Summary
该协议描述了生成和表征鼠口腔 - 食管3D类器官的关键步骤，这些类器官代表通过化学致癌引起的正常，癌前和鳞状细胞癌病变。
Abstract
食管鳞状细胞癌（ESCC）在世界范围内普遍存在，每年占所有食管癌病例的90%，是所有人类鳞状细胞癌中最致命的。尽管最近在确定伴随ESCC启动和发展的分子变化方面取得了进展，但患者的预后仍然很差。这些分子变化的功能注释是必要的下一步，并且需要既能捕获ESCC的分子特征，又可以轻松且廉价地操作功能注释的模型。用烟草烟雾模拟物4-硝基喹啉1-氧化物（4NQO）处理的小鼠可预测地形成ESCC和食管癌前发育。值得注意的是，4NQO病变也出现在口腔中，最常见于舌头以及前胃，它们都共享分层鳞状上皮。然而，这些小鼠不能简单地操纵进行功能假设检验，因为生成同基因小鼠模型是时间和资源密集型的。在这里，我们通过从用4NQO处理的小鼠中生成单细胞衍生的三维（3D）类器官来克服这一限制，以表征小鼠ESCC或体 外肿瘤前细胞。这些类器官捕获了ESCC和食管癌前增生的显着特征，可以廉价快速地用于形成等基因模型，并可用于同源移植实验。我们演示了如何从正常，肿瘤前和SCC鼠食管组织中生成3D类器官，并维持和冷冻保存这些类器官。这些多功能类器官的应用非常广泛，包括利用基因工程小鼠和通过流式细胞术或免疫组织化学进一步表征，使用CRISPR技术生成同基因类器官系，以及药物筛选或同源移植。我们相信，广泛采用该议定书中展示的技术将加速该领域的进展，以应对ESCC的严重负担。
Introduction
食管鳞状细胞癌 （ESCC） 是人类鳞状细胞癌中最致命的，因为它诊断较晚、治疗耐药和转移1，2。ESCC 起源于分层鳞状上皮，其排列在食管的管腔表面。鳞状上皮由增殖性基底细胞和基底上细胞层内的分化细胞组成。在生理条件下，基底细胞表达标记物，如p63，Sox2和细胞角蛋白K5和K14，而分化的细胞表达K4，K13和IVL。基底细胞本身是异质的，包括由K153 和CD734等标记物定义的推定干细胞。在体内平衡中，基底细胞在基底上细胞层内经历有丝分裂后终末分化，而分化的细胞迁移并脱屑到腔内以完成上皮更新。让人联想到它们的起源细胞，ESCC在不同程度上显示出鳞状细胞分化。ESCC 通常伴有多灶性组织学前体病变，称为上皮内瘤变 （IEN） 或异型增生，包括非典型基底细胞。除了上皮变化外，ESCC还显示上皮下隔室内的组织重塑，其中发生癌症相关成纤维细胞（CAFs）的活化和免疫/炎症细胞的募集以促进肿瘤的微环境。
ESCC的发病机制涉及遗传改变和环境危险因素暴露。关键的遗传病变包括肿瘤抑制基因TP53和CDKN2A（p16INK4A）的失活以及CCND1（细胞周期蛋白D1）和EGFR癌基因的活化，最终导致细胞周期检查点功能受损，异常增殖以及在与暴露于环境致癌物相关的遗传毒性应激下存活。事实上，遗传变化与行为和环境风险因素密切相关，最常见的是烟草和酒精的使用。烟草烟雾中含有乙醛等人类致癌物质，乙醛也是酒精的主要代谢产物。乙醛诱导DNA加合物和链间DNA交联，导致DNA损伤和DNA突变和染色体不稳定的积累。鉴于过量的有丝分裂刺激和癌基因激活引起的异常增殖，应对遗传毒性应激的机制促进了食管上皮细胞的恶性转化，包括抗氧化剂的激活、自噬和上皮-间充质转化（EMT）。有趣的是，这些细胞保护功能通常在以高CD44（CD44H）表达为特征的ESCC癌症干细胞（CSC）中被激活，并具有肿瘤起始，侵袭，转移和治疗耐药的能力5，6，7。
ESCC已在细胞培养和啮齿动物模型8，9中建模。在过去的三十年中，已经开发出强大的ESCC基因工程小鼠模型。这些包括CCND1和EGFR转基因小鼠10，11和p53和p120Ctn敲除小鼠12，13。然而，单个基因改变通常不会导致快速发作的ESCC。通过使用食道致癌物克服了这一挑战，这些致癌物很好地概括了ESCC14中的人类遗传病变。例如，4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）加速CCND1转基因小鼠ESCC的发育15。近年来，在细胞谱系可追溯小鼠模型3，4中研究了假定的食管上皮干细胞，祖细胞及其各自的命运。此外，这些细胞谱系可追溯的小鼠已被用于探索ESCC的起源细胞以及这些细胞如何通过常规组织学和基于组学的分子表征产生CD44HCSCs7。
与这些小鼠模型相关的一个新兴领域是细胞培养技术在三维（3D）类器官系统中分析活ESCC和前体细胞的新应用，其中原始组织的结构在体外重现7，8，9。这些 3D 类器官从从小鼠组织中分离的单细胞悬液中快速生长，包括原发性和转移性肿瘤（例如淋巴结、肺和肝脏病变）。将细胞包埋在基底膜提取物（BME）中，并用明确的无血清细胞培养基进料。3D类器官在7-10天内生长，所得的球形结构适合传代培养，冷冻保存和测定，用于分析各种细胞特性和功能，包括CSC标志物，EMT，自噬，增殖，分化和凋亡细胞死亡。
这些方法可广泛应用于从任何分层鳞状上皮组织建立的3D类器官培养物，例如头颈部粘膜（口腔，舌头，咽部和喉部）甚至前胃。头颈部黏膜与食管相邻，两种组织具有相似的组织组织、功能和对疾病的易感性。头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）和ESCC都有遗传病变和生活方式相关的环境危险因素，如烟草和酒精暴露。强调这种相似性，用烟草烟雾模拟4NQO处理的小鼠很容易发展HNSCC和ESCC。鉴于下面描述的方案可以很容易地应用于HNSCC建模，我们提供了从这些病变建立3D类器官培养物的具体说明。
在本文中，我们提供了用于生成小鼠食管3D类器官（MEO）的详细方案，这些类器官代表在用4NQO治疗的小鼠中发展的正常，癌前和ESCC病变。可以使用各种小鼠品系，包括常见的实验室品系，如C57BL / 6和细胞谱系可追溯以及其他基因工程衍生物。我们强调关键步骤，包括分离正常或患病的小鼠食管上皮，制备单细胞悬浮液，培养和监测生长中的3D类器官，传代培养，冷冻保存以及后续分析的处理，包括形态学和其他应用。
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Protocol
小鼠实验是根据法规和动物协议#AABB1502计划和进行的，由哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会审查和批准。小鼠被饲养在适当的动物护理设施中，以确保对小鼠的人道待遇，并为小鼠提供适当的兽医护理，并为实验室人员提供实验室安全培训。
1.用4NQO治疗小鼠诱导食管IEN和ESCC病变（时间考虑：长达28周）
注意：为了产生代表肿瘤性食管病变的MEO，将小鼠置于4NQO介导的化学致癌作用中，如Tang等人先前描述的那样14。正常/非肿瘤性MEO由未经治疗的小鼠产生。
- 小 鼠
- 每个笼子容纳四到五只小鼠，并在开始实验之前将它们适应动物设施至少1周。为了减少年龄相关疾病导致整个28周实验过早终止的可能性，从8周龄至16周龄的小鼠开始。
注意：在本协议中使用了重约20-30g的C57BL / 6小鼠。对于较短的实验，可以使用老年小鼠。雄性或雌性小鼠是可以接受的。对照（不治疗，见第1.3.1节）小鼠必须在年龄和性别上匹配。
- 每个笼子容纳四到五只小鼠，并在开始实验之前将它们适应动物设施至少1周。为了减少年龄相关疾病导致整个28周实验过早终止的可能性，从8周龄至16周龄的小鼠开始。
- 含4NQO的饮用水的制备
- 在乙丙二醇中制备1 mg/mL 4NQO储备溶液（材料表）。将 100 mg 4NQO 溶解到 100 mL 99.9% 乙丙二醇中，置于覆盖有密封膜的 500 mL 玻璃烧杯中。在室温（RT）下使用磁力搅拌器以800rpm充分混合30分钟。储存在4°C。
- 将 900 mL 高压灭菌的去离子水加入 100 mL 的 1 mg/mL 4NQO 储备溶液中，并在覆盖有密封膜的 2 L 塑料量筒中倒置混合。1 L 100 μg/mL 4NQO 在 10% 乙丙二醇中的体积将用于两个配备 500 mL 饮水瓶的小鼠笼。
注意：值得注意的是，4NQO是一种合成化学致癌物，可能导致癌症。戴上丁腈手套和长袖实验室外套，并穿露趾鞋。考虑适当的眼睛防护、面部防护和头罩。对于废物处理，4NQO应按照环境健康和安全危险废物管理的机构指南放置在有标签的容器中。
- 4NQO治疗和监测
- 连接水瓶，并通过饮用水随意向 小鼠施用 4NQO16周。使用10%（w / v）丙二醇作为载体（无处理）对照。
注意：较短的4NQO治疗可用于诱导IEN。 - 每周补充一次水。
- 每周将每只小鼠放入实验室天平上的塑料容器中称重。
- 在16周4NQO治疗期结束时，在4NQO后观察期开始给小鼠定期饮水长达12周（图1）。
- 每天监测小鼠是否有痛苦的迹象（例如，活动能力受损、驼背习惯和孤僻行为）、吞咽困难和脱水。此外，每周评估小鼠体重或食物和液体摄入量的变化。如果体重比初始体重下降10%以上，则用液体膳食补充剂喂养小鼠。
注意：液体膳食补充剂难治性体重减轻可能表明ESCC，体重减轻超过20%的小鼠应被安乐死。重要的是，MEO可以从过早安乐死的小鼠中产生。请注意，没有遗传修饰的C57BL / 6小鼠通常不会出现发病迹象或具有可见的ESCC病变，直到4NQO后观察期结束。
- 连接水瓶，并通过饮用水随意向 小鼠施用 4NQO16周。使用10%（w / v）丙二醇作为载体（无处理）对照。
- 动物制备
- 在充满CO2的CO2室中以每分钟置换30%-70%的腔室体积的流速对小鼠实施安乐死。确认颈椎脱位死亡。
- 使用21 G针将鼠标的四肢和鼻子仰卧位固定在解剖平台上。
- 用70%乙醇消毒小鼠的腹面。
- 解剖（时间考虑：0.5小时）
- 通过捏住中腹皮毛和皮肤来打开皮肤，以确保它从下面的内脏中释放出来。使用手术剪刀从下腹部到下巴做一个颅尾腹中线切口。
- 从中线切口开始，使用手术剪刀进行放射状切口，延伸到小鼠两侧的四肢。将皮瓣打开。
- 要暴露颈气管，请使用解剖剪刀将唾液腺分开中线。气管位于腺体深处。
- 要暴露胸气管，请切除胸骨。
- 用镊子轻轻捏住并提起腹膜，并用剪刀沿胸腔将腹膜颅尾和横向分开。
- 轻轻地将肝脏从横膈膜的尾表面缩回，并用剪刀在胸骨切口处的横膈膜上做一个小切口，特别是在剑突的背表面。这会将肺和心脏从内脏胸膜中释放出来。
- 将胸腔与胸内容物分开。将剪刀插入横膈膜的切口，然后颅骨解剖到颈带。在解剖过程中，紧贴胸骨背表面，以避免损伤下面的器官。确保夹层平面位于气管前方。
- 用剪刀剪断胸骨两侧的肋骨，然后取下胸骨。确保胸部内容物暴露在外。
- 暴露腹部食管。用镊子握住胃窦，轻轻地向前提起胃。用剪刀解剖胃和食道上的脾脏、胰腺和肠系膜。
- 暴露胸食管（图2）。
- 轻轻抬起气管立即尾部至甲状腺软骨，并用虹膜剪刀解剖气管背侧的食道。
- 用虹膜剪刀将甲状腺软骨处的气管分开。
- 通过沿尾部方向仔细解剖，将气管从食道的其余部分剥离。
- 用气管一起取出肺、心脏和胸腺。解剖和分割主动脉和腔静脉时，注意避免对食道造成损伤。
- 用剪刀将幽门处的胃分开。
- 用镊子夹住胃窦并解剖颅骨，将食道与椎骨分开。
- 在甲状腺软骨水平处分裂食道，并 集体收获食道和胃（图3）。
- 通过在贲门处划分食道来分离胃和食道（图4，顶部面板，红线）。
- 解剖食道外表面的任何筋膜。要保留用于组织学的样本（可选），请取出一半的食管并用剪刀纵向分开。将剩余的完整食道放入冰上的冷PBS中。
- 沿着较大的曲率打开胃，并用PBS充分清洗。分开前胃，用冷PBS清洗。将前胃放在冰上的冷PBS中。
- 要收获舌头，请取下鼻子上的 21 G 针，然后用镊子拔出舌头。尽可能长时间地割断舌头。将舌头放在冰上的冷PBS中。
2. 小鼠食管类器官（MEO）培养的建立
注意：该协议也可用于建立鼠舌类器官培养物，并添加在胰蛋白酶消化之前切碎舌组织的步骤。请参阅步骤 2.2.3 中的注释。
- 试剂的制备
注意：试剂列表可在 材料表中找到。除非另有说明，否则请根据制造商的说明准备和储存储备溶液。- 确保本协议中使用的基底膜基质（BME）的一次性等分试样储存在-20°C直至使用之日，随后在冰上或2-8°C下解冻，并在不使用时始终保持在冰上。
- 将 250 mg 大豆胰蛋白酶抑制剂 （STI） 溶解在 1，000 mL PBS（250 mg/mL 储备浓度）中，并对其进行过滤灭菌 （0.22 μm）。将50mL等分试样分配到锥形管中，并在4°C下储存长达6个月。
- 制备小鼠类器官培养基 （MOM）：用 1 mM N-乙酰基-L-半胱氨酸 （NAC）、2% R-Spondin 和 Noggin 条件培养基 （RN CM）、1 x N-2 补充剂、1x B-27 补充剂、10 mM HEPES、1x 抗生素-抗真菌剂、1 x GlutaMAX 补充剂和 100 ng/mL 小鼠表皮生长因子 （mEGF） 补充高级 DMEM/F12。一次准备MOM 500 mL，将其分成50 mL等分试样，并储存在2-8°C直至准备使用。使用前加入 0.5 μg/mL 两性霉素 B 和 10 μM Y-27632。
- 使用前，将MOM，0.25%胰蛋白酶和大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）在水浴或珠浴中预热至37°C。
- 从解剖的小鼠组织中分离角质形成细胞（时间考虑：2小时）
- 将食管组织转移到PBS中的500μL分散酶中（总共2.5-5单位），并在37°C和800rpm下在热混合器中孵育10分钟。
- 将组织转移到培养皿中，并使用镊子小心地从上皮上去除肌肉层（图4）。
注意：此步骤也可以由经验丰富的研究人员在孵育之前执行。 - 将上皮细胞转移到含有500μL0.25%胰蛋白酶的微量离心管中，并在37°C和800rpm下在热混合器中孵育10分钟。
注意：如果起始材料是舌组织，请在加入胰蛋白酶之前，用无菌手术刀将组织切成小块，大小约为 1-2 mm2 。 - 以2，000 x g 短暂离心5-10秒以沉淀组织。准备带有 100 μm 细胞过滤器的 50 mL 锥形管。使用圆周运动将组织/细胞悬液通过具有宽孔尖端的过滤器转移。
- 通过过滤器加入 3 mL STI，使用圆周运动进行洗涤。
- 用 1 mL 结核菌素注射器柱塞的底座擦洗过滤器以推动细胞通过。
- 用3mL PBS清洗过滤器3-5次，在洗涤之间用注射器底部擦洗过滤器。
- 在4°C下以300× g 离心管10分钟以沉淀细胞。
- 除去上清液，在管中留下1mL溶液。
- 将沉淀重悬于剩余的 1 mL 中，并通过 70 μm 细胞过滤器将细胞悬液转移到新的 50 mL 锥形管中。
- 在4°C下以300× g 离心管10分钟以沉淀细胞。
- 将沉淀重悬于 100 μL MOM 中;根据需要调整音量。通过台盼蓝排除进行自动细胞计数。
- 初始细胞悬液的接种（时间考虑：<1小时）
- 在37°C培养箱中预热24孔细胞培养板。
- 在 75% （v/v） BME/MOM 中接种 5，000 个活细胞，每孔总体积为 50 μL。根据以下示例计算，最大化接种的孔数，并在BME中为一个额外的孔准备足够的细胞。
注意：冷冻保存培养基（FBS中的10%DMSO）中任何多余的细胞，最大浓度为1 x 106 个细胞/ mL。将冷冻管储存在-80°C的冷冻容器中过夜。 将它们转移到气相液氮中长期储存。 - 在微量离心管中，首先在MOM中制备适当的细胞稀释液，然后在电镀前使用宽口径尖端加入BME。
- 使用200 μL宽口径的吸头，将50 μL液滴缓慢添加到孔的中心，避免吸头与孔的底部或侧面接触（图5）。注意不要用太大的力将液体从尖端排出，否则圆顶会变平。
- 让BME在37°C，5%CO2，95%相对湿度（RH）培养箱中固化30分钟。
- 每孔小心地加入 500 μL MOM，补充 0.5 μg/mL 两性霉素 B 和 10 μM Y-27632。
注意：在整个初始原代培养过程中将两性霉素添加到所有 MOM 中。仅在传代当天（第 0 天）为所有传代添加 Y-27632。 - 在第 3-4 天更换 MOM，然后每 2-3 天更换一次，直到准备好通过。
- 在第7-10天，对类器官进行成像，并通过将形成的类器官数量除以最初接种的细胞数量来测量类器官形成率（OFR）。
计算示例：
- 小鼠食管类器官（MEO）的传代和冷冻保存（时间考虑：<1.5小时）
- 解冻并保持BME在冰上。使用前在水浴或珠浴中将MOM，0.05%胰蛋白酶和STI预热至37°C。在37°C培养箱中预热24孔细胞培养板。
- 使用宽口径微量移液器吸头，将类器官与上清液一起收集BME圆顶。通过上下移液破坏 BME。
注意：将含有相同样品的孔合并到单个微量离心管中。 - 以2，000 x g 短暂离心10-15秒以沉淀类器官。取出并弃去上清液。
- 轻轻移开沉淀，并将沉淀重悬于500μL的0.05%胰蛋白酶中。
- 将管在37°C和800rpm的热混合器中孵育10分钟。
- 用 600 μL STI 灭活胰蛋白酶。
- 将管在4°C下以300× g 离心5分钟以沉淀细胞。
- 取出并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 100 μL MOM 中。通过台盼蓝排除进行自动细胞计数。
注意：音量可根据需要进行调整。 - 将 2，000-5，000 个活细胞接种在 75% （v/v） BME/MOM 中，每孔总体积为 50 μL。根据前面提到的示例计算，最大化接种的孔数，并在BME中为一个额外的孔准备足够的细胞。
注意：冷冻保存培养基（FBS中的10%DMSO）中任何多余的细胞，最大浓度为1 x 106 个细胞/ mL。将冷冻管储存在-80°C的冷冻容器中过夜。 将它们转移到气相液氮中长期储存。 - 在微量离心管中，首先在MOM中制备适当的细胞稀释液，然后在电镀前使用宽口径尖端加入BME。
- 使用 200 μL 宽孔径吸头，将 50 μL 液滴缓慢添加到孔中心，避免吸头与孔底部或侧面接触。注意不要用太大的力将液体从尖端排出，否则圆顶会变平。
- 将板在37°C，5%CO2，95%RH培养箱中孵育30分钟。
- 每孔小心地加入 500 μL MOM，并补充 10 μM Y-27632。
注意：仅在传代当天（第 0 天）添加 Y-27632。在更换介质期间无需添加它。不再需要添加两性霉素 B。 - 在第 3-4 天更换 MOM，然后每 2-3 天更换一次，直到准备好通过。
- 在第7-10天，对类器官进行成像，并测量OFR值。
- 小鼠食管类器官（MEO）的解冻和恢复（时间考虑：<1小时）
- 解冻并保持BME在冰上。在37°C培养箱中预热24孔细胞培养板。
- 在 15 mL 锥形管中制备 10 mL 冷或室温 MOM 或 PBS。
- 在37°C水浴或珠浴中解冻冷冻管约30秒至1分钟或直到留下小冰丸。
- 使用预润湿的移液器吸头，以滴滴方式将细胞悬液缓慢转移到含有MOM或PBS的管中。
- 将管离心300× g 和4°C5分钟以沉淀细胞。
- 取出并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 100 μL MOM 中;根据需要调整音量。通过台盼蓝排除进行自动细胞计数。
- 将 5，000-10，000 个活细胞接种在 75% （v/v） BME/MOM 中，每孔总体积为 50 μL。根据前面提到的示例计算，最大化接种的孔数，并在BME中为一个额外的孔准备足够的细胞。
- 继续执行小鼠食管类器官（MEO）传代和冷冻保存方案的其余步骤（参见步骤2.4.11）。
3.石蜡包埋用类器官的制备（时间考虑：<1小时[加上试剂制备1.5小时]）
- 使用宽口径微量移液器吸头，每个微量离心管收集三个孔。将BME圆顶中的类器官与上清液一起收集。通过上下移液破坏 BME。
- 以2，000 x g 短暂离心10-15秒以沉淀类器官。取出并弃去上清液。
- 轻轻移开沉淀，并将沉淀重悬于 300 μL 4% 多聚甲醛 （PFA） 中。
- 将类器官在4°C下固定过夜。
- 以2，000 x g 短暂离心10-15秒以沉淀类器官。尽可能多地去除并丢弃PFA。
- 轻轻移开沉淀，并将沉淀重悬于 500 μL PBS 中。
注意：固定类器官可以在4°C下储存长达2周，然后再进行下一步。 - 准备 50 mL 琼脂凝胶原液（2% 琼脂加 2.5% 明胶）。
注意：由于孵育时间，提前准备琼脂凝胶原液，然后进行高压灭菌循环。- 将 1 g 杆菌琼脂和 1.25 g 明胶重悬于 150 mL 可高压灭菌玻璃烧杯中的 50 mL 水中。
- 旋转悬浮液，让它在室温下静置 30-60 分钟。
- 在121°C高压灭菌20分钟。
- 稍微冷却，将 5 mL 等分试样分装在 15 mL 锥形管中。
- 在室温下储存长达 6 个月。
- 通过倒置微量离心管架并用密封膜覆盖表面来准备嵌入表面。使用相应的类器官 ID 标记。
- 将试管以300× g 离心5分钟以沉淀类器官。取出并弃去上清液。
- 同时，通过将含有琼脂凝胶的 15 mL 锥形管放入含有 100 mL 水的 150 mL 玻璃烧杯中并在最高功率设置下微波 1-2 分钟或直到水开始沸腾并且琼脂凝胶处于液态，从而液化琼脂凝胶。
注意：在微波之前松开装有琼脂凝胶的锥形管的盖子。 - 将含有类器官沉淀的微量离心管部分浸入温水中，而不将任何水引入微量离心管中。
- 通过在管侧面添加 50 μL 琼脂来小心地覆盖类器官沉淀。
- 在不干扰沉淀的情况下（不要重悬，保持沉淀完整），将琼脂凝胶液滴中的沉淀转移到包埋表面上的密封膜上。
- 用额外的 50 μL 液体琼脂凝胶重复步骤 3.12 和步骤 3.13，以收集任何剩余的类器官沉淀，并小心地添加到相同的凝胶液滴中。
- 将含有类器官沉淀的液滴在4°C下孵育45分钟。
- 使用镊子，小心地将含有类器官颗粒的液滴转移到标记的病理盒中。
- 将盒式磁带在4°C的70%乙醇中储存长达1个月。
- 通过常规组织学处理进行石蜡包埋以制备石蜡块。
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Representative Results
该协议描述了根据特定的治疗方案从正常食管组织或来自4NQO处理的小鼠的ESCC肿瘤组织产生小鼠食管类器官（MEO）的过程，该方案包括在饮用水中施用16周的4NQO，然后是10周至12周的观察期（图1）。然后将小鼠安乐死以解剖舌头或食道组织（图2 和 图3）。我们描述了一种从完整食道中分离上皮层的方法（图4），用于随后的单细胞分离。食道来源的上皮细胞最初以每孔5，000个细胞的速度接种在50μL液滴中，液滴中含有基底膜基质中的细胞和表征良好的无血清细胞培养基（图5），并允许在平均7-10天内形成类器官。鼠食管、舌和前胃类器官可以通过相衬/明场成像和组织病理学的形态学分析进一步表征（图 6）。类器官的自我更新能力可以通过在传代培养时确定OFR来评估（图7）。OFR在很大程度上受到增殖基底细胞含量的影响，正如生长动力学分析及其形态所揭示的那样（图8）。最后，这些类器官，包括来自4NQO未处理小鼠的正常结构，持续生长并且可以维持很长时间（图9）。
图1：4NQO治疗方案。 用饮用水中的4NQO处理小鼠16周，然后观察10周至12周。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：暴露胸食管。 气管（蓝线）从食道（白线）剥离。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：食道（白线）连接到鳞状柱状交界处的胃（黄线）（蓝线）。 缩写：FS=前胃，DS=远端胃，L=肝脏。 请点击此处查看此图的大图。
图4：分离胃和食道并隔离上皮。 上部：胃与食道分离。红线表示解剖过程中食道应分离的位置。中间：上皮（白线）从肌肉层剥离。下：食道携带肿瘤遵循 图1中所述的治疗方案。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：使用宽孔尖端电镀含有单个细胞的 BME 液滴。 类器官在第4-7天左右开始形成，平均7-10天后即可传代。用 BioRender.com 创建。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：通过形态学分析表征类器官。 （A） 正常和ESCC MEO的代表性图像。左上：正常MEO的明场图像。左下：正常MEO的H&E染色。右上：来自4NQO处理的鼠标的ESCC MEO的明场图像。右下：来自4NQO处理的小鼠的ESCC MEO的H&E染色显示核异型性和突然角化，后者让人联想到角蛋白珍珠，代表SCC肿瘤内分化的良好区室。 （B）正常小鼠舌头和前胃类器官（分别为MTO和MFO）的代表性图像。左上：正常MTO的明场图像。左下：正常MTO的H&E染色。右上：普通MFO的明场图像。右下：正常MFO的H&E染色。所有比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：确定类器官更新能力。 （A）通过传代培养确定类器官更新能力的实验设计。生长的初级类器官（P0）在不同的时间点解离并制成单细胞悬浮液。传代这些细胞以在传代培养物（P1）中的第7天确定OFR值。（B）来自4NQO未处理小鼠产生的传代MEO的代表性OFR数据。请注意，OFR随时间而降低，反映了成熟类器官中增殖性基底细胞的减少，其中含有更多经历了有丝分裂后终末分化的细胞（见 图8）。 p < 第 7 天、第 11 天和第 21 天 OFR 为 0.001 （n = 6） 与第 4 天的 OFR 相比。 请点击此处查看此图的大图。
图8：类器官在不同时间点的形态所揭示的生长动力学。 显示了来自4NQO未处理小鼠的正常MEO的代表性明场和H&E染色图像。请注意，类器官内核的角质化在第10天变得突出。增殖性基底细胞即使在第14天和第21天的时间点仍保留在最外层的细胞层中。对于免疫组织化学/免疫荧光，累积的角蛋白可能导致非特异性染色，就像原始鳞状上皮组织一样，需要仔细优化染色条件、对照（例如，仅二抗）和数据解释。所有比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图9：由4NQO未处理小鼠产生的代表性正常MTO的群体倍增曲线。 这些类器官先前被生成、冷冻保存和解冻，以证明它们在多次传代和长期培养中的稳定生长。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
此处描述的协议中，生成和分析MEO有几个关键步骤和注意事项。为了确保MEO实验的可重复性和严谨性，生物学和技术重复都很重要。对于生物学重复，每个实验条件通常有两到三只携带ESCC的独立小鼠就足够了。然而，适当的生物学重复次数可能会有所不同，具体取决于单个研究中要测试的参数。例如，目前尚不清楚从没有肉眼可见病变或组织学IEN和ESCC病变的4NQO处理小鼠中检测到肿瘤类器官的早期和频率。尽管4NQO诱导各种小鼠品系的食管病变14，但仅由C57BL / 6小鼠产生MEO。ESCC的发育和进展在具有基因工程遗传病变（例如Trp53丢失和细胞周期蛋白D1过表达7，14，15）的小鼠中加速。在这些小鼠中，肿瘤性MEO可能在4NQO治疗期间或之后比野生型C57BL / 6小鼠更频繁和更早地出现。如有必要，应进行试点研究以估计计划实验中小鼠的适当样本量。使用多孔细胞培养板，可以轻松创建技术重复（n = 3-6）。然而，当细胞被分配到含有BME的粘性培养基中时，需要仔细移液和实践，以尽量减少孔间的差异性。
在所述协议中，MEO建立的成功率可能接近100%。然而，成功的MEO培养取决于初始分离的食管上皮细胞的活力，这在很大程度上与起始材料的质量有关。当安乐死后不能立即解剖小鼠时，可以将尸体在4°C下保存过夜，以在第二天分离食道。但是，尸体不应冷冻，因为冷冻组织不会产生活细胞。解离的食管上皮细胞可以冷冻保存为单细胞悬浮液在冷冻培养基（90%FBS和10%DMSO）中，并储存在液氮中以在以后生成类器官。食管（上皮片）可能以类似的方式冷冻保存，尽管不太理想。虽然可以通过荧光激活细胞分选（FACS）和其他方法纯化细胞来纯化食管上皮细胞的独特亚群，但纯化后细胞活力可能会降低。应该注意的是，台盼蓝排除试验等细胞活力测定可以区分活细胞和死细胞，但不能区分死亡细胞，从而低估了类器官培养开始前的细胞活力。建立后，来自4NQO处理和未处理小鼠的MEO可以无限期传代（>20代），在指定培养基中的每次传代中预期存活率为>80%。值得注意的是，有些类器官培养基成分的要求仍不清楚。Zheng等人最近证明，生长小鼠食管类器官需要含有Wnt3A，RSpondin-1和Noggin的补充剂16。然而，我们在此协议中不使用Wnt3A，因为来自舌头，食道和前胃的类器官生长并且可以在没有它的情况下多次传代（>10次传代）7，3，17。应该注意的是，这些因素的要求尚未单独测试。
上皮片用于从正常食管或食管粘膜产生MEO，而没有宏观可见的病变，例如肿瘤。使用上皮片允许富集上皮细胞作为起始材料。然而，由于ESCC侵入上皮下隔室，上皮片难以从荷瘤食管粘膜中分离出来。整个食管可用于启动MEO培养，尽管非上皮细胞群的存在可能会降低初始培养中的类器官形成率（OFR）。预计OFR将在随后的传代中上升，因为目前的MEO培养条件允许上皮细胞在BME内生长。值得注意的是，这里描述的方案也可以应用于其他器官，特别是口腔舌和前胃，两者都容易受到4NQO诱导的鳞状细胞癌变的影响。值得注意的是，我们已经从整个组织中产生了小鼠舌类器官（MTO）和小鼠前胃类器官（MFO），而无需分离上皮细胞。如有必要，这些类器官可以由通过荧光激活细胞分选纯化的上皮细胞亚群（例如，以高CD44表达为特征的癌症干细胞，CD73+推定食管干细胞）制成。
此外，非上皮细胞，特别是成纤维细胞，可能从BME中迁移出来，在塑料表面上以单层生长，从而允许同时建立鼠食管成纤维细胞，包括癌症相关的成纤维细胞。3D BME中上皮细胞生长的选择性可能限制MEO与免疫细胞和其他细胞类型的共培养，并在此处描述的当前条件下。共培养实验的优化正在进行中。此外，肿瘤侵袭性前沿可以在通过替代 3D 培养方法（例如器官型 3D 培养8，18）建模的上皮-基质界面中更好地概括。此外，MEO可能不是测量上皮屏障功能的合适平台，可以通过利用气液界面培养物来评估跨上皮电阻来更好地评估上皮电阻19，20，21。
MEO以及MTO和MFO的最大优势是单细胞衍生结构的快速生长，这些结构概括了原始的上皮结构，包括良性和恶性。这些类器官的倍增时间（DT）通常估计为<20小时。来自4NQO未处理小鼠的正常MTO的生长动力学说明了正常类器官的长期培养能力，以及预期的群体倍增（PD）水平和DT（图9）。在这个例子中，每次传代期间大约发生了10次群体倍增，计算出的DT平均为18.5小时和18.3小时。在初始原代培养后，无论接种密度如何，通常预计 OFR 为 15%-25%，并且 MEO 最早可能在第 4 天出现（图 8），尽管它们的尺寸可能更小。在相差显微镜下，来自正常食管粘膜的类器官显示出具有光滑表面的球形结构。作为时间的函数，当细胞内部团块经历有丝分裂后的终末分化时，正常类器官显示出同心结构，产生模仿分层鳞状上皮的分化梯度。肿瘤性类器官表现出不规则的表面，反映了基底细胞的高增殖活性，基底细胞可能以向外扩张。MEO显示增殖分化梯度的能力可用于研究增殖性食管基底角质形成细胞如何繁殖并经历有丝分裂后终末分化。通过传代解离的MEO细胞，可以评估上皮细胞的自我更新（图7），以及在4NQO诱导的遗传毒性应激下的再生或转化。在口腔癌的背景下，也可以利用MTO模型进行类似的研究，从而扩大所述4NQO小鼠类器官模型在头颈部SCC中的应用。虽然上皮更新可能意味着干细胞，但MEO系统的一个潜在弱点是它可能无法检测到静止或很少分裂的干细胞，因为MEO的形成取决于细胞增殖。最近一项关于MEO的单细胞分析研究为食管上皮细胞异质性提供了实质性的见解22。
恶性转化可以通过对单个MEO结构的仔细形态学评估和组成MEO的细胞的核异型性来评估。通过全外显子组测序和RNA测序对MEO进行分子分析可能揭示肿瘤前病变和ESCC病变的独特性质。然而，恶性转化的最终测试可能需要将MEO移植到免疫缺陷或免疫功能正常的小鼠中，以记录ESCC细胞的致瘤性。在同系免疫功能小鼠中移植的ESCC MEO也可能为研究肿瘤免疫微环境提供良好的平台。
MEO的应用范围很广。除了形态学、生物化学和多组学方法外，流式细胞术不仅可以用于分析细胞过程，例如 DNA 合成、凋亡、自噬和线粒体呼吸，还可以用于定义 MEO 内与离体遗传和药理修饰相对应的独特细胞亚群的细胞表面标志物 7，23.此外，类器官可用于共培养实验，以评估上皮细胞与基质、免疫细胞甚至微生物组之间的相互作用24。最后，MEO可以从携带细胞谱系可追溯遗传修饰的小鼠产生，例如在细胞类型特异性基因调控启动子（例如Sox2，细胞角蛋白Krt5和Krt15）下表达的荧光报告蛋白3，4，7，25。
总之，MEO是ESCC研究的宝贵工具。这里描述的方案旨在表明MEO代表了一种通用模型，相对容易生成，维护和表征，并且能够概括ESCC和食管瘤变的特征。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢哥伦比亚大学赫伯特欧文综合癌症中心的共享资源（流式细胞术，分子病理学和共聚焦和专业显微镜）的技术支持。我们感谢Alan Diehl博士，Adam J. Bass博士和Kwok-Kin Wong博士（NCI P01食管癌发生机制）以及Rustgi和Nakagawa实验室的成员进行了有益的讨论。这项研究得到了以下NIH资助的支持：P01CA098101（H.N.和A.K.R.），R01DK114436（H.N.），R01AA026297（H.N.），L30CA264714（SF），DE031112-01（F.M.H.），KL2TR001874（F.M.H.），3R01CA255298-01S1（J.G.），2L30DK126621-02
（J.G.）R01CA266978 （C.L.）， R01DK132251 （C.L.）， R01DE031873 （C.L.）， P30DK132710 （C.M. 和 H.N.）， 和 P30CA013696 （AKR）。H.N.和C.L.是哥伦比亚大学赫伯特欧文综合癌症中心多PI飞行员奖的获得者。H.N.是范可尼贫血研究基金奖的获得者。F.M.H.是马克癌症研究基金会奖（20-60-51-MOME）和美国癌症研究协会奖的获得者。J.G.是美国胃肠病学协会（AGA）奖的获得者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
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