפינים (BZs) ומעכבי ספיגה חוזרת סלקטיבית של סרוטונין (SSRI) יש חסרונות משמעותיים אולייצר מעט מאוד השפעות מיידיות 8. יתר על כן, קיים מחסור יחסי בתרופות נוגדות חרדה חדשות הנמצאות בפיתוח, המאותגרות על ידי התהליך היקר והגוזל זמן של פיתוח תרופות 9,10.

שלב קריטי בתהליך פיתוח התרופה הוא הקמה ושימוש במודל של בעלי חיים, כגון עכברים, כדי לחקור שינויים פתולוגיים ולבדוק את הבטיחות והיעילות של תרופות11. הגישות הנוכחיות לביסוס מודלים של בעלי חיים חרדים כוללות 1) מניפולציה גנטית, כגון סילוק קולטני סרוטונין (5-HT1A) או קולטן חומצה γ-אמינובוטירית קולטן A (GABAAR) α תת-יחידות12; 2) מתן כרוני של מעוררי חרדה כגון קורטיקוסטרון או ליפופוליסכרידים (LPS)13,14; או 3) ניהול לחץ סביבתי כולל תבוסה חברתית והפרדה אימהית15. עם זאת, שיטות אלה עשויות שלא לשקף באופן מציאותי חרדה הנגרמת במהלך חיי היומיום ולכן ייתכן שאינן מתאימות לחקר המנגנון הבסיסי או לבדיקת תרופות חדשות.

כמו בני אדם, עכברים וחולדות הם יצורים חברתיים מאוד16,17,18. מגע חברתי ואינטראקציות חברתיות חיוניים לבריאות מוחית מיטבית והם קריטיים להתפתחות עצבית תקינה במהלך תקופת הגידול19. לכן, היפרדות אימהית או בידוד חברתי במהלך תקופת הגידול גורמים לעכברים להראות יותר חרדה, דיכאון, ושינויים בהעברה עצבית20. יתר על כן, טיפוח חברתי או allogrooming היא צורה נפוצה של קשר או התנהגות מנחמת בקרב עכברים וחולדות שחיים יחד21. לפיכך, סוציאליזציה היא חלק בלתי נפרד מחיי המכרסמים, והבידוד משפיע לרעה על בריאותם.

בהקשר זה, הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל חרדה חדש המחקה את הדפוסים המכוונים או הלא מכוונים של בידוד חברתי בחיים המודרניים. מודל בידוד חברתי (SI) זה ממזער את הסחות הדעת והפולשנות הנתפסות ומשתמש בעכברי פרא בוגרים מסוג C57BL/6 ובחולדות ספראג-דאולי (SD). הפרוטוקול המוצג כאן מתמקד במודל עכברי החרדה המבוסס על הראיות שפרסמנו, שהראו התנהגות מוגברת דמוית חרדה, תוקפנות, ירידה בקוגניציה ודלקת עצבית מוגברת כתוצאה מבידוד חברתי22,23,24. התנהגות דמוית חרדה מאושרת על ידי מבחני מבוך פלוס מוגבה (EPM) ומבחני שדה פתוח (OF), בעוד שהתפקוד הקוגניטיבי נמדד על ידי מבחני זיהוי עצמים חדשים (NOR) ומבחני זיהוי הקשר חדש (NCR). מודל זה שימושי לחקר חרדה והפרעות קשורות, אך ניתן גם להתאים או לשנות אותו כדי ללמוד את ההתקדמות הטבעית וההתפתחות של פגיעה קוגניטיבית קלה, כמו גם שינויים מטבוליים עקב מתח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים מבוצעים על פי הפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת דרום קליפורניה (USC) (IACUC), וכל השיטות מתבצעות בהתאם להנחיות, לתקנות ולהמלצות הרלוונטיות.

1. בעלי חיים

  1. לקבל אישור מוועדות מתאימות לטיפול בבעלי חיים למחקר.
  2. הגדר את הוויבריום למחזור של 12 שעות אור כהה עם טמפרטורה ולחות מבוקרות בין 24 ± 2 °C ו- 50%-60%, בהתאמה.
  3. השג עכברים זכרים ו/או נקבות מסוג C57BL/6 בגיל 6-8 שבועות. לאחר ריבוד בעלי החיים לפי מין, הקצה אותם באופן אקראי לאחת מהקבוצות הבאות: 1) בית קבוצתי עם טיפול ברכב; 2) בית קבוצה עם טיפול תרופתי; 3) בידוד חברתי עם טיפול ברכב; או 4) בידוד חברתי עם טיפול תרופתי. יש לשאוף לפחות לארבעה עכברים לקבוצה בכל מין (באופן אידיאלי שישה עכברים לקבוצה).
  4. עם הגעתם של העכברים, להתאקלם אותם vivarium לפחות 24 שעות. העכברים צריכים להגיע לביתם הבודד.

2. הגדרת כלוב

  1. עבור חיות בידוד חברתי, קחו כלוב עכברים סטנדרטי (75אינץ' 2 שטח רצפה) והוסיפו מחצית מכמות המצעים ו-1 מתוך2 חתיכות כותנה (או שווה ערך) לקינון.
  2. עוטפים את הקירות החיצוניים של הכלובים בשקיות ניילון שחורות אטומות (או שווה ערך) ומאבטחים באמצעות נייר דבק. ודאו שהעכברים אינם יכולים לראות את הסביבה החיצונית או את בעלי החיים הסובבים אותה.
    1. השאירו את החלק העליון והתחתון של הכלוב לא עטופים, אלא אם כן העכברים יכולים לראות דרכם חיות שכנות.
    2. בעת העטיפה, יש לוודא שאף חלק מהשקית אינו נגיש מתוך הכלוב. זאת כדי למנוע מבעל החיים לקרוע את השקית לגזרים.
    3. אין לכלול כל צורה של העשרה סביבתית, כגון צעצועים או גלגלי ריצה.
  3. בזהירות ובעדינות מניחים את העכברים בכלובים המוכנים. לספק מזון ומים ad libitum.
  4. עכברי בקרת בית בקבוצות של שניים או שלושה בתנאי כליאה רגילים (כלומר, בכלוב עכברים סטנדרטי [75 ב-2 שטח רצפה], כמות מלאה של מצעים, פיסת כותנה 2ב-2 או שווה ערך לקינון, וללא עטיפה של שקיות אטומות).
    1. ודא שהעכברים ששוכנים בקבוצה תואמים זה לזה (כלומר, אין ביניהם קרבות/קונפליקטים). אם מתרחשת התנגשות, הסר את התוקפן ואל תכלול בניתוח.
    2. הפרידו בין עכברים זכרים לנקבות ושמרו על מרחק בין הזכרים לנקבות כדי למנוע את האפשרות להשפיע על השינויים ברמה האנדוקרינית של נקבות עכברים בשל יכולתם להריח.

3. טיפול וטיפול בתקופת הבידוד החברתי

  1. הפריעו לעכברים בצורה מינימלית ככל האפשר במהלך תקופת הבידוד החברתי. בצע הליכים ופעילויות, כגון החלפת כלובים ומתן טיפול, במהלך התקופה הפעילה שלהם (כלומר, במהלך המחזור החשוך) ותחת הפרעות רעש מינימליות.
  2. החליפו את הכלובים רק פעם בשבוע במהלך המחזור החשוך. ניתן להסיר את אותה שקית ניילון ולעטוף אותה מחדש בכלובים חדשים, אלא אם כן קיים נזק משמעותי.
    1. עבור עכברי בקרה (קבוצתיים), החליפו את הכלובים פעמיים בשבוע או יותר לפי הצורך במהלך המחזור החשוך.
  3. ודאו שלעכברים יש הרבה מים ומזון שיחזיקו מעמד לפחות שבוע אחד.
  4. המשיכו לבודד את העכברים למשך 4 שבועות לפחות כדי לראות תוצאות מיטביות.

4. אגר תרופה / הכנה לטיפול - טיפול תרופתי לא פולשני

  1. אם מעורבים במחקר טיפולים (למשל, תרופות הנחקרות), באופן אידיאלי לנהל את הטיפול עם טיפול מועט ככל האפשר, על ידי שימוש בצורות אגר. מסלולים כמו הזרקה וגנבה דרך הפה גורמים ללחץ נוסף על העכברים שעלול להפוך לגורם מבלבל של חרדה.
  2. התאם את התזמון והתדירות של הטיפול בהתבסס על אופי התרופה המשמשת.
    הערה: במחקר זה נעשה שימוש ב-2 מ"ג/ק"ג דיהידרומיריצטין (DHM, [(2R,3R)-3,5,7-טריהידרוקסי-2-(3,4,5-טריהידרוקסיפניל)-2,3-דיהידרוכרומן-4-אחד]) כטיפול. DHM ניתן מדי יום, במנה אחת, במהלך השלב החשוך של השבועיים האחרונים של תקופת הבידוד (או בית הקבוצה).
  3. כדי להכין את הטיפול, יש להוסיף 3% (w/v) אגר במים שעברו דה-יוניזציה (DI) ולחמם ל~90°C כדי להתמוסס. הפתרון יבעבע. למנוע שפיכה או רתיחה.
    הערה: יש לחמם את התמיסה בבקבוק זכוכית באמצעות מרווחים קצרים של 10 שניות של חימום במיקרוגל.
    זהירות: כלי הזכוכית יהיו חמים. יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים בעת הטיפול בפתרון.
  4. סובב את הפתרון והבטח חזותית פתרון הומוגני.
    הערה: הפתרון צריך להיות שקוף וצהוב בהיר עד חום בהיר בצבע.
  5. בזמן שהתמיסה עדיין חמה, יש להוסיף 5% (עם v/v) סוכרוז ואת המינון הרצוי של הטיפול. רק להוסיף סוכרוז ולא להוסיף את הטיפול של עניין לשליטה ברכב.
  6. סובב את הפתרון והבטח חזותית פתרון הומוגני. לאחר מכן, יוצקים את הפתרון לתוך תבנית ולתת מגניב בטמפרטורת החדר כדי להתמצק. אם הטיפול רגיש לאור, הקפידו להגן עליו מפני אור.
    הערה: הפתרון צריך להיות צמיג מעט.
  7. לאחר שהתמצק, חותכים את האגר לקוביות של 0.5 ס"מ על 0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ ומאחסנים ב 4 מעלות צלזיוס עד לניהול.
  8. למתן הטיפול יש להניח קובייה בודדת על סירת משקל קטנה. במהלך השלב החשוך של מחזור האור-חושך, הכניסו בשקט ובזהירות את סירת האגר-משקל לכלובים בודדים, מבלי לגעת בעכבר. אפשר לעכבר לצרוך את האגר.
    הערה: עכברים בדרך כלל מקדישים 15-45 דקות לצריכה מלאה של האגר.
  9. אשר את הצריכה המלאה של האגר ולאחר מכן הסר בזהירות את סירת השקילה מהכלוב. יש לחזור על הפעולה לפי הצורך.
  10. הכינו קוביות אגר מדי שבוע כדי לשמור על טריות ולהימנע מכל זיהום.

5. ניתוח התנהגות

  1. בצע בדיקות התנהגותיות 24 שעות לאחר היום האחרון של תקופת הבידוד בת 4 השבועות (או יותר). ערכו בדיקות בשלב החושך תחת תאורה אדומה עקיפה והקליטו באמצעות מצלמת וידאו.
  2. ארגן לפחות שלושה אנשים כדי לנהל ניקוד לא מקוון ידני באופן כפול סמיות כדי למזער הטיה וטעויות.
  3. מבוך מוגבה פלוס (EPM)
    1. הכן את מנגנון ה- EPM. המנגנון המשמש בפרוטוקול זה הושג באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) ועשוי מפלסטיק אטום עם שתי זרועות פתוחות ושתי זרועות סגורות (33 ס"מ על 5 ס"מ כל אחת, זרועות פתוחות בניצב לזרועות הסגורות) עם פלטפורמה מרכזית של 5 ס"מ x 5 ס"מ. הרימו את המנגנון 50 ס"מ מעל הרצפה.
    2. מניחים את החיה על מרכז המנגנון, מול זרוע פתוחה. אפשר לבעל החיים לחקור במשך 5 דקות ולהקליט את פעילותם באמצעות מצלמת וידאו.
      1. נקו את המכשיר אחרי כל חיה על ידי ניגוב יסודי של כל המשטחים בחומר חיטוי (70% אלכוהול אתילי). ודאו שכל גללי המכרסמים נמחקים.
    3. ניקוד התנהגות העכברים במצב לא מקוון בהתבסס על הזמן שבילו בזרועות פתוחות, בזרועות סגורות ובפלטפורמה המרכזית באמצעות סטופר. הפעל את שעון העצר כאשר העכבר מניח לפחות שלוש כפות בזרוע או בפלטפורמה המתאימות.
  4. בדיקת שדה פתוח (OF)
    1. הכן את מנגנון OF. המנגנון המשמש בפרוטוקול זה (ראו טבלת חומרים) היה עשוי מפלסטיק אטום בגודל 50 ס"מ x 50 ס"מ x 38 ס"מ (אורך x רוחב x גובה).
    2. ציירו רשתות מרובעות (10 ס"מ על 10 ס"מ כל אחת) על המגרש בסך הכל 25 רשתות.
    3. מניחים את החיה במרכז השדה ומאפשרים לחקור במשך 10 דקות. הקלט את הפעילות שלהם במצלמת וידאו.
      1. נקו את המכשיר אחרי כל חיה על ידי ניגוב יסודי של כל המשטח בחומר חיטוי (70% אלכוהול אתילי). ודאו שכל גללי המכרסמים נמחקים.
    4. ציון התנהגות העכברים במצב לא מקוון בהתבסס על זמן השהייה באזור המרכזי, זמן השהייה בפינות, המרחק הכולל שנסע ומספר הפעמים שהעכבר גדל.
      1. השתמש בשעון עצר כדי להקליט את הזמן המושקע במרכז או בפינה. הפעל את שעון העצר כאשר העכבר מציב לפחות שלוש כפות באזור המתאים.
      2. השתמש מונה כדי לרשום את המרחק שעבר ואת תדירות הגידול. ספירת מספר הריבועים שהעכבר מזין (כאשר העכבר מציב לפחות שלוש כפות בריבוע). ספרו את הגידול כאשר העכבר עומד בבירור על כפותיו האחוריות. אל תספרו מתי העכבר עומד ונשען על הקירות או כשהוא עומד כדי לטפח.
  5. בדיקת זיהוי עצמים חדשניים (NOR)
    1. יש לבצע בדיקה זו במשך 3 ימים. ביום הראשון, הכינו מכשיר שדה פתוח של 50 ס"מ על 50 ס"מ על 38 ס"מ (אורך x רוחב x גובה). מניחים את החיה במרכז השדה הפתוח ומאפשרים להכיר במשך 5 דקות. לאחר מכן החזירו את החיה לכלוב הביתי שלה.
      1. נקו את המכשיר אחרי כל חיה על ידי ניגוב יסודי של כל המשטחים בחומר חיטוי (70% אלכוהול אתילי). ודאו שכל גללי המכרסמים נמחקים.
    2. ביום השני, הכינו את אותו מנגנון שדה פתוח והניחו שני חפצים זהים, כמו קובייה קטנה. מקמו אותם בצורה סימטרית במרחק של כ-20 ס"מ זה מזה. מניחים את החיה במרכז המנגנון ומאפשרים לחקור במשך 5 דקות. לאחר מכן החזירו את החיה לכלוב הביתי שלה.
      1. נקו את המכשיר אחרי כל חיה על ידי ניגוב יסודי של כל המשטחים בחומר חיטוי (70% אלכוהול אתילי). ודאו שכל גללי המכרסמים נמחקים.
    3. ביום השלישי, הכינו את אותו מנגנון שדה פתוח ואת אחד האובייקטים מהיום השני (כלומר, קובייה קטנה), שיתפקדו כאובייקט המוכר. מקמו אובייקט חדש, אחר, שונה, כמו פירמידת עץ, באופן סימטרי מהאובייקט המוכר במרחק של כ-20 ס"מ זה מזה. אפשר לבעל החיים לחקור במשך 3 דקות ולהקליט את פעילותם במצלמת וידאו.
      1. נקו את המכשיר אחרי כל חיה על ידי ניגוב יסודי של כל המשטחים בחומר חיטוי (70% אלכוהול אתילי). ודאו שכל גללי המכרסמים נמחקים.
    4. ציון התנהגות העכברים במצב לא מקוון בהתבסס על הזמן המושקע בחקר האובייקט המוכר והאובייקט החדש. חישוב מדד זיהוי האובייקטים (ORI%), כאשר Equation 1; tf ו- tn מייצגים את זמני חקירת האובייקטים המוכרים והחדשים, בהתאמה.
  6. מבחן זיהוי הקשר חדשני (NCR)
    1. יש לבצע בדיקה זו במשך יומיים. הכינו שני שדות פתוחים בעלי צורה שונה ושני זוגות של עצמים בעלי צורה שונה. מנגנון OF יכול לשמש כאחד ההקשרים (שדה פתוח). ההקשר האחר צריך להיות בגודל דומה אך בצורה שונה, כגון שדה פתוח עגול.
    2. ביום הראשון, מקם זוג אחד של עצמים זהים (כלומר, שתי קוביות) בהקשר המרובע ואת הזוג השני של עצמים זהים (כלומר, שתי פירמידות) בהקשר העגול. חפצים צריכים להיות ממוקמים באופן סימטרי 15-20 ס"מ זה מזה.
    3. מקם את החיה במרכז ואפשר לחקור במשך 5 דקות בהקשר אחד. חזור בהקשר האחר. לאחר מכן, החזירו את החיה לכלוב הביתי שלה.
      1. נקו את המכשיר אחרי כל חיה על ידי ניגוב יסודי של כל המשטחים בחומר חיטוי (70% אלכוהול אתילי). ודאו שכל גללי המכרסמים נמחקים.
    4. ביום השני, החליפו את אחד האובייקטים מהקשר אחד עם השני (כלומר, הניחו קובייה אחת ופירמידה אחת בהקשר הריבועי, וקובייה אחת ופירמידה אחת בהקשר העגול).
    5. מניחים את החיה במרכז ומאפשרים לחקור במשך 3 דקות. הקלט את הפעילות שלהם במצלמת וידאו. אין צורך לתעד את בעלי החיים בשני ההקשרים.
      1. נקו את המכשיר אחרי כל חיה על ידי ניגוב יסודי של כל המשטחים בחומר חיטוי (70% אלכוהול אתילי). ודאו שכל גללי המכרסמים נמחקים.
    6. ציין את התנהגות העכברים במצב לא מקוון בהתבסס על הזמן שהוקדש לחקר האובייקטים המובחנים. חישוב מדד הזיהוי (RI%) כשיעור הזמן המושקע בחקירת האובייקט החדש "מחוץ להקשר" (כלומר, הפירמידה בהקשר הריבועי) לעומת האובייקט המוכר "בתוך ההקשר" (כלומר, הקובייה בהקשר הריבועי). Equation 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כל התוצאות והנתונים המייצגים שונו מהפרסומים האחרונים שלנו22,23. כדי להעריך את ההשפעות של בידוד חברתי על חרדה והתנהגות חקרנית, בדיקות EPM ו- OF בוצעו 24 שעות לאחר תאריך הסיום של תקופת הבידוד החברתי בת 4 השבועות. עכברים מבודדים חברתית בילו באופן משמעותי פחות זמן בזרוע הפתוחה (1.28 ± 0.17 דקות) בהשוואה לבקרה (2.31 ± 0.27 דקות), וזמן ארוך יותר באופן משמעותי בזרוע הסגורה (3.31 ± 0.27 דקות) בהשוואה לבקרה (2.24 ± 0.31 דקות) (איור 1). באופן דומה, במבחן OF, עכברים מבודדים חברתית נסעו פחות (2,176 ± 146 ס"מ לעומת שליטה [2,765 ± 161 ס"מ]), גודלו פחות (28.25 ± 2.07 לעומת שליטה [46.63 ± 1.52]), בילו יותר זמן בפינות (73.00 ± 4.31 שניות לעומת שליטה [28.25 ± 2.07 שניות]), ובילו פחות זמן באזור המרכז (7.63 ± 0.86 שניות לעומת שליטה [19.63 ± 0.71 שניות]), המצביעים על התנהגות משופרת דמוית חרדה (איור 2).

יתר על כן, ההשפעות של בידוד חברתי על הקוגניציה הוערכו, שכן הפרעות חרדה בדרך כלל מראות גם סימפטומים של פגיעה קוגניטיבית, כגון אובדן זיכרון וקושי להתרכז25,26. נעשה שימוש בשני מבחנים: זיהוי עצמים חדש (NOR) וזיהוי הקשר חדש (NCR), כפי שתואר קודםלכן 23, כדי להעריך את יכולתם של העכברים לזהות אובייקטים חדשים בהקשר דומה (NOR) והקשר חדש עם אובייקטים דומים (NCR). עכברים מבודדים חברתית הציגו הן זיהוי מופחת של אובייקטים חדשים (55.3 ± 4.1% לעומת שליטה [66.3 ± 4.7%]) (איור 3A) והן זיהוי הקשר חדשני מופחת (51.5 ± 6.5% לעומת שליטה [68.6 ± 2.8%]), מה שמרמז על פגיעה קוגניטיבית (איור 3B).

Figure 1
איור 1: שינויים בהתנהגות דמוית חרדה כפי שנמדדו על-ידי מבוך פלוס מוגבה (EPM). זמן שהייה בזרוע (A) פתוחה ו-(B) בזרוע סגורה של מנגנון EPM. הנתונים המיוצגים כממוצע ± SEM. ANOVA חד כיוונית ואחריה השוואות מרובות, שיטת הולם-סידאק. N = 11 לכל קבוצה. * עמ' ≤ 0.05. נתון זה שונה מ- Al Omran et al.22 (גישה פתוחה תחת רישיון ייחוס 4.0 בינלאומי של Creative Commons). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: שינויים בהתנהגות דמוית חרדה ובפעילות תנועתית הנמדדים על-ידי מבחן השדה הפתוח (OF). הנתונים מוצגים כ- (A) המרחק הכולל שעברו, (B) מספר הפעמים שהעכברים גדלו, (C) הזמן הכולל שבילו בפינה ו- (D) הזמן הכולל שבילו במרכז מנגנון OF. הנתונים המיוצגים כממוצע ± SEM. ANOVA חד כיוונית ואחריה השוואות מרובות, שיטת הולם-סידאק. N = 11 לכל קבוצה. * עמ'≤ 0.05. נתון זה שונה מ- Al Omran et al.22 (גישה פתוחה תחת רישיון ייחוס 4.0 בינלאומי של Creative Commons). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: שינויים בקוגניציה כפי שנמדדו על-ידי מבחני זיהוי עצמים חדשים (NOR) ומבחני זיהוי הקשר חדש (NCR). (A) ORI = אינדקס זיהוי אובייקטים. (B) RI = (הקשר חדש) אינדקס זיהוי. הנתונים המיוצגים כממוצע ± SEM. ANOVA חד כיוונית ואחריה השוואות מרובות, שיטת הולם-סידאק. N = 9 לכל קבוצה. * עמ' ≤ 0.05. נתון זה שונה מ- Watanabe et al.23 (גישה פתוחה תחת רישיון ייחוס 4.0 בינלאומי של Creative Commons). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

צעדים קריטיים בפרוטוקול כוללים הגדרה נכונה של כלובי הבידוד החברתי (כלומר, עטיפת שקיות אטומות והפחתת כמות המצעים), מזעור הטיפול וההפרעה לעכברים לאורך כל תקופת הבידוד, ווידוא שהעכברים מקבלים וצורכים את האגר עם סמים לחלוטין. זה קריטי כי vivarium או מצב הדיור נשמר בטמפרטורה קבועה ולחות, כמו גם מינימום הפרעות חיצוניות. יש להשקיע מאמצים משמעותיים בהפחתת כמה שיותר מהגורמים המבלבלים הללו, כולל אך לא מוגבל להפרעות רעש (למשל, שיחות, רעשי ציוד וכו'), טיפול יתר והפרעה לבעלי החיים במהלך שלב האור של מחזור האור החשוך. יש למזער גם את הזמן הנדרש להחלפת כלובים, מילוי מזון ו/או מים, מתן טיפול וכל שאר התפקודים בתקופת הבידוד. למרות שזה נדיר, צפינו בעבר בלחימה בקרב עכברים זכרים ששוכנים בקבוצה. לכן, עבור העכברים ששוכנו בקבוצה (שליטה או דומה), יש צורך בהתבוננות זהירה כדי להבטיח שאין קונפליקטים בין העכברים, שכן זה יגרום לבלבול נוסף של חרדה או מתח. במקרה שהלחימה אכן מתרחשת, יש להחליף את התוקפן החשוד עם מקביל אחר ששוכן בקבוצה ולהמשיך להיות נצפה. אם התוקפן ממשיך ליצור קונפליקטים, מוצע להוציא את התוקפן כמו גם עכברים שסבלו מפציעות מהתוקף מהמחקר.

הפרוטוקול המתואר ממליץ על 4 שבועות של בידוד, אך ניתן להאריך מסגרת זמן זו. התקופה הארוכה ביותר של בידוד חברתי שביצענו היא 8 שבועות, וגם ביצענו בידוד חברתי חוזר ונשנה (בידוד, בית קבוצתי, בידוד מחדש) כמודל לחרדה/מתח מצטברים. ניתן לשנות את העיתוי והאורך של תקופות בידוד אלה כך שיתאימו לצרכים או למטרות הניסוי. עם זאת, הפחתת תקופת הבידוד לפחות מ -4 שבועות אינה מומלצת, מכיוון שזה לא יכול להיות מספיק זמן עבור העכברים להפגין התנהגות דמוית חרדה או שינויים פתולוגיים במוח. ניתן לשנות גם את התזמון והתדירות של הטיפול(ים).

ביחס לשיטות הקיימות להקמת מודלים של בעלי חיים חרדתיים, למודל זה מספר יתרונות. ראשית, הוא אינו דורש בחירת פנוטיפ נרחבת (רבייה סלקטיבית) או מניפולציה גנטית, כגון הדחה או השתקה של קולטנים במוח. בעוד שעכברים מהונדסים גנטית שימושיים לחקר גנים רגישים, ייתכן שהם לא יתפסו לחלוטין פתוגנזה של חרדה12. יתר על כן, נוקאאוטים של גנים עלולים להיות קטלניים או לא לחקות במדויק חרדה שנצפתה בבני אדם27. מניפולציה גנטית דורשת זמן ומאמץ, ודורשת מיצוי תאי גזע עובריים, הזרקת DNA, תרבות, השתלה ברחם וגידול27. בנוסף, בעלי חיים גנטיים אלה עשויים שלא באמת לשקף השפעות תרופתיות לפיתוח תרופות. מודל בידוד חברתי זה, למרות שהוא דורש לפחות 4 שבועות של בידוד, הוא יתרון מבחינת זמן, מאמץ ואמינות. שנית, העכברים אינם חייבים לקבל טיפול כרוני עם מעוררי חרדה כגון קורטיקוסטרון או ליפופוליסכרידים (LPS)13,14. אין צורך שהחוקרים יעברו הליכי הזרקה יומיים, ומודל הבידוד החברתי משקף בצורה מדויקת יותר חרדה בבני אדם, שכן רוב האנשים אינם מקבלים זריקות יומיות כדי לחוות חרדה. לבסוף, עכברים אינם צריכים להיות מותנים (כמו בפרדיגמות של תבוסה חברתית), דבר שלוקח זמן ועלול שלא ליצור רמות חרדה הניתנות לשחזור (כלומר, שונות משמעותית בין עכברים)15.

רבים ממודלי הבידוד החברתי הזמינים כיום מתחילים את תקופת הבידוד בהתפתחות המוקדמת, בין תקופת היילודים לתקופת היילודים והמתבגרים. מודלים כאלה של בידוד בשלב מוקדם בחיים גורמים להתנהגויות דיכאוניות ודמויות חרדה, להתנהגויות של הימנעות חברתית ולתסמינים נוירופסיכיאטריים אחרים המשקפים הפרעות חרדה, דיכאון, אוטיזם והפרעות נפשיות נלוות28. בעוד ששיטת הבידוד החברתי בתחילת החיים מבוססת ונפוצה היטב, היא אינה משקפת לחלוטין את התפתחות ההפרעות הנפשיות, שכן לא כל האנשים חווים הפרדה אימהית (בידוד חברתי) במהלך שנות ההתבגרות שלהם29. יתר על כן, ההשפעות שלהם משתנות בהתאם למין, זן, מין, ותדירות/משך הבידוד28. לדוגמה, מחקרים מסוימים מצאו שבידוד חברתי לאחר גמילה מגביר התנהגות תוקפנית בעכברי C57BL/6J, בעוד שאחרים הראו רק השפעה קטנה או ללא השפעה28. שונות זו נובעת ככל הנראה מהבדלים קלים בתדירות, במשך הזמן או במערך הדיור של תקופת הבידוד. מחקר אחר עם עכברים בשלב הבוגר או בשלב מאוחר בחיים מצא כי בידוד חברתי מגביר היפראקטיביות, ללא התנהגויות דיכאוניות או חרדה לכאורה30. עכברים אלה לא היו מסוגלים לראות עכברים שכנים, בדומה למודל שלנו, אך השתמשו בעכברים היברידיים נקבות F1 C57BL/6J x 129S6/SvEvTac30, מה שמרמז על השונות בין זנים ומין. מחקר זה מקווה למזער את הווריאציות הללו על ידי הצעת שיטה עקבית.

החיסרון בטכניקה זו הוא שגורם הקול אינו מסולק. מכיוון שהכלובים אינם אטומים לרעש, בעלי חיים עדיין מסוגלים לשמוע זה את זה, ולכן ייתכן שאינם נמצאים בבידוד מוחלט. זה עשוי להיות מעניין לשלב כלוב אטום לרעש בפרוטוקול ולחקור את ההשפעות של בידוד שמיעתי על חרדה וקוגניציה. עם זאת, לצורך מודל זה, רק חושים חזותיים ואינטראקציות חסומים מכיוון שמודל זה אינו מודל חסך חושי, אלא מודל האוסר על אינטראקציה חברתית פנים אל פנים. המודל מתכוון לחקות את האינטראקציות החברתיות פנים אל פנים, שכן גירוי שמיעתי קיים בדרך כלל בחיי אדם. חיסרון נוסף הוא שפרוטוקול זה נבדק רק בעכברי C57BL/6 ובחולדות ספראג דאולי. כאמור, ההשפעות של בידוד חברתי יכולות להשתנות בהתאם למינים ולזן. אף על פי שלא ניתן להבטיח את שכפולו של פרוטוקול זה במינים/זנים אחרים של מכרסמים, ניתן לאשר כי ניתן לשחזר מודל זה באופן עקבי בשני בעלי חיים אלה.

מכיוון שבעלי החיים הפגינו קוגניציה וזיכרון מופחתים, מודל זה עשוי להתפתח כמודל לפגיעה קוגניטיבית קלה. למרות שנדרשת אופטימיזציה נוספת, המודל עשוי להיות שימושי לחקר המנגנון של פגיעה קוגניטיבית הנגרמת על ידי בידוד חברתי, אולי מאפיזודות מצטברות של מתח וחרדה. המודל עשוי לשמש גם כדי לחקור את ההשפעה של בידוד חברתי מאוחר יותר בחיים על התנהגויות חברתיות, תוקפנות או אלימות.

באופן כללי, ניתן ליישם את מודל עכברי החרדה המושרה על ידי בידוד חברתי לחקר חרדה והפרעות נלוות באופן לא פולשני, המטופל באופן מינימלי, ומטרתו לחקות במדויק חרדה הנגרמת מבידוד חברתי ובדידות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי מענק המכון הלאומי לבריאות AA17991 (ל- J.L.), קרן ביוטכנולוגיה נטולת דאגות (ל- J.L.), אוניברסיטת דרום קליפורניה (USC), פרס נסיעות / מחקר של בית הספר לתארים מתקדמים של USC (ל- S.W.) מלגת שליחות תרבותית של ערב הסעודית (ל- A.A.O.), ותוכנית מלגות למקצועות הבריאות של הצבא (ל- A.S.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black Plastic Bags Office Depot 791932 24" x 32"
Elevated Plus Maze SD Instruments NA Black color
Open Field enclosure SD Instruments NA White color
Select Agar Invitrogen 30391-023
Square cotton for nesting (nestlet) Ancare Corporation NC9365966 Divide a 2" square piece into 4 pieces to create a 1" square piece for isolation group
Sucrose Sigma S1888-1KG
Weigh boat SIgma HS1420A Small, square white polystyrene

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Craske, M. G., et al. Anxiety disorders. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 17024 (2017).
  2. Kasper, S., den Boer, J., Ad Sitsen, J. Handbook of Depression and Anxiety: A Biological Approach. , Marcel Dekker Inc. New York. (2003).
  3. Konnopka, A., König, H. Economic burden of anxiety disorders: a systematic review and meta-analysis. Pharmacoeconomics. 38 (1), 25-37 (2020).
  4. Batterham, P. J., et al. Effects of the COVID-19 pandemic on suicidal ideation in a representative Australian population sample-Longitudinal cohort study. Journal of Affective Disorders. 300, 385-391 (2022).
  5. Ismail, I. I., Kamel, W. A., Al-Hashel, J. Y. Association of COVID-19 pandemic and rate of cognitive decline in patients with dementia and mild cognitive impairment: a cross-sectional study. Gerontology and Geriatric Medicine. 7, 23337214211005223 (2021).
  6. NIMH. Anxiety Disorders. , Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/topics/anxiety-disorders/index.shtml (2018).
  7. Roy-Byrne, P. Treatment-refractory anxiety; definition, risk factors, and treatment challenges. Dialogues in Clinical Neuroscience. 17 (2), 191-206 (2015).
  8. Cassano, G. B., Baldini Rossi, N., Pini, S. Psychopharmacology of anxiety disorders. Dialogues in Clinical Neuroscience. 4 (3), 271-285 (2002).
  9. Garakani, A., et al. Pharmacotherapy of anxiety disorders: current and emerging treatment options. Frontiers in Psychiatry. 11, 595584 (2020).
  10. Hutson, P. H., Clark, J. A., Cross, A. J. CNS target identification and validation: avoiding the valley of death or naive optimism. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57 (1), 171-187 (2017).
  11. Hart, P. C., et al. Experimental models of anxiety for drug discovery and brain research. Mouse Models for Drug Discovery: Methods and Protocols. Proetzel, G., Wiles, M. V. , Springer. New York. 271-291 (2016).
  12. Scherma, M., Giunti, E., Fratta, W., Fadda, P. Gene knockout animal models of depression, anxiety and obsessive compulsive disorders. Psychiatric Genetics. 29 (5), 191-199 (2019).
  13. Liu, W. -Z., et al. Identification of a prefrontal cortex-to-amygdala pathway for chronic stress-induced anxiety. Nature Communications. 11 (1), 2221 (2020).
  14. Zheng, Z. -H., et al. Neuroinflammation induces anxiety- and depressive-like behavior by modulating neuronal plasticity in the basolateral amygdala. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 505-518 (2021).
  15. Toth, I., Neumann, I. D. Animal models of social avoidance and social fear. Cell and Tissue Research. 354 (1), 107-118 (2013).
  16. Wang, F., Kessels, H. W., Hu, H. The mouse that roared: neural mechanisms of social hierarchy. Trends in Neurosciences. 37 (11), 674-682 (2014).
  17. Endo, N., et al. Multiple animal positioning system shows that socially-reared mice influence the social proximity of isolation-reared cagemates. Communications Biology. 1 (1), 225 (2018).
  18. Netser, S., et al. Distinct dynamics of social motivation drive differential social behavior in laboratory rat and mouse strains. Nature Communications. 11 (1), 5908 (2020).
  19. Krimberg, J. S., Lumertz, F. S., Orso, R., Viola, T. W., de Almeida, R. M. M. Impact of social isolation on the oxytocinergic system: A systematic review and meta-analysis of rodent data. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 134, 104549 (2022).
  20. Mumtaz, F., Khan, M. I., Zubair, M., Dehpour, A. R. Neurobiology and consequences of social isolation stress in animal model-A comprehensive review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 105, 1205-1222 (2018).
  21. Ranade, S. Comforting in mice. Nature Neuroscience. 24 (12), 1640 (2021).
  22. Al Omran, A. J., et al. Social isolation induces neuroinflammation and microglia overactivation, while dihydromyricetin prevents and improves them. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 2 (2022).
  23. Watanabe, S., et al. Dihydromyricetin improves social isolation-induced cognitive impairments and astrocytic changes in mice. Scientific Reports. 12 (1), 5899 (2022).
  24. Silva, J., et al. Modulation of hippocampal GABAergic neurotransmission and gephyrin levels by dihydromyricetin improves anxiety. Frontiers in Pharmacology. 11, 1008 (2020).
  25. Porter, V. R., et al. Frequency and characteristics of anxiety among patients with Alzheimer's disease and related dementias. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 15 (2), 180-186 (2003).
  26. Hossain, M. M., et al. Prevalence of anxiety and depression in South Asia during COVID-19: A systematic review and meta-analysis. Heliyon. 7 (4), 06677 (2021).
  27. NHGRI. Knockout Mice Fact Sheet. , Available from: https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Knockout-Mice-Fact-Sheet (2020).
  28. Takahashi, A. Social stress and aggression in murine models. Current Topics in Behavioral Neuroscience. 54, 181-208 (2022).
  29. Lam, R. W. Challenges in the treatment of anxiety disorders: beyond guidelines. International Journal of Psychiatry in Clinical Practice. 10, 18-24 (2006).
  30. Sullens, D. G., et al. Social isolation induces hyperactivity and exploration in aged female mice. PLoS One. 16 (2), 0245355 (2021).

Tags

מדעי המוח גיליון 189
מודל בידוד חברתי: מודל מכרסם לא פולשני של מתח וחרדה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Watanabe, S., Al Omran, A., Shao, A. … More

Watanabe, S., Al Omran, A., Shao, A. S., Liang, J. Social Isolation Model: A Noninvasive Rodent Model of Stress and Anxiety. J. Vis. Exp. (189), e64567, doi:10.3791/64567 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter