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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Propagation des virus et quantification colorimétrique cellulaire

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64578
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

Le présent protocole décrit la propagation du virus Zika (ZIKV) dans les cellules rénales de singes verts d’Afrique et la quantification du virus Zika à l’aide de méthodes d’immunodétection colorimétrique cellulaires dans des formats à 24 puits et 96 puits (haut débit).

Abstract

Le virus Zika (ZIKV) est un virus transmis par les moustiques appartenant au genre Flavivirus. L’infection par le virus Zika a été associée à des anomalies cérébrales congénitales et potentiellement au syndrome de Guillain-Barré chez l’adulte. La recherche sur le virus Zika pour comprendre les mécanismes de la maladie est importante pour faciliter la mise au point d’un vaccin et d’un traitement. La méthode de quantification des virus est cruciale et fondamentale dans le domaine de la virologie. Le test de formation de foyer (FFA) est un test de quantification virale qui détecte l’antigène viral avec des anticorps et identifie les foyers d’infection des cellules à l’aide de la technique d’immunomarquage de la peroxydase. La présente étude décrit le protocole de propagation et de quantification du virus à l’aide de formats à 24 puits et à 96 puits (haut débit). Comparé à d’autres études similaires, ce protocole a décrit plus en détail l’optimisation de la taille des foyers, ce qui peut servir de guide pour étendre l’utilisation de ce test à d’autres virus. Tout d’abord, la propagation du ZIKV est effectuée dans les cellules Vero pendant 3 jours. Le surnageant de culture contenant le virus Zika est récolté et quantifié à l’aide de l’AGL. Brièvement, la culture virale est inoculée sur les cellules Vero et incubée pendant 2 à 3 jours. La formation des foyers est ensuite déterminée après des processus de coloration optimisés, y compris la fixation cellulaire, la perméabilisation, le blocage, la liaison aux anticorps et l’incubation avec un substrat de peroxydase. Les foyers de virus colorés sont visualisés à l’aide d’un stéréomicroscope (comptage manuel au format 24 puits) ou d’un analyseur logiciel (comptage automatisé au format 96 puits). Le FFA fournit des résultats reproductibles et relativement rapides (3-4 jours) et peut être utilisé pour différents virus, y compris les virus non plaques. Par la suite, ce protocole est utile pour l’étude de l’infection par le virus Zika et pourrait être utilisé pour détecter d’autres virus cliniquement importants.

Introduction

L’infection par le virus Zika (ZIKV) est une maladie virale émergente transmise par les moustiques. Le premier isolement du virus Zika a eu lieu en Ouganda en 1947 1,2 ; Elle est restée négligée de 1947 à 2007, car les symptômes cliniques sont le plus souvent asymptomatiques et caractérisés par une maladie fébrile spontanément résolutive. En 2007, l’épidémie de Zika a commencé dans les îles Yap 3,4, suivie d’épidémies plus importantes dans les régions du Pacifique (Polynésie française, île de Pâques, îles Cook et Nouvelle-Calédonie) de 2013 à 2014 5,6,7,8, où la complication neurologique sévère du syndrome de Guillain-Barré (SGB) a été signalée chez l’adulte pour la première fois 9. En 2015 et 2016, la première épidémie généralisée de virus Zika a balayé les Amériques après l’émergence du génotype asiatique du virus Zika au Brésil dès 201310. Au cours de cette épidémie, 440 000 à 1,3 million de cas de microcéphalie et d’autres troubles neurologiques ont été signalés chez les nouveau-nés11. À l’heure actuelle, il n’existe pas de remède ou de traitement spécifique pour l’infection par le virus Zika ; Il existe donc un besoin médical urgent de vaccins contre le virus Zika capables de prévenir les infections, en particulier pendant la grossesse.

La quantification virale est un processus permettant de déterminer le nombre de virus présents dans un échantillon. Il joue un rôle important dans la recherche, et les laboratoires académiques impliquent de nombreux domaines, tels que la médecine et les sciences de la vie. Ce processus est également important dans les secteurs commerciaux, tels que la production de vaccins viraux, de protéines recombinantes, d’antigènes viraux ou d’agents antiviraux. De nombreuses méthodes ou tests peuvent être utilisés pour la quantification du virus12. Le choix des méthodes ou des essais dépend normalement des caractéristiques du virus, du niveau de précision souhaité et de la nature de l’expérience ou de la recherche. En général, les méthodes de quantification des virus peuvent être divisées en deux catégories : les tests moléculaires qui détectent la présence d’acide nucléique viral (ADN ou ARN) et les tests qui mesurent l’infectivité virale in vitro12. La réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR, pour l’ADN) ou la réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse quantitative (qRT-PCR, pour l’ARN)13 et la PCR par gouttelettes numériques14 sont des exemples de techniques moléculaires couramment utilisées pour quantifier l’acide nucléique viral dans un échantillon donné15. Cependant, ces techniques moléculaires très sensibles ne permettent pas de faire la différence entre les virus viables et non viables15. Par conséquent, les recherches qui nécessitent des informations sur les caractéristiques biologiques, telles que l’infectivité du virus sur les cellules, ne peuvent pas être menées à bien à l’aide des techniques moléculaires susmentionnées ; Des tests permettant de mesurer et de déterminer la présence de virus viables sont nécessaires. Les tests qui mesurent l’infectivité du virus comprennent le test de formation de plaque (PFA), la dose infectieuse de culture tissulaire à 50 % (TCID50), le test de focalisation fluorescente et la microscopie électronique à transmission (MET)12.

Le PFA, mis au point par Renato Dulbecco en 1952, est l’une des méthodes les plus couramment utilisées pour le titrage du virus, y compris pour le virus Zika16. Il est utilisé pour déterminer directement les concentrations virales des virions lytiques infectieux. La méthode est basée sur la capacité d’un virus lytique à produire des effets cytopathiques (CPEs, zones de mort cellulaire ou plaques, zone d’infection entourée de cellules non infectées) dans une monocouche cellulaire inoculée après une infection virale. Cependant, le test présente plusieurs inconvénients qui affectent son utilité. Le test prend du temps (environ 7 à 10 jours, selon les virus), dépend du CPE et est sujet aux erreurs. Dans la présente étude, nous rapportons une technique immunocolorimétrique, le test de formation de foyer (FFA), pour la détection et la quantification du virus Zika dans des formats de plaques à 24 puits et de plaques à 96 puits.

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Protocol

1. Propagation du virus

  1. Préparation des cellules
    1. Cultiver des cellules Vero dans un flacon de culture de2 cellules de 75 cm contenant 12 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 2 mM de L-glutamine (voir le tableau des matériaux). Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2.
    2. Surveiller les cellules au microscope ; une fois que les cellules atteignent 70 % à 90 % de confluence, elles sont prêtes à être utilisées (Figure 1A).
      REMARQUE : Les cellules Vero doublent environ toutes les 24 h17. Des dilutions de 1 :10 devraient prendre 3 à 4 jours pour atteindre une confluence de 80 % à 90 % dans une fiole de 75 cm2 . Surveillez les cellules tous les jours ou tous les deux jours.
  2. Infection de la monocouche cellulaire
    1. Retirer le milieu de culture du flacon de culture cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml. Rincez le flacon avec 3 mL de solution saline tamponnée au phosphate (dPBS) de Dulbecco 2 fois à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL.
      REMARQUE : Un bécher contenant de l’hypochlorite de sodium à 10 % doit être préparé pour désinfecter tout déchet liquide infectieux jeté dans les flacons ou les assiettes.
    2. Ajouter 2 mL de DMEM sans sérum (DMEM complété par 2 mM de L-glutamine sans FBS) et 20 μL d’inoculum de ZIKV dans le flacon de culture cellulaire. Incuber le flacon en le balançant doucement pendant 1 h à température ambiante pour permettre l’adsorption du virus.
      NOTA : Le titrage du stock initial de virus Zika sera utile pour déterminer le volume d’ajout d’inoculum de virus Zika (étape 2).
      MISE EN GARDE : Le virus Zika est classé comme agent pathogène de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Toutes les procédures impliquant des matières contenant le virus Zika doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité certifiée et suivre toutes les procédures opérationnelles normalisées (SOP) du laboratoire avec l’équipement de protection individuelle approprié.
  3. Ajout du support de recouvrement
    1. Après 1 h d’incubation, retirer et jeter l’inoculum viral dilué à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml. Rincer le flacon de culture cellulaire avec 3 mL de dPBS 2x.
    2. Ajouter 12 mL de milieu d’entretien (DMEM complété par 2 % de FBS, 2 mM de L-glutamine et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine) dans le flacon de culture cellulaire pour maintenir les cellules infectées.
    3. Incuber les cellules Vero infectées pendant 3 jours dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2.
      REMARQUE : Surveillez quotidiennement le CPE des cellules Vero infectées au microscope.
  4. Récolte d’un surnageant de culture cellulaire contenant le virus Zika
    1. Au jour 3 après l’infection, un arrondi et un décollement cellulaires (CPE) peuvent être observés (Figure 1B-D). Prélever le surnageant de culture cellulaire contenant le virus Zika dans un tube à centrifuger de 50 mL à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
    2. Utilisez un filtre à seringue en polyéthersulfone de 0,22 μm (voir le tableau des matériaux) pour filtrer le surnageant de culture cellulaire. Aliquote 500 μL du surnageant de culture cellulaire filtré dans des tubes à bouchon à vis de 2,0 mL et conserver à -80 °C jusqu’à une nouvelle utilisation.
      REMARQUE : Le virus Zika récolté peut être conservé à une température de -80 °C pour un stockage à long terme.
      ATTENTION : Des précautions supplémentaires doivent être prises si une aiguille de seringue est utilisée, car l’aiguille peut perforer la peau. Des SOP de laboratoire doivent être établies.

2. Quantification des virus

  1. Préparation des cellules
    1. Semer les cellules Vero dans des plaques désignées (plaque à 24 puits : 0,5 mL/puits, 7,5 x 104 cellules/puits ; plaque à 96 puits : 0,1 mL/puits, 1,5 x 104 cellules/puits) et incuber la plaque pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2.
      REMARQUE : Il y a cinq points temporels différents à tester (plaque à 24 puits : 48 h, 60 h, 72 h, 84 h et 96 h après l’infection ; plaque à 96 puits : 24 h, 36 h, 48 h, 60 h et 72 h après l’infection) ; Par conséquent, préparez une assiette pour chaque point de temps.
    2. Après l’incubation de 24 h et une fois que les cellules ont atteint une confluence de 70 % à 90 % (Figure 1E), la plaque est prête pour l’infection. Procéder à la préparation du stock de virus dilué (étape 2.2) avant l’infection de la monocouche cellulaire.
  2. Dilution du virus
    1. Pour les plaques à 24 et 96 puits, préparez six tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 mL pour chaque plaque afin d’effectuer une dilution dix fois supérieure (10-1 à 10-5), y compris un témoin négatif. Pour la configuration expérimentale d’une plaque à 24 puits, ajoutez 450 μL de DMEM sans sérum dans les six tubes de microcentrifugation. Pour la configuration expérimentale d’une plaque à 96 puits, ajoutez 135 μL de DMEM sans sérum dans six tubes.
      REMARQUE : Étiquetez clairement chaque tube pour indiquer la dilution de son contenu avant d’effectuer la dilution en série décuplée.
    2. Pour effectuer la dilution en série, pour la configuration de l’expérience sur plaque à 24 puits, ajouter 50 μL de stock de ZIKV qui a été récolté à l’étape 1 dans le tube 10-1 qui contient 450 μL de DMEM sans sérum. Pour la configuration expérimentale sur plaque à 96 puits, ajoutez 15 μL de stock de ZIKV dans le tube 10-1 qui contient 135 μL de DMEM sans sérum.
    3. Vortex chaque tube pour mélanger le virus et le milieu. Il s’agit de la première dilution décuplée.
      REMARQUE : Un mélange approprié du virus et du milieu de culture dans chaque tube de dilution est nécessaire pour assurer une dilution en série précise.
    4. Pour la configuration de l’expérience sur plaque à 24 puits, utiliser une pointe de pipette neuve pour remettre le tube 10-1 en suspension et transférer 50 μL de ZIKV dilué dans le tube 10-2 comme deuxième dilution décuplée. Pour la configuration de l’expérience sur plaque à 96 puits, utiliser une pointe de pipette neuve pour remettre le tube 10-1 en suspension et transférer 15 μL de ZIKV dilué dans le tube 10-2 comme deuxième dilution décuplée.
    5. Répétez l’étape 2.2.4 quatre fois jusqu’au cinquième tube (exclure le contrôle négatif).
      REMARQUE : Utilisez un nouvel embout de pipette après chaque étape de pipetage pour éviter la contamination croisée.
  3. Infection de la monocouche cellulaire
    1. Retirer et jeter le milieu conditionné de chaque puits (plaque à 24 puits : 0,5 ml/puits ; plaque à 96 puits : 0,1 ml/puits).
    2. Rincez chaque puits avec dPBS 2x (plaque à 24 puits : 300 μL/puits ; plaque à 96 puits : 60 μL/puits).
    3. En procédant de la dilution la plus élevée à la dilution la plus faible, ajouter chaque inoculum de virus dilué en série dans le puits (plaque à 24 puits : 200 μL/puits ; plaque à 96 puits : 40 μL/puits).
      REMARQUE : L’infection de chaque dilution sera effectuée dans des puits dupliqués. Maintenir deux puits non infectés comme témoin négatif. Étiquetez clairement la plaque et les puits pour éviter toute confusion. Changez les pointes de pipette après chaque étape de pipetage pour éviter la contamination croisée.
    4. Incuber la plaque en la balançant doucement pendant 1 h à température ambiante pour permettre l’adsorption du virus.
  4. Ajout du milieu de culture cellulaire de recouvrement
    1. Après 1 h d’incubation, retirez et jetez la suspension virale de la concentration la plus faible à la plus élevée.
    2. Laver les cellules infectées avec dPBS 2x (plaque à 24 puits : 300 μL/puits ; plaque à 96 puits : 60 μL/puits).
    3. Recouvrir le puits de DMEM (complété par 2 % de FBS, 2 mM de L-glutamine et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine) et 1,5 % de carboxyméthylcellulose à faible viscosité (CMC ; voir le tableau des matériaux) (plaque à 24 puits : 1 mL/puits ; plaque à 96 puits : 0,2 mL/puits).
    4. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2.
      REMARQUE : Ne dérangez pas la plaque pendant cette période d’incubation.
    5. Sortez la plaque de l’incubateur de culture cellulaire pour la coloration à différents moments (plaque à 24 puits : 48 h, 60 h, 72 h, 84 h et 96 h après l’infection ; plaque à 96 puits : 24 h, 36 h, 48 h, 60 h et 72 h après l’infection).

3. Coloration

  1. Fixation cellulaire
    1. Après les heures spécifiques d’incubation (plaque à 24 puits : 48 h, 60 h, 72 h, 84 h et 96 h après l’infection ; plaque à 96 puits : 24 h, 36 h, 48 h, 60 h et 72 h après l’infection), retirez et jetez le milieu de recouvrement et lavez les cellules 3 fois avec 1 PBS. Pour la plaque à 96 puits, retirez et jetez le milieu de recouvrement et lavez les cellules 3 fois avec 60 μL/puits de 1x PBS avec une pipette multicanaux.
    2. Ajouter 4 % de paraformaldéhyde pour fixer les cellules (plaque à 24 puits : 300 μL/puits ; plaque à 96 puits : 60 μL/puits). Incuber l’assiette à température ambiante pendant 20 min.
      ATTENTION : Le paraformaldéhyde est un formaldéhyde polymérisé solide. Il s’agit d’une poudre cristalline inflammable, solide et blanche qui libère du formaldéhyde gazeux lorsqu’elle est mélangée à de l’eau ou chauffée. Toutes les procédures impliquant l’utilisation de paraformaldéhyde doivent être effectuées dans une hotte chimique certifiée ou dans des enceintes d’évacuation approuvées conformément aux SOP de laboratoire spécifiques aux produits chimiques contenant du formaldéhyde.
    3. Après 20 min, jetez le paraformaldéhyde et lavez les cellules 3x avec 1x PBS. Effectuez la perméabilisation, le blocage et l’incubation d’anticorps en suivant les étapes 3.2 à 3.5.
      REMARQUE : Lorsque vous jetez du paraformaldéhyde à 4%, suivez la procédure d’élimination des déchets de l’université ou de l’institut.
  2. Perméabilisation cellulaire
    1. Ajouter 1 % de poly(éthylèneoxy)éthanol d’octylphénoxy (voir le tableau des matériaux) pour perméabiliser les cellules (plaque à 24 puits : 200 μL/puits ; plaque à 96 puits : 40 μL/puits). Incuber l’assiette à température ambiante pendant 15 min.
    2. Après 15 min, jetez le poly(éthylèneoxy)éthanol octylphénoxy et lavez les cellules 3x avec 1x PBS.
  3. Bloquant
    1. Ajouter du lait écrémé à 3 % pour réduire la liaison non spécifique dans l’échantillon (plaque à 24 puits : 500 μL/puits ; plaque à 96 puits : 100 μL/puits). Incuber l’assiette à température ambiante pendant 2 h.
    2. Après 2 h, jetez le lait écrémé à 3 % et lavez les cellules 3 fois avec 1 PBS.
      REMARQUE : Il s’agit d’un point d’arrêt. Après avoir ajouté du lait écrémé à 3 %, les plaques peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à 2 jours avant l’insertion primaire de l’anticorps.
  4. Incubation primaire d’anticorps
    1. Ajouter l’anticorps monoclonal anti-flavivirus, 4G2 (clone D1-4G2-4-15 ; anticorps primaire, voir le tableau des matériaux) dilué dans du lait écrémé à 1 % (rapport 1 :1 000) (plaque à 24 puits : 200 μL/puits ; plaque à 96 puits : 40 μL/puits). Incuber l’assiette à 37 °C pendant 1 h.
    2. Après 1 h, retirez la solution contenant l’anticorps monoclonal et lavez les cellules 3 fois avec 1 PBS.
  5. Incubation secondaire d’anticorps
    1. Ajouter l’anticorps secondaire IgG anti-souris de chèvre conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (voir la table des matériaux) dilué dans du lait écrémé à 1 % (rapport 1 :1 000) (plaque à 24 puits : 200 μL/puits ; plaque à 96 puits : 40 μL/puits). Incuber les plaques à 37 °C pendant 1 h.
    2. Après 1 h, retirez la solution contenant l’anticorps secondaire et lavez les cellules 3x avec 1x PBS.
  6. Incubation sur substrat
    1. Ajouter le substrat de peroxydase 3,3'diaminobenzidine (DAB) (voir tableau des matériaux) et incuber la plaque pendant 30 min dans l’obscurité (plaque à 24 puits : 200 μL/puits ; plaque à 96 puits : 40 μL/puits). Après 30 min, arrêtez la réaction en lavant les puits avec de l’eau.
    2. Séchez les plaques à l’air libre pendant la nuit et procédez au dénombrement des foyers une fois que les plaques sont complètement sèches.

4. Détermination du titre du virus

  1. Processus manuel de comptage des foyers (format 24 puits)
    1. Les foyers peuvent être visualisés au microscope stéréoscopique. Sélectionnez la dilution qui produit 50 à 200 foyers.
    2. Comptez les foyers pour chaque répétition de la dilution sélectionnée. Calculer le nombre moyen de foyers pour chacune des dilutions sélectionnées.
    3. Calculer l’unité formant foyer par mL (FFU/mL) pour chaque échantillon avec la formule ci-dessous : FFU/mL = nombre moyen de foyers comptés/(dilution x volume de virus dilué ajouté).
  2. Processus automatisé de comptage des foyers (format 96 puits)
    1. Scannez la plaque à 96 puits à l’aide d’un analyseur logiciel commercial.
      1. Double-cliquez sur le logiciel (voir Table des matériaux) pour l’ouvrir.
      2. Cliquez sur Changer de suite et assurez-vous que la suite est basculée vers l’une des suites qui s’applique (Figure supplémentaire 1A). Cliquez sur OK.
      3. Lancez l’analyse en cliquant sur Numériser > Numérisation complète (Figure 1B supplémentaire).
      4. Cliquez sur Tableau de bord pour vous assurer que le format de capture est le format à 96 puits (Figure supplémentaire 2A).
      5. Sélectionnez le mode de centrage « Préalignement automatique vérifié par l’utilisateur » (Figure supplémentaire 2B).
      6. Cliquez sur Éjecter pour charger la plaque.
        REMARQUE : Ouvrez le couvercle de l’assiette et placez-le vers le haut avec la rangée A en haut (figure supplémentaire 3A).
      7. Entrez le nom de la plaque et cliquez sur OK. Cliquez sur Charger pour charger la plaque.
      8. Cliquez sur Démarrer pour lancer l’analyse. Après cela, calibrez les positions pour A1, A12 et H1 à l’aide des boutons « Haut, Bas, Gauche, Droite » et cliquez sur Confirmer (Figure supplémentaire 3B).
        REMARQUE : Le logiciel commencera à analyser chaque puits.
      9. Une fois la numérisation terminée, une image d’aperçu apparaîtra. Cliquez sur Fermer.
      10. Quittez l’analyse en cliquant sur Retour au standard.
    2. Comptez la plaque à 96 puits à l’aide du logiciel.
      1. Cliquez sur Count > Smart Count (Comptage intelligent).
      2. Sur le logiciel, il affichera « Étape 1 sur 5 : Sélectionner les plaques à compter ». Cliquez sur Plaque de chargement. Cochez l’ensemble du dossier et cliquez sur Sélectionner pour importer la plaque numérisée (Figure supplémentaire 4A).
      3. Sur le logiciel, il affichera « Étape 2 sur 5 : Définir les paramètres de comptage ». Cliquez sur Ajuster les paramètres, et les paramètres s’afficheront (processus diffus ; petit/normal/grand/plus grand/plus grand +1 ; séparation ponctuelle ; zone comptée ; équilibre de l’arrière-plan ; suppression des fibres ; gating).
        REMARQUE : Commencez avec un puits, et vérifiez d’avant en arrière pour trouver les meilleurs réglages pour tous les puits.
      4. Une fois cela fait, cliquez sur Suivant (Figure supplémentaire 4B).
      5. Sur le logiciel, il affichera « Étape 3 sur 5 : Sélectionner/désélectionner les puits ». Une fois la sélection du puits à compter terminée, cliquez sur Suivant pour continuer.
        NOTA : Les puits sélectionnés pour être comptés apparaîtront avec un « C » dans le coin supérieur droit de chaque puits (figure supplémentaire 5A).
      6. Sur le logiciel, il affichera « Étape 4 sur 5 : Paramètres de sortie ». Cliquez sur Afficher/Modifier les paramètres de sortie pour vérifier si les paramètres (tels que le format d’image) sont appropriés. Cliquez sur Enregistrer et quittez > suivant (Figure supplémentaire 5B).
      7. Sur le logiciel, il affichera « Étape 5 sur 5 : Démarrer AutoCount ». Cliquez sur Start AutoCount (Figure supplémentaire 6A).
      8. Une fois terminé, cliquez sur Quitter AutoCount.
  3. Effectuer le contrôle de la qualité (CQ) dans l’analyseur de logiciels commerciaux.
    1. Sur la page du standard, cliquez sur Contrôle de la qualité > Ajouter une ou plusieurs plaques. Cochez tout le dossier pour importer la plaque comptée, cliquez sur Sélectionner > Démarrer QC (Figure supplémentaire 6B).
    2. Double-cliquez sur chaque puits pour auditer les spots. Cliquez sur Compter pour supprimer les taches. Le logiciel commencera à compter.
      REMARQUE : Assurez-vous que « Spots : Supprimer » est coché. L’achèvement du comptage peut être indiqué par le nombre de foyers comptés, par exemple « 30 » (figure supplémentaire 7A).
    3. Une fois le comptage terminé (indiqué par le nombre de foyers comptés, par exemple « 30 »), cliquez sur « Oui » pour supprimer les taches (figure supplémentaire 7B). Cliquez trois fois avec le bouton gauche de la souris sur l’endroit à supprimer. Cliquez avec le bouton droit de la souris pour terminer, puis cliquez sur Oui.
    4. Cliquez sur Plaque de finition et accédez à l’aperçu du projet une fois le contrôle qualité terminé.
  4. Effectuez des travaux d’imagerie à l’aide de l’analyseur logiciel.
    1. Vérifiez l’image numérisée, comptée et la plaque de contrôle qualité (Figure 2).

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Representative Results

Le virus Zika peut être quantifié à l’aide de l’AFL, comme le montre schématiquement la figure 3. Pour la plaque à 24 puits, les cellules Vero infectées ont été fixées à 48 h, 60 h, 72 h, 84 h et 96 h après l’infection. Les résultats ont montré que les cellules sont restées intactes (aucun détachement cellulaire n’a été observé) 96 h (4 jours) après l’infection (figure 4 et figure supplémentaire 8A-E). L’apparition de foyers infectieux a été observée pour la première fois 48 h (2 jours) après l’infection (Figure 4A-F). Cependant, la taille des foyers était trop petite, ce qui rendait difficile le dénombrement précis des foyers. La taille optimale des foyers a été atteinte 60 h (2,5 jours) après l’infection (figure 4B). Aux derniers moments (72 h, 84 h et 96 h après l’infection), les foyers étaient plus grands et avaient tendance à fusionner ou à se chevaucher. Les foyers fusionnés ou superposés ont augmenté au fil du temps (figure 4C-E). Par conséquent, les foyers formés 60 h (2,5 jours) après l’infection ont été choisis pour déterminer le titre du virus Zika dans une plaque à 24 puits (figure 4B).

Pour la plaque à 96 puits, les cellules Vero infectées ont été fixées à 24 h, 36 h, 48 h, 60 h et 72 h après l’infection. Les résultats ont montré que les cellules restaient intactes 72 h (3 jours) après l’infection (figure 5A-F et figure supplémentaire 9A-E). L’apparition de foyers infectieux a été observée pour la première fois 24 h (1 jour) après l’infection (figure 5A). Cependant, la taille des foyers était trop petite jusqu’à 36 h (1,5 jour) après l’infection, ce qui rendait difficile la détermination précise du nombre de foyers (figure 5A,B). La taille optimale des foyers a été atteinte 48 h (2 jours) après l’infection (figure 5C). À ces derniers moments (60 h et 72 h après l’infection), on a observé des foyers qui se chevauchaient ou qui se confondaient, et le nombre de foyers qui se chevauchaient augmentait avec le temps (figures 5D, E). Par conséquent, les foyers formés 48 h (2 jours) après l’infection ont été choisis pour déterminer le titre du virus des isolats de ZIKV (figure 5C). La formation des foyers peut être visualisée et énumérée à l’aide d’analyseurs logiciels commerciaux comme alternative.

Figure 1
Figure 1 : Image microscopique des cellules Vero. (A) Les cellules Vero à un grossissement de 40x ont montré une confluence de 70 % à 90 % dans une fiole de culture cellulaire de 75 cm2 pour la propagation du virus. (B) CPE sur les cellules Vero après avoir été infectées par le virus Zika le jour 1 après l’infection à un grossissement de 100x. (C) CPE sur les cellules Vero après avoir été infectées par le virus Zika le jour 2 après l’infection à un grossissement de 100x. (D) CPE sur les cellules Vero après avoir été infectées par le virus Zika le jour 3 après l’infection à un grossissement de 100x. (E) Les cellules Vero à un grossissement de 40x ont montré une confluence de 70 % à 90 % dans une plaque à 24 puits après 24 h d’incubation pour la quantification du virus. Barre d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Image d’une plaque de contrôle numérisée, comptée et post-qualité au format 96 puits à l’aide d’un analyseur logiciel commercial. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Déroulement de la coloration pour le test de formation des foyers. Les processus de coloration, y compris la fixation cellulaire, la perméabilisation, le blocage, la liaison aux anticorps et l’incubation avec un substrat de peroxydase. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Dosage de la formation de foyers pour le virus Zikv P6-740 dans des plaques à 24 puits à différents moments. (A) Les foyers sont moins distincts le jour 2 (48 h) après l’infection. (B) La taille optimale des foyers peut être observée le jour 2,5 (60 h) après l’infection. (C-E) Les foyers ont fusionné le jour 3 (72 h), le jour 3,5 (84 h) et le jour 4 (96 h) après l’infection. (F) Contrôle négatif de la plaque. Barre d’échelle : 1 000 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Essai de formation de foyers pour le ZIKV P6-740 dans des plaques à 96 puits à différents moments. (A) Les foyers sont moins distincts pour être comptés sur l’analyseur de logiciel commercial le jour 1 (24 h) après l’infection. (B) Les foyers sont moins distincts pour être comptés sur l’analyseur logiciel commercial au jour 1,5 (36 h) après l’infection. (C) La taille optimale des foyers peut être observée au jour 2 (48 h) après l’infection. (D,E) Les foyers ont fusionné au jour 2,5 (60 h) et au jour 3 (72 h) après l’infection. (F) Contrôle négatif de la plaque. Barre d’échelle : 1 000 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Captures d’écran de la page de démarrage de l’analyseur de logiciels commerciaux. (A) Basculez la suite vers n’importe quelle suite applicable sur l’analyseur de logiciels commerciaux. Cliquez sur « OK » une fois que vous avez terminé. (B) Pour commencer à numériser sur l’analyseur logiciel commercial, cliquez sur « Numériser », puis sur « Numérisation complète de la plaque ». Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Captures d’écran permettant d’afficher le « format de capture » et le mode de centrage sélectionné comme « Préalignement automatique vérifié par l’utilisateur » sur l’analyseur du logiciel commercial. (A) Pour afficher le format de capture, cliquez sur « Tableau de bord » et sélectionnez le format à 96 puits comme format de capture. (B) Pour le mode de centrage, sélectionnez « Préalignement automatique vérifié par l’utilisateur ». Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Placement de la plaque à 96 puits sur le plateau de lecture de plaques de l’analyseur du logiciel commercial et capture d’écran pour calibrer les positions des puits A1, A12 et H1. (A) Placez l’assiette vers le haut avec la rangée A en haut. (B) Pour calibrer les positions des puits A1, A12 et H1, utilisez les boutons « Haut, Bas, Gauche, Droite ». Une fois cela fait, cliquez sur « Confirmer ». Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 4 supplémentaire : Captures d’écran pour sélectionner des dossiers contenant des plaques numérisées pour le comptage sur l’analyseur de logiciel commercial et « Étape 2 sur 5 : Définir les paramètres de comptage ». (A) Pour compter les plaques numérisées, cliquez sur « Plaque de charge ». Cochez l’ensemble du dossier et cliquez sur « Sélectionner » pour importer les plaques numérisées. (B) Ajustez les paramètres de comptage. Cliquez sur « Suivant » une fois les paramètres définis. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 5 supplémentaire : Captures d’écran de l’analyseur de logiciels commerciaux « Étape 3 sur 5 : Sélectionner/désélectionner les puits » et « Étape 4 sur 5 : Paramètres de sortie ». (A) Sélectionnez et désélectionnez les puits à compter et cliquez sur « Suivant » une fois terminé. (B) Pour les paramètres de sortie, cliquez sur « Afficher/Modifier les paramètres de sortie » pour vérifier si les paramètres sont appropriés (par exemple, le format d’image). Cliquez sur « Enregistrer et quitter » une fois terminé, puis cliquez sur « Suivant ». Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 6 supplémentaire : Captures d’écran de l’analyseur de logiciels commerciaux « Étape 5 sur 5 : Démarrer le comptage automatique » et de la page de contrôle de la qualité. (A) Une fois que vous êtes prêt pour le comptage des plaques, cliquez sur « Démarrer le comptage automatique ». (B) Sur la page de contrôle de la qualité, cochez tout le dossier pour importer la plaque comptée, cliquez sur « Sélectionner », puis cliquez sur « Démarrer QC ». Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 7 supplémentaire : Captures d’écran de la page de contrôle de la qualité de l’analyseur de logiciels commerciaux. (A) Double-cliquez sur chaque puits pour vérifier les taches. Cliquez sur « Compter » pour supprimer n’importe quelle tache. Cochez la case « Spots : Supprimer ». (B) Cliquez trois fois avec le bouton gauche de la souris pour supprimer les taches. Faites un clic droit pour terminer, puis cliquez sur « Oui ». Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 8 supplémentaire : Essai de formation de foyers pour le ZIKV P6-740 dans des plaques à 24 puits à différents moments. Une dilution en série décuplée (10-1 à 10-5) a été réalisée sur le ZIKV P6-740 et l’infection a été réalisée sur des cellules Vero en double, y compris un témoin négatif. Une image de données brutes a été prise à l’aide d’un microscope stéréoscopique, la barre d’échelle indiquant 1 000 μm. (A) Jour 2 (48 h) après l’infection. (B) Jour 2,5 (60 h) après l’infection. (C) Jour 3 (72 h) après l’infection. (D) Jour 3,5 (84 h) après l’infection. (E) Jour 4 (96 h) après l’infection. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 9 : Essai de formation de foyers pour le ZIKV P6-740 dans des plaques à 96 puits à différents moments. Une dilution en série décuplée (10-1 à 10-5) a été réalisée sur le ZIKV P6-740 et l’infection a été réalisée sur des cellules Vero en double, y compris un témoin négatif. Une image de données brutes a été prise à l’aide d’un microscope stéréoscopique, la barre d’échelle indiquant 1 000 μm. (A) Jour 1 (24 h) après l’infection. (B) Jour 1,5 (36 h) après l’infection. (C) Jour 2 (48 h) après l’infection. (D) Jour 2,5 (60 h) après l’infection. (E) Jour 3 (72 h) après l’infection. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Il existe plusieurs tests pour déterminer le titre du virus ; le PFA a un protocole de quantification du virus similaire à celui du FFA, dans lequel l’inoculum du virus est dilué pour permettre de distinguer les plaques ou les foyers individuels. Après coloration, chaque plaque ou foyer indique une seule particule infectieuse dans l’inoculum19. Le PFA est coloré avec du violet cristallin pour visualiser la formation de plaque causée par la lyse cellulaire ou la mort. Par conséquent, le PFA prend plus de temps, car il faut plus de temps pour que le virus provoque des CPE, et il n’est limité qu’aux virus qui induisent la lyse ou la mort cellulaire. De nombreux laboratoires ont utilisé avec succès des AGL pour déterminer les titres de virus infectieux pour les flavivirus, y compris le virus ZIKV 19,20,21,22,23,24,25. La FFA est une méthode d’immunodétection colorimétrique basée sur les cellules qui détecte l’antigène viral avec des anticorps et, par conséquent, identifie les zones de foyers de cellules infectées à l’aide de la technique d’immunomarquage, mais pas les plaques12,26. Le FFA offre certains avantages pour le ZIKV par rapport au PFA. L’un des avantages évidents est qu’il est basé sur la reconnaissance par anticorps des composants viraux sans CPE discernables. En outre, l’utilisation d’anticorps spécifiques au virus est également utile pour identifier différents virus ou sérotypes viraux dans des populations mixtes27. Par conséquent, le FFA est plus spécifique que le PFA car il mesure toutes les infections virales et ne dépend pas des virus qui causent suffisamment de mort cellulaire pour former une plaque visible28. Le FFA a également une période d’incubation plus courte que le PFA, ce qui nécessite un CPE évident qui signifie la lyse et la mort cellulaires. Enfin, à l’aide d’une plaque à 96 puits, la méthode FFA offre l’avantage d’utiliser plus de répétitions et des dilutions plus importantes pour détecter et titrer le virus27,29. De plus, le test FFA rapporté peut être facilement adapté pour les tests de neutralisation du virus et les méthodes de dépistage des composés antiviraux. L’intégration d’instruments ou de logiciels de comptage cellulaire automatisés commerciaux ou gratuits peut encore améliorer la facilité d’utilisation (cohérence, précision, débit) de l’AFL et de ses méthodes associées.

Lorsque l’on compare la plaque à 24 puits à la plaque à 96 puits, il est important de noter que le format à 24 puits nécessite un plus grand nombre de cellules à cultiver dans des cultures monocouches, ainsi que de plus grandes quantités de milieux et de virus. Par conséquent, le format de plaque à 24 puits peut ne pas convenir à une utilisation avec des échantillons de volumes limités. Cette limitation peut être surmontée en utilisant le format à 96 puits, tel que décrit dans cet article. Tout d’abord, le format à 96 puits nécessite moins de matériau, ce qui en fait une option plus rentable. De plus, le comptage automatisé des foyers de virus colorés dans le format à 96 puits permet un débit élevé et une analyse rapide, ce qui n’est pas possible dans le format à 24 puits, qui nécessite un comptage manuel. Ce processus de comptage automatisé augmente également la reproductibilité et réduit la subjectivité par rapport au comptage manuel, ce qui permet d’obtenir des résultats plus précis et plus fiables de la FFA. Par conséquent, le format à 96 puits avec des systèmes d’imagerie automatisés est fortement recommandé pour les laboratoires qui ont besoin d’un débit élevé et d’une quantification fiable des virus.

D’autre part, certaines personnes utilisent le test de focalisation immunofluorescent pour détecter le virus Zika 25,27,28,30,31. Le test d’immunofluorescence est parallèle au FFA, sauf qu’il est réalisé en immunomarquant les antigènes avec des anticorps spécifiques conjugués au fluorochrome, suivi du comptage des foyers d’infection sous un microscope à fluorescence25. Ce test utilise des réactifs plus coûteux et nécessite une microscopie à fluorescence pour compléter le test. Par conséquent, le test d’immunofluorescence est limité aux laboratoires mieux équipés, tels que les laboratoires de référence. Il n’est pas facile d’utiliser ce test dans un contexte où les ressources sont limitées.

Bien que la FFA présente de nombreux avantages, elle présente également certaines limites. Par rapport à d’autres dosages, tels que le PFA, le FFA implique plus d’étapes pendant les processus de coloration. Bien que les étapes après la fixation soient flexibles et permettent des pauses d’une nuit ou plus longues, la coloration des foyers prend toujours plus de temps. De plus, le FFA nécessite des anticorps spécifiques ou à réaction croisée dans le processus de coloration, ce qui limite son applicabilité pour l’identification et la quantification de virus nouveaux ou nouveaux. De plus, le coût du FFA est plus élevé par rapport au PFA, qui ne nécessite que du violet cristallin pour la coloration. En plus de cela, il convient de noter que le processus de comptage automatisé (format 96 puits) ne peut être effectué que dans un laboratoire disposant de l’équipement approprié ; Par conséquent, il ne conviendra pas aux laboratoires sans l’équipement nécessaire.

En conclusion, nous rapportons des protocoles détaillés pour la propagation et la quantification du virus Zika à l’aide du test d’immunodétection colorimétrique cellulaire ou de la FFA dans des formats de plaques à 24 puits et de plaques à 96 puits. La méthode offre un certain nombre d’avantages pratiques par rapport à la PFA classique. Il est plus rapide et adapté aux applications à haut débit lorsqu’il est appliqué avec un système d’imagerie automatisé pour le comptage des foyers. La standardisation de protocoles fiables pour cette étude contribuera grandement à la recherche sur le virus Zika et pourra également être largement adaptée pour quantifier d’autres virus cliniquement importants.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Cette recherche a reçu le soutien du ministère de l’Enseignement supérieur de Malaisie dans le cadre du programme de subventions de recherche à long terme (LRGS MRUN Phase 1 : LRGS MRUN/F1/01/2018) et un financement du programme Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019). La figure 3 de cette étude qui montre le flux de travail de coloration pour le test de formation des foyers est adaptée de « DAB Immunohistochemistry » par BioRender.com (2022). Récupéré de https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Polyethersulfone syringe filter Sartorius S6534-FMOSK
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
10 mL sterile serological pipette Labserv 14955156
1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) Gibco 14190-136
2.0 mL Screw cap tube  Axygen SCT-200-SS-C-S
24-well plate Corning 3526
25 mL Sterile serological pipettes Labserv 14955157
3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate Thermo Scientific 34065
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
5 mL sterile serological pipette Labserv 14955155
50 mL centrifuge tube Falcon LAB352070
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
96-well plate Falcon 353072
Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) MilliporeSigma MAB10216
Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) N/A N/A 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) CTL-S6UNV12 Commercial software analyzer
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 12800-017
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen SFBS
Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) MilliporeSigma 12-349
Hemacytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
IGEPAL CA-630 detergent Sigma-Aldrich I8896 Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL 
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Laboratory rocker FINEPCR CR300
L-Glutamine Gibco 25030-081
Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) Sigma-Aldrich C5678
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
Skim milk Sunlac Low Fat N/A Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining
Sodium Hypochlorite Clorox N/A To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates
Stereomicroscope Nikon SMZ1000
Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle Terumo SS10L21G
Vero African green monkey kidney cells  - ECACC 88020401 Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.

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References

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Immunologie et infection Numéro 194 Virus Zika (ZIKV) Flavivirus Anomalies cérébrales congénitales Syndrome de Guillain-Barrã© Virologie Test de formation de foyer (FFA) Antigène viral Technique d’immunomarquage de la peroxydase Format 24 puits Format 96 puits Optimisation de la taille des foyers Cellules véro Incubation Processus de coloration Fixation cellulaire Perméabilisation Blocage Liaison aux anticorps Substrat de peroxydase
Propagation des virus et quantification colorimétrique cellulaire
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Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification. J. Vis. Exp. (194), e64578, doi:10.3791/64578 (2023).

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