Summary
본 프로토콜은 베로 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포에서 지카 바이러스(ZIKV)의 증식과 24웰 및 96웰(고처리량) 형식의 세포 기반 비색 면역검출 방법을 사용한 ZIKV의 정량화에 대해 설명합니다.
Abstract
지카 바이러스(ZIKV)는 플라비바이러스(Flavivirus) 속에 속하는 모기 매개 바이러스입니다. ZIKV 감염은 선천성 뇌 이상 및 성인의 길랭-바레 증후군과 관련이 있습니다. 질병 기전을 이해하기 위한 ZIKV에 대한 연구는 백신 및 치료제 개발을 촉진하는 데 중요합니다. 바이러스를 정량화하는 방법은 바이러스학 분야에서 중요하고 기본적입니다. 초점 형성 분석(FFA)은 항체로 바이러스 항원을 검출하고 과산화효소 면역염색 기술을 사용하여 세포의 감염 병소를 식별하는 바이러스 정량 분석법입니다. 현재 연구에서는 24-well 및 96-well(고처리량) 형식을 모두 사용하는 바이러스 전파 및 정량화 프로토콜을 설명합니다. 다른 유사한 연구와 비교했을 때, 이 프로토콜은 다른 바이러스에 대한 이 분석법의 사용을 확장하기 위한 가이드 역할을 할 수 있는 초점 크기 최적화를 추가로 설명했습니다. 첫째, ZIKV 증식은 Vero 세포에서 3일 동안 수행됩니다. ZIKV를 함유하는 배양 상층액은 FFA를 사용하여 수거하고 정량화합니다. 간단히 말해서, 바이러스 배양을 Vero 세포에 접종하고 2-3일 동안 배양합니다. 그런 다음 병소 형성은 세포 고정, 투과화, 차단, 항체 결합 및 과산화효소 기질을 사용한 배양을 포함한 최적화된 염색 공정 후에 결정됩니다. 염색된 바이러스 병소는 실체 현미경(24-웰 형식의 수동 계수) 또는 소프트웨어 분석기(96-웰 형식의 자동 계수)를 사용하여 시각화됩니다. FFA는 재현 가능하고 비교적 빠른 결과(3-4일)를 제공하며 플라크를 형성하지 않는 바이러스를 포함한 다양한 바이러스에 사용하기에 적합합니다. 결과적으로 이 프로토콜은 ZIKV 감염 연구에 유용하며 다른 임상적으로 중요한 바이러스를 검출하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
지카 바이러스(ZIKV) 감염은 모기 매개 바이러스성 질병으로 부상하고 있습니다. ZIKV의 첫 번째 고립은 1947년 우간다에서 이루어졌다 1,2; 1947년부터 2007년까지는 임상 증상이 가장 흔하게 무증상이고 자기 제한적인 열성 질환을 특징으로 하기 때문에 방치되었습니다. 2007년 지카 바이러스는 얍 제도에서 시작되었고3,4 2013년부터 2014년까지 태평양 지역(프랑스령 폴리네시아, 이스터 섬, 쿡 제도, 뉴칼레도니아)에서 더 큰 전염병이 발생했다 5,6,7,8 성인에서 처음으로 심각한 신경학적 합병증인 길랭-바레 증후군(GBS)이 보고되었다 9. 2015년과 2016년 사이에, 2013년 브라질에서 ZIKV의 아시아 유전자형이 출현한 후 처음으로 광범위한 ZIKV 전염병이 아메리카 대륙을 휩쓸었다10. 이 발병 기간 동안 440,000건에서 130만 건의 소두증 및 기타 신경학적 장애가 신생아에게 보고되었다11. 현재 ZIKV 감염에 대한 특별한 치료법은 없습니다. 따라서 특히 임신 중 감염을 예방할 수 있는 ZIKV 백신에 대한 의학적 필요성이 시급합니다.
바이러스 정량화는 샘플에 존재하는 바이러스의 수를 결정하는 프로세스입니다. 그것은 연구에서 중요한 역할을 하며 학술 실험실에는 의학 및 생명 과학과 같은 많은 분야가 포함됩니다. 이 공정은 바이러스 백신, 재조합 단백질, 바이러스 항원 또는 항바이러스제의 생산과 같은 상업 부문에서도 중요합니다. 바이러스 정량화를 위해 많은 방법 또는 분석법을 사용할 수 있다12. 방법 또는 분석법의 선택은 일반적으로 바이러스 특성, 원하는 정확도 수준, 실험 또는 연구의 특성에 따라 달라집니다. 일반적으로, 바이러스를 정량화하는 방법은 두 가지 범주로 나눌 수 있다: 바이러스 핵산(DNA 또는 RNA)의 존재를 검출하는 분자 분석과 시험관 내에서 바이러스 감염성을 측정하는 분석법 12. 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR, DNA용) 또는 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR, RNA용)13 및 디지털 액적 PCR(14)은 주어진 샘플에서 바이러스 핵산을 정량화하는 데 사용되는 일반적인 분자 기법의 예이다(15). 그러나, 이러한 고감도 분자 기술은 생존 가능한 바이러스와 생존 불가능한 바이러스를 구별할 수 없다15. 따라서 세포에 대한 바이러스 감염성과 같은 생물학적 특징에 대한 정보가 필요한 연구는 위에서 언급한 분자 기술을 사용하여 완료할 수 없습니다. 생존 가능한 바이러스의 존재를 측정하고 결정할 수 있는 분석이 필요합니다. 바이러스 감염도를 측정하는 분석법에는 플라크 형성 분석법(PFA), 50% 조직 배양 감염선량(TCID50), 형광 초점 분석법 및 투과 전자 현미경(TEM)이 포함됩니다12.
1952년 Renato Dulbecco가 개발한 PFA는 ZIKV16을 포함하여 바이러스 적정에 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다. 감염성 용해 바이러스에 대한 바이러스 농도를 직접 측정하는 데 사용됩니다. 이 방법은 바이러스 감염 후 접종된 세포 단층에서 세포병증 효과(CPE, 세포 사멸 영역 또는 플라크, 감염되지 않은 세포로 둘러싸인 감염 영역)를 생성하는 용해 바이러스의 능력을 기반으로 합니다. 그러나 분석에는 유용성에 영향을 미치는 몇 가지 단점이 있습니다. 분석은 시간이 많이 걸리고(바이러스에 따라 약 7-10일 소요), CPE에 의존하며 오류가 발생하기 쉽습니다. 본 연구에서는 24웰 플레이트 및 96웰 플레이트 형식에서 ZIKV를 검출하고 정량화하기 위한 면역 비색 기법인 초점 형성 분석(FFA)을 보고합니다.
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Protocol
1. 바이러스 전파
- 세포 준비
- 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 2mM L-글루타민이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 12mL가 포함된 75cm2 세포 배양 플라스크에서 Vero 세포를 성장시킵니다( 재료 표 참조). 5 % CO2 로 37 ° C의 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
- 현미경으로 세포를 모니터링하십시오. 세포가 70%-90% 밀도에 도달하면 사용할 준비가 된 것입니다(그림 1A).
알림: Vero 셀은 약 24시간17분마다 두 배가 됩니다. 1:10의 희석은 75cm2 플라스크에서 80%-90% 밀도에 도달하는 데 3-4일이 소요되어야 합니다. 매일 또는 격일로 세포를 모니터링합니다.
- 세포 단층의 감염
- 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 배양 플라스크에서 성장 배지를 제거합니다. 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(dPBS) 3mL로 플라스크를 2회 헹굽니다.
알림: 플라스크/플레이트에서 버려진 감염성 액체 폐기물을 소독하기 위해 10% 차아염소산나트륨이 포함된 비커를 준비해야 합니다. - 무혈청 DMEM 2mL(FBS 없이 2mM L-글루타민이 보충된 DMEM)와 ZIKV 접종물 20μL를 세포 배양 플라스크에 넣습니다. 바이러스 흡착을 위해 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 플라스크를 배양합니다.
참고: 초기 ZIKV 재고의 적정은 ZIKV 접종 첨가량(2단계)을 결정하는 데 도움이 됩니다.
주의: ZIKV는 생물안전 레벨 2(BSL-2) 병원체로 분류됩니다. ZIKV가 포함된 물질에 대한 모든 절차는 인증된 생물 안전 캐비닛에서 수행되어야 하며 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 모든 실험실 표준 운영 절차(SOP)를 따라야 합니다.
- 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 배양 플라스크에서 성장 배지를 제거합니다. 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(dPBS) 3mL로 플라스크를 2회 헹굽니다.
- 오버레이 매체 추가
- 1시간 배양 후 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 희석된 바이러스 접종물을 제거하고 폐기합니다. 세포 배양 플라스크를 3mL의 dPBS 2x로 헹굽니다.
- 감염된 세포를 유지하기 위해 세포 배양 플라스크에 12mL의 유지 배지(2% FBS, 2mM L-글루타민 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM)를 추가합니다.
- 감염된 Vero 세포를 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 5%CO2로 3일 동안 배양합니다.
알림: 현미경으로 감염된 Vero 세포의 CPE를 매일 모니터링합니다.
- ZIKV를 함유한 세포 배양 상층액의 수확
- 감염 후 3일째에 세포 반올림 및 분리(CPE)를 관찰할 수 있습니다(그림 1B-D). 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 ZIKV가 포함된 세포 배양 상층액을 50mL 원심분리 튜브로 수확합니다.
- 0.22μm 폴리에테르설폰 주사기 필터( 재료 표 참조)를 사용하여 세포 배양 상층액을 여과합니다. 여과된 세포 배양 상층액 500μL를 2.0mL 스크류 캡 튜브에 분취하고 나중에 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다.
참고: 수확된 ZIKV는 장기 보관을 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
주의 : 주사기 바늘을 사용하는 경우 바늘이 피부에 구멍을 뚫을 수 있으므로 추가 예방 조치를 취해야 합니다. 실험실 SOP를 수립해야 합니다.
2. 바이러스 정량 분석
- 세포 준비
- 지정된 플레이트(24-웰 플레이트: 0.5mL/웰, 7.5 x 104 세포/웰, 96-웰 플레이트: 0.1mL/웰, 1.5 x 104 세포/웰)에 Vero 세포를 시드하고 5%CO2로 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 밤새 배양합니다.
참고: 테스트할 5가지 시점이 있습니다(24웰 플레이트: 감염 후 48시간, 60시간, 72시간, 84시간 및 96시간, 96웰 플레이트: 감염 후 24시간, 36시간, 48시간, 60시간 및 72시간); 따라서 각 시점에 대해 하나의 접시를 준비하십시오. - 24시간 배양 후 세포가 70%-90% 밀도에 도달하면(그림 1E) 플레이트는 감염 준비가 된 것입니다. 세포 단층의 감염 전에 희석된 바이러스 스톡을 준비합니다(단계 2.2).
- 지정된 플레이트(24-웰 플레이트: 0.5mL/웰, 7.5 x 104 세포/웰, 96-웰 플레이트: 0.1mL/웰, 1.5 x 104 세포/웰)에 Vero 세포를 시드하고 5%CO2로 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 밤새 배양합니다.
- 바이러스 희석
- 24웰 및 96웰 플레이트의 경우 각 플레이트에 대해 6개의 멸균 1.5mL 미세 원심분리기 튜브를 준비하여 음성 대조군을 포함하여 10배 희석(10-1 에서 최대 10-5)을 수행합니다. 24웰 플레이트에 대한 실험 설정을 위해 6개의 마이크로 원심분리기 튜브 모두에 450μL의 무혈청 DMEM을 추가합니다. 96웰 플레이트에 대한 실험 설정을 위해 135μL의 무혈청 DMEM을 6개의 튜브에 추가합니다.
알림: 10배 연속 희석을 수행하기 전에 내용물의 희석을 나타내기 위해 각 튜브에 명확하게 라벨을 붙이십시오. - 연속 희석을 수행하려면 24웰 플레이트 실험 설정을 위해 1단계에서 수확한 50μL의 ZIKV 스톡을 450μL의 무혈청 DMEM이 포함된 10-1 튜브에 추가합니다. 96웰 플레이트 실험 설정의 경우, 135μL의 무혈청 DMEM이 포함된 10-1 튜브에 15μL의 ZIKV 스톡을 추가합니다.
- 각 튜브를 소용돌이치게 하여 바이러스와 배지를 혼합합니다. 이것은 첫 번째 10배 희석입니다.
참고: 정확한 연속 희석을 위해서는 각 희석 튜브에서 바이러스와 배양 배지를 적절하게 혼합해야 합니다. - 24웰 플레이트 실험 설정의 경우 새 피펫 팁을 사용하여 10-1 튜브를 재현탁하고 50μL의 희석된 ZIKV를 10-2 튜브에 두 번째 10배 희석으로 옮깁니다. 96웰 플레이트 실험 설정의 경우 새 피펫 팁을 사용하여 10-1 튜브를 재현탁하고 15μL의 희석된 ZIKV를 10-2 튜브에 두 번째 10배 희석으로 옮깁니다.
- 5번째 튜브까지 2.2.4단계를 네 번 반복합니다(음성 대조군 제외).
알림: 교차 오염을 방지하기 위해 각 피펫팅 단계 후에 새 피펫 팁을 사용하십시오.
- 24웰 및 96웰 플레이트의 경우 각 플레이트에 대해 6개의 멸균 1.5mL 미세 원심분리기 튜브를 준비하여 음성 대조군을 포함하여 10배 희석(10-1 에서 최대 10-5)을 수행합니다. 24웰 플레이트에 대한 실험 설정을 위해 6개의 마이크로 원심분리기 튜브 모두에 450μL의 무혈청 DMEM을 추가합니다. 96웰 플레이트에 대한 실험 설정을 위해 135μL의 무혈청 DMEM을 6개의 튜브에 추가합니다.
- 세포 단층의 감염
- 각 웰(24웰 플레이트: 0.5mL/웰, 96웰 플레이트: 0.1mL/웰)에서 조절된 배지를 제거하고 폐기합니다.
- dPBS 2x(24웰 플레이트: 300μL/웰, 96웰 플레이트: 60μL/웰)로 각 웰을 헹굽니다.
- 가장 높은 희석액에서 가장 낮은 희석액으로 작업하면서 연속적으로 희석된 각 바이러스 접종물을 웰(24웰 플레이트: 200μL/웰, 96웰 플레이트: 40μL/웰)에 추가합니다.
알림: 각 희석액의 감염은 복제된 웰에서 수행됩니다. 감염되지 않은 두 개의 우물을 음성 대조군으로 유지합니다. 혼동을 피하기 위해 플레이트와 웰에 명확하게 라벨을 붙입니다. 교차 오염을 방지하기 위해 각 피펫팅 단계 후에 피펫 팁을 교체하십시오. - 바이러스 흡착을 허용하기 위해 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 플레이트를 배양합니다.
- 오버레이 세포 배양 배지 추가
- 배양 1시간 후 바이러스 현탁액을 제거하고 가장 낮은 농도에서 가장 높은 농도로 폐기합니다.
- 감염된 세포를 dPBS 2x(24웰 플레이트: 300μL/웰, 96웰 플레이트: 60μL/웰)로 세척합니다.
- 웰을 DMEM(2% FBS, 2mM L-글루타민 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신 보충) 및 1.5% 저점도 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC, 재료 표 참조)로 오버레이합니다(24웰 플레이트: 1mL/웰, 96웰 플레이트: 0.2mL/웰).
- 5 % CO2 를 사용하여 37 ° C의 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.
알림: 이 잠복기 동안 플레이트를 방해하지 마십시오. - 다양한 시점(24웰 플레이트: 감염 후 48시간, 60시간, 72시간, 84시간 및 96시간, 96웰 플레이트: 감염 후 24시간, 36시간, 48시간, 60시간 및 72시간)에서 염색을 위해 플레이트를 꺼냅니다.
3. 염색
- 세포 고정
- 특정 배양 시간(24웰 플레이트: 감염 후 48시간, 60시간, 72시간, 84시간 및 96시간, 96웰 플레이트: 감염 후 24시간, 36시간, 48시간, 60시간 및 72시간) 후 오버레이 배지를 제거 및 폐기하고 1x PBS로 세포를 3번 세척합니다. 96웰 플레이트의 경우, 오버레이 배지를 제거 및 폐기하고 멀티채널 피펫을 사용하여 60μL/웰 1x PBS로 세포를 3번 세척합니다.
- 4% 파라포름알데히드를 추가하여 세포를 고정합니다(24웰 플레이트: 300μL/웰, 96웰 플레이트: 60μL/웰). 플레이트를 실온에서 20분 동안 배양합니다.
주의 : 파라 포름 알데히드는 고체 중합 포름 알데히드입니다. 물과 혼합하거나 가열할 때 포름알데히드 가스를 방출하는 가연성, 고체, 백색 결정성 분말입니다. 파라포름알데히드 사용과 관련된 모든 절차는 포름알데히드 함유 화학 물질에 대한 실험실 SOP에 따라 인증된 화학 흄 후드 또는 승인된 배기 인클로저에서 수행해야 합니다. - 20분 후 파라포름알데히드를 버리고 1x PBS로 세포를 3번 세척합니다. 3.2-3.5단계에 따라 투과화, 차단 및 항체 배양을 수행합니다.
알림: 4% 파라포름알데히드를 폐기할 때는 대학 또는 기관의 폐기물 처리 절차를 따르십시오.
- 세포 투과화
- 1% 옥틸페녹시 폴리(에틸렌옥시)에탄올( 재료 표 참조)을 추가하여 세포를 투과시킵니다(24웰 플레이트: 200μL/웰, 96웰 플레이트: 40μL/웰). 플레이트를 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 15분 후 옥틸페녹시 폴리(에틸렌옥시) 에탄올을 버리고 1x PBS로 세포를 3번 세척합니다.
- 블로킹
- 3% 탈지유를 첨가하여 샘플의 비특이적 결합을 줄입니다(24웰 플레이트: 500μL/웰, 96웰 플레이트: 100μL/웰). 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
- 2시간 후 3% 탈지유를 버리고 1x PBS로 세포를 3번 세척합니다.
참고: 이것은 중지 지점입니다. 3% 탈지유를 첨가한 후 플레이트를 1차 항체 삽입 최대 2일 전까지 4°C에서 보관할 수 있습니다.
- 1차 항체 배양
- 1% 탈지유(1:1,000 비율)에 희석한 항플라비바이러스 단클론 항체 4G2(클론 D1-4G2-4-15; 1차 항체, 재료 표 참조)를 추가합니다(24웰 플레이트: 200μL/웰, 96웰 플레이트: 40μL/웰). 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 1시간 후 단클론 항체가 포함된 용액을 제거하고 1x PBS로 세포를 3회 세척합니다.
- 2차 항체 배양
- 1% 탈지유(1:1,000 비율)에 희석한 고추냉이 과산화효소(HRP)( 재료 표 참조)와 접합된 염소 항마우스 IgG 2차 항체를 추가합니다(24웰 플레이트: 200μL/웰, 96웰 플레이트: 40μL/웰). 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 1시간 후 2차 항체가 포함된 용액을 제거하고 1x PBS로 세포를 3회 세척합니다.
- 기질 배양
- 3,3'디아미노벤지딘(DAB) 퍼옥시다제 기질( 재료 표 참조)을 추가하고 어두운 곳에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다(24웰 플레이트: 200μL/웰, 96웰 플레이트: 40μL/웰). 30분 후 우물을 물로 씻어 반응을 멈춥니다.
- 플레이트를 밤새 자연 건조시키고 플레이트가 완전히 건조된 후 초점 계수를 진행합니다.
4. 바이러스 역가 측정
- 수동 초점 계수 프로세스(24-well 형식)
- 초점은 실체 현미경으로 시각화할 수 있습니다. 50-200 초점이 생성되는 희석액을 선택합니다.
- 선택한 희석액의 각 반복에 대한 초점을 계산합니다. 선택한 각 희석액에 대한 평균 병소 수를 계산합니다.
- 아래 공식을 사용하여 각 샘플에 대한 mL당 병소 형성 단위(FFU/mL)를 계산합니다: FFU/mL = 평균 병소 수 계수/(희석 x 희석된 바이러스 추가량).
- 자동 초점 계수 프로세스(96웰 형식)
- 상용 소프트웨어 분석기에서 96웰 플레이트를 스캔합니다.
- 소프트웨어( 재료 표 참조)를 두 번 클릭하여 엽니다.
- Switch Suites(스위치 제품군)를 클릭하고 제품군이 적용 가능한 제품군으로 전환되었는지 확인합니다(보충 그림 1A). 확인을 클릭합니다.
- 스캔(Scan) > 전체 플레이트 스캔(Full plate scan)을 클릭하여 스캔을 시작합니다(보충 그림 1B).
- Dashboard( 대시보드 )를 클릭하여 캡처 형식이 96-well 형식인지 확인합니다(보충 그림 2A).
- 센터링 모드를 "Auto Prealignment User Verified"로 선택합니다(보충 그림 2B).
- Eject( 추출 )를 클릭하여 플레이트를 로드합니다.
알림: 플레이트의 뚜껑을 열고 A열이 상단에 오도록 위쪽으로 놓습니다(보충 그림 3A). - 플레이트 이름을 입력하고 확인을 클릭합니다. 로드( Load )를 클릭하여 플레이트를 로드합니다.
- 시작을 클릭하여 스캔을 시작합니다. 그런 다음 "위, 아래, 왼쪽, 오른쪽" 버튼을 사용하여 A1, A12 및 H1의 위치를 보정하고 확인을 클릭합니다(보충 그림 3B).
알림: 소프트웨어가 각 웰 스캔을 시작합니다. - 스캔이 완료되면 개요 이미지가 나타납니다. 닫기를 클릭합니다.
- Back to switchboard(스위치보드로 돌아가기)를 클릭하여 스캔을 종료합니다.
- 소프트웨어를 사용하여 96웰 플레이트를 계산합니다.
- Count > Smart Count를 클릭합니다.
- 소프트웨어에 "1/5단계: 계산할 플레이트 선택"이 표시됩니다. 플레이트 로드(Load plate(s))를 클릭합니다. 전체 폴더를 선택하고 선택을 클릭하여 스캔한 플레이트를 가져옵니다(보충 그림 4A).
- 소프트웨어에 "2/5단계: 계수 매개변수 정의"가 표시됩니다. 매개변수 조정을 클릭하면 매개변수가 표시됩니다(확산 프로세스, 소형/일반/대형/최대/최대 +1; 스폿 분리, 계수 면적, 배경 균형, 섬유 제거, 게이팅).
알림: 하나의 우물로 시작하여 앞뒤로 확인하여 모든 우물에 가장 적합한 설정을 찾으십시오. - 완료되면 Next(다음 )를 클릭합니다(보충 그림 4B).
- 소프트웨어에 "3/5단계: 웰 선택/선택 취소"가 표시됩니다. 계산할 웰 선택이 완료되면 다음을 클릭하여 계속 진행합니다.
알림: 계산하도록 선택한 웰은 각 웰의 오른쪽 상단 모서리에 "C"로 표시됩니다(보충 그림 5A). - 소프트웨어에 "4/5단계: 출력 설정"이 표시됩니다. 출력 설정 보기/수정 을 클릭하여 설정(예: 이미지 형식)이 적합한지 확인합니다. Save and Exit(저장 및 종료 )를 클릭합니다> Next(보충 그림 5B)).
- 소프트웨어에 "5/5단계: 자동 계산 시작"이 표시됩니다. Start AutoCount(자동 계산 시작 )를 클릭합니다(보충 그림 6A).
- 완료되면 자동 계산 종료를 클릭합니다.
- 상용 소프트웨어 분석기에서 96웰 플레이트를 스캔합니다.
- 상용 소프트웨어 분석기에서 품질 관리(QC)를 수행합니다.
- switchboard(교환대) 페이지에서 Quality Control(품질 관리) > Add plate(s)(플레이트 추가)를 클릭합니다. 계산된 플레이트를 가져올 전체 폴더를 선택하고 선택 > QC 시작(보충 그림 6B)을 클릭합니다.
- 각 우물을 두 번 클릭하여 지점을 검사합니다. 카운트 를 클릭하여 얼룩을 제거합니다. 소프트웨어가 계산을 시작합니다.
알림: "Spots: Remove"가 선택되어 있는지 확인하십시오. 카운팅의 완료는 카운팅된 초점 수, 예를 들어 "30"으로 표시될 수 있습니다(보충 그림 7A). - 카운팅이 종료되면(카운팅된 초점 수로 표시, 예:ample "30"), "예"를 클릭하여 반점을 제거합니다(보충 그림 7B). 제거할 지점을 세 번 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 완료한 다음 Yes( 예)를 클릭합니다.
- Finish Plate(마감 플레이트)를 클릭하고 QC가 완료되면 프로젝트 개요(Project Overview)로 이동합니다.
- 소프트웨어 분석기를 사용하여 이미징을 수행합니다.
- 스캔, 계수 및 QC 플레이트 이미지를 확인합니다(그림 2).
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Representative Results
ZIKV는 그림 3에 개략적으로 요약된 것처럼 FFA를 사용하여 정량화할 수 있습니다. 24웰 플레이트의 경우, 감염된 Vero 세포는 감염 후 48시간, 60시간, 72시간, 84시간 및 96시간에 고정되었습니다. 그 결과, 감염 후 96시간(4일) 후에도 세포가 온전한 상태로 유지됨(세포 분리가 관찰되지 않음)하는 것으로 나타났습니다(그림 4 및 보충 그림 8A-E). 바이러스 병소의 출현은 감염 후 48시간(2일)에 처음 관찰되었습니다(그림 4A-F). 그러나 초점 크기가 너무 작아 초점의 정확한 계산이 어려웠습니다. 최적의 병소 크기는 감염 후 60시간(2.5일)에 달성되었습니다(그림 4B). 후자의 시점(감염 후 72시간, 84시간, 96시간)에는 병소가 더 컸고 합쳐지거나 겹치는 경향이 있었다. 병합되거나 겹쳐진 초점은 시간이 지남에 따라 증가했습니다(그림 4C-E). 따라서 감염 후 60시간(2.5일)에 형성된 병소를 선택하여 24웰 플레이트에서 ZIKV 역가를 측정했습니다(그림 4B).
96웰 플레이트의 경우, 감염된 Vero 세포를 감염 후 24시간, 36시간, 48시간, 60시간 및 72시간에 고정시켰다. 그 결과 감염 후 72시간(3일) 후에도 세포가 온전한 상태로 유지되는 것으로 나타났습니다(그림 5A-F 및 보충 그림 9A-E). 바이러스 병소의 출현은 감염 후 24시간(1일)에 처음 관찰되었습니다(그림 5A). 그러나 감염 후 36시간(1.5일)까지 병소 크기가 너무 작아 병소의 수를 정확하게 파악하기 어려웠습니다(그림 5A,B). 최적의 병소 크기는 감염 후 48시간(2일)에 달성되었습니다(그림 5C). 후자의 시점(감염 후 60시간 및 72시간)에서 겹치거나 병합된 병소가 관찰되었으며 겹치는 병소의 수는 시간이 지남에 따라 증가했습니다(그림 5D,E). 따라서 감염 후 48시간(2일)에 형성된 병소를 선택하여 ZIKV 분리체의 바이러스 역가를 측정했습니다(그림 5C). 초점 형성은 상용 소프트웨어 분석기를 대안으로 사용하여 시각화하고 열거할 수 있습니다.
그림 1: Vero 세포의 현미경 이미지. (A) 40x 배율의 Vero 세포는 바이러스 증식을 위해 75cm2 세포 배양 플라스크에서 70%-90%의 밀도를 보여주었습니다. (B) 100배 배율에서 감염 후 1일째에 ZIKV에 감염된 후 Vero 세포의 CPE. (C) 100배 배율에서 감염 후 2일째에 ZIKV에 감염된 후 Vero 세포의 CPE. (D) 100배 배율에서 감염 후 3일째에 ZIKV에 감염된 후 Vero 세포의 CPE. (E) 40배 배율의 Vero 세포는 바이러스 정량을 위해 24시간 배양 후 24웰 플레이트에서 70%-90%의 밀도를 보여주었습니다. 척도 막대: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 상용 소프트웨어 분석기를 사용하여 스캔, 계수 및 사후 품질 관리 플레이트를 스캔한 96웰 형식의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 초점 형성 분석을 위한 염색 워크플로우. 세포 고정, 투과화, 차단, 항체 결합 및 과산화효소 기질을 사용한 배양을 포함한 염색 과정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 서로 다른 시점의 24웰 플레이트에서 ZIKV P6-740에 대한 초점 형성 분석. (A) 감염 후 2일째(48시간)에 병소가 덜 뚜렷합니다. (B) 최적의 병소 크기는 감염 후 2.5일(60시간)에 볼 수 있습니다. (씨-E) 감염 후 3일차(72시간), 3.5일(84시간), 4일차(96시간)에 병소가 합쳐졌습니다. (F) 플레이트의 네거티브 컨트롤. 척도 막대: 1,000 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 서로 다른 시점의 96웰 플레이트에서 ZIKV P6-740에 대한 초점 형성 분석. (A) 감염 후 1일차(24시간)에 상용 소프트웨어 분석기에서 계산하기에는 병소가 덜 뚜렷합니다. (B) 병소는 감염 후 1.5일(36시간)에 상용 소프트웨어 분석기에서 계산하기에는 덜 뚜렷합니다. (C) 최적의 병소 크기는 감염 후 2일(48시간)에 볼 수 있습니다. (디,이) 감염 후 2.5일(60시간)과 3일(72시간)에 병소가 합쳐졌습니다. (F) 플레이트의 네거티브 컨트롤. 척도 막대: 1,000 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 상용 소프트웨어 분석기의 시작 페이지 스크린샷. (A) 제품군을 상용 소프트웨어 분석기의 적용 가능한 제품군으로 전환합니다. 완료되면 "확인"을 클릭하십시오. (B) 상용 소프트웨어 분석기에서 스캔을 시작하려면 "스캔"을 클릭한 다음 "전체 플레이트 스캔"을 클릭합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 상용 소프트웨어 분석기에서 "캡처 형식" 및 선택한 센터링 모드를 "자동 사전 정렬 사용자 확인"으로 보기 위한 스크린샷. (A) 캡처 형식을 보려면 "대시보드"를 클릭하고 96웰 형식을 캡처 형식으로 선택합니다. (B) 센터링 모드의 경우 "Auto Prealignment User Verified"를 선택합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 상용 소프트웨어 분석기 플레이트 리더 트레이의 96웰 플레이트 배치 및 웰 A1, A12 및 H1의 위치를 보정하기 위한 스크린샷. (A) A행이 맨 위에 오도록 접시를 위로 놓습니다. (B) 웰 A1, A12 및 H1의 위치를 보정하려면 "위, 아래, 왼쪽, 오른쪽" 버튼을 사용합니다. 완료되면 "확인"을 클릭합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 4: 상용 소프트웨어 분석기에서 계산하기 위해 스캔한 플레이트가 포함된 폴더를 선택하는 스크린샷 및 "2/5단계: 계수 매개변수 정의". (A) 스캔한 플레이트를 계산하려면 "플레이트 로드"를 클릭합니다. 전체 폴더를 선택하고 "선택"을 클릭하여 스캔한 플레이트를 가져옵니다. (B) 계산 매개 변수를 조정합니다. 매개변수가 설정되면 "다음"을 클릭합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 5: 상용 소프트웨어 분석기 "Step 3 of 5: Select/unselect wells" 및 "Step 4 of 5: Output Settings"의 스크린샷. (A) 계산할 우물을 선택 및 선택 취소하고 완료되면 "다음"을 클릭합니다. (B) 출력 설정의 경우 "View/Modify Output Settings"를 클릭하여 설정이 적합한지 확인합니다(예: 이미지 형식). 완료되면 "Save and Exit"를 클릭하고 "Next"를 클릭합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 6: 상용 소프트웨어 분석기 "5/5단계: 자동 계산 시작" 및 품질 관리 페이지의 스크린샷. (A) 플레이트 카운팅이 준비되면 "자동 카운팅 시작"을 클릭합니다. (B) 품질 관리 페이지에서 전체 폴더를 선택하여 계산된 플레이트를 가져오고 "선택"을 클릭한 다음 "QC 시작"을 클릭합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 7: 상용 소프트웨어 분석기 품질 관리 페이지의 스크린샷. (A) 각 웰을 두 번 클릭하여 스폿을 감사합니다. "Count"를 클릭하여 얼룩을 제거합니다. "반점: 제거"를 선택합니다. (B) 세 번 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 얼룩을 제거합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 완료한 다음 "예"를 클릭합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 8: 서로 다른 시점의 24웰 플레이트에서 ZIKV P6-740에 대한 초점 형성 분석. ZIKV P6-740에 대해 10배 연속 희석(10-1 - 10-5)을 수행하고, 음성 대조군을 포함하여 Vero 세포에 중복으로 감염을 수행했습니다. 실체 현미경을 사용하여 원시 데이터 이미지를 촬영했으며 눈금 막대는 1,000μm를 나타냅니다. (A) 감염 후 2일차(48시간). (B) 감염 후 2.5일(60시간). (C) 감염 후 3일(72시간). (D) 감염 후 3.5일(84시간). (E) 감염 후 4일(96시간). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 9: 서로 다른 시점의 96웰 플레이트에서 ZIKV P6-740에 대한 초점 형성 분석. ZIKV P6-740에 대해 10배 연속 희석(10-1 - 10-5)을 수행하고, 음성 대조군을 포함하여 Vero 세포에 중복으로 감염을 수행했습니다. 원시 데이터 이미지는 실체 현미경을 사용하여 촬영되었으며 눈금 막대는 1,000μm를 나타냅니다. (A) 감염 후 1일(24시간). (B) 감염 후 1.5일(36시간). (C) 감염 후 2일(48시간). (D) 감염 후 2.5일(60시간). (E) 감염 후 3일(72시간). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
바이러스 역가를 결정하기 위한 몇 가지 분석법이 있습니다. PFA는 FFA와 유사한 바이러스 정량 프로토콜을 가지고 있으며, 바이러스 접종물을 희석하여 개별 플라크 또는 병소를 구별할 수 있습니다. 염색 후, 각 플라크 또는 병소는 접종물(19) 내의 단일 감염 입자를 나타낸다. PFA는 세포 용해 또는 사멸로 인한 플라크 형성을 시각화하기 위해 크리스탈 바이올렛으로 염색됩니다. 따라서 PFA는 바이러스가 CPE를 유발하는 데 더 오랜 시간이 필요하고 세포 용해 또는 사멸을 유도하는 바이러스에만 국한되기 때문에 시간이 더 많이 걸립니다. 많은 실험실에서 FFA를 사용하여 ZIKV 19,20,21,22,23,24,25를 포함한 플라비바이러스에 대한 전염성 바이러스 역가를 성공적으로 측정했습니다. FFA는 항체로 바이러스 항원을 검출하는 세포 기반 비색 면역 검출 방법으로, 면역염색 기법을 사용하여 감염된 세포의 병소 영역을 식별하지만 플라크는 식별하지 않습니다12,26. FFA는 PFA에 비해 ZIKV에 몇 가지 이점을 제공합니다. 한 가지 분명한 장점은 식별 가능한 CPE 없이 바이러스 성분의 항체 인식을 기반으로 한다는 것입니다. 또한, 바이러스 특이적 항체를 사용하는 것은 혼합된 집단에서 상이한 바이러스 또는 바이러스 혈청형을 식별하는 데에도 유용하다27. 그러므로, FFA는 모든 바이러스 감염을 측정하고, 눈에 보이는 플라크를 형성하기에 충분한 세포 사멸을 유발하는 바이러스에 의존하지 않기 때문에 PFA보다 더 특이적이다(28). FFA는 또한 PFA보다 잠복기가 짧기 때문에 세포 용해 및 사멸을 의미하는 명백한 CPE가 필요합니다. 마지막으로, 96웰 플레이트를 사용하는 FFA 분석법은 바이러스를 검출하고 적정하기 위해 더 많은 복제와 더 큰 희석액을 사용하는 이점을 제공합니다27,29. 또한 보고된 FFA 분석은 바이러스 중화 테스트 및 항바이러스 화합물 스크리닝 방법에 쉽게 적용할 수 있습니다. 상용 또는 무료 자동 세포 계수 기기 또는 소프트웨어를 통합하면 FFA 및 관련 분석법의 유용성(일관성, 정확성, 처리량)을 더욱 개선할 수 있습니다.
24웰 플레이트와 96웰 플레이트를 비교할 때 24웰 형식은 단층 배양에서 더 많은 수의 세포를 성장시켜야 할 뿐만 아니라 더 많은 양의 배지 및 바이러스 스톡이 필요하다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 24웰 플레이트 형식은 부피가 제한된 샘플에 사용하기에 적합하지 않을 수 있습니다. 이 한계는 이 문서에 설명된 대로 96-웰 형식을 사용하여 극복할 수 있습니다. 첫째, 96웰 형식은 재료가 덜 필요하므로 더 비용 효율적인 옵션입니다. 또한 96웰 형식의 염색된 바이러스 병소의 자동 계수를 통해 높은 처리량과 신속한 분석이 가능하지만, 수동 계수가 필요한 24웰 형식에서는 불가능합니다. 이 자동 계수 프로세스는 또한 수동 계수에 비해 재현성을 높이고 주관성을 줄여 FFA의 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다. 따라서 자동 이미징 시스템을 갖춘 96웰 형식은 높은 처리량과 신뢰할 수 있는 바이러스 정량화가 필요한 실험실에 적극 권장됩니다.
반면에, 어떤 사람들은 ZIKV 25,27,28,30,31을 검출하기 위해 면역형광 초점 분석을 사용합니다. 면역형광 초점 분석은 형광 크롬 접합 특이 항체로 항원을 면역염색한 후 형광 현미경 하에서 감염 병소를 계수하여 수행한다는 점을 제외하고는 FFA와 유사하다(25). 이 분석은 더 비싼 시약을 사용하며 분석을 완료하기 위해 형광 현미경이 필요합니다. 따라서 면역형광 초점 분석은 위탁 실험실과 같이 더 나은 장비를 갖춘 실험실로 제한됩니다. 자원이 까다로운 환경에서 이 분석을 사용하는 것은 쉽지 않습니다.
FFA에는 많은 장점이 있지만 몇 가지 제한 사항도 있습니다. PFA와 같은 다른 분석법과 비교할 때 FFA는 염색 과정에서 더 많은 단계를 거쳐야 합니다. 고정 후 단계는 유연하고 하룻밤 또는 더 긴 일시 중지가 가능하지만 초점의 염색을 완료하는 데 여전히 더 오래 걸립니다. 또한 FFA는 염색 과정에서 특이적 또는 교차 반응 항체를 요구하므로 새로운 바이러스 또는 새로운 바이러스를 식별하고 정량화하는 데 적용할 수 있습니다. 또한 FFA의 비용은 염색을 위해 크리스탈 바이올렛만 필요한 PFA에 비해 높습니다. 그 외에도 자동 계수 프로세스(96웰 형식)는 적절한 장비가 있는 실험실에서만 수행할 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 따라서 필요한 장비가 없는 실험실에는 적합하지 않습니다.
결론적으로, 우리는 24-웰 플레이트 및 96-웰 플레이트 형식의 세포 기반 비색 면역검출 분석 또는 FFA를 사용하여 ZIKV의 전파 및 정량화를 위한 자세한 프로토콜을 보고합니다. 이 방법은 기존 PFA에 비해 여러 가지 실용적인 이점을 제공합니다. 초점 계수를 위한 자동 이미징 시스템과 함께 적용할 때 고처리량 응용 분야에 더 빠르고 적합합니다. 이 연구를 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜의 표준화는 지카 연구에 크게 기여할 것이며 임상적으로 중요한 다른 바이러스를 정량화하는 데에도 광범위하게 적용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 서로 상충되는 이해관계가 없다고 선언한다.
Acknowledgments
이 연구는 장기 연구 보조금 제도(LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018)와 고등 기관 우수 센터(HICoE) 프로그램(MO002-2019)에 대한 자금 지원에 따라 말레이시아 고등 교육부의 지원을 받았습니다. 초점 형성 분석을 위한 염색 워크플로우를 보여주는 이 연구의 그림 3은 BioRender.com(2022)의 "DAB Immunohistochemistry"에서 채택한 것입니다. https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry 에서 가져옴.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 - 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 - 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 - 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | - | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
References
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