Summary
Denne protokollen beskriver de viktigste trinnene for å generere og karakterisere murine oral-esophageal 3D-organoider som representerer normale, preneoplastiske og plateepitelkarsinomlesjoner indusert via kjemisk karsinogenese.
Abstract
Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) er utbredt over hele verden, og står for 90% av alle esophageal cancer tilfeller hvert år, og er den dødeligste av alle humane plateepitelkarsinomer. Til tross for nylige fremskritt i å definere de molekylære endringene som følger med ESCC-initiering og utvikling, er pasientprognosen fortsatt dårlig. Den funksjonelle annotasjonen av disse molekylære endringene er det nødvendige neste trinnet og krever modeller som både fanger de molekylære egenskapene til ESCC og lett og billig kan manipuleres for funksjonell merknad. Mus behandlet med tobakksrøykmimetisk 4-nitrokinolin-1-oksid (4NQO) danner forutsigbart ESCC og esophageal preneoplasi. Merk at 4NQO-lesjoner også oppstår i munnhulen, oftest i tungen, så vel som formagen, som alle deler det stratifiserte plateepitelet. Imidlertid kan disse musene ikke bare manipuleres for funksjonell hypotesetesting, da generering av isogene musemodeller er tid- og ressurskrevende. Her overvinner vi denne begrensningen ved å generere enkeltcellederiverte tredimensjonale (3D) organoider fra mus behandlet med 4NQO for å karakterisere murine ESCC eller preneoplastiske celler ex vivo. Disse organoidene fanger de fremtredende egenskapene til ESCC og esophageal preneoplasi, kan billig og raskt utnyttes for å danne isogene modeller, og kan brukes til syngene transplantasjonseksperimenter. Vi demonstrerer hvordan man genererer 3D-organoider fra normalt, preneoplastisk og SCC murine esophageal vev og vedlikeholder og kryokonserverer disse organoider. Anvendelsene av disse allsidige organoidene er brede og inkluderer bruk av genetisk konstruerte mus og videre karakterisering ved flowcytometri eller immunhistokjemi, generering av isogene organoidlinjer ved bruk av CRISPR-teknologier og legemiddelscreening eller syngen transplantasjon. Vi tror at den utbredte adopsjonen av teknikkene demonstrert i denne protokollen vil akselerere fremgangen på dette feltet for å bekjempe den alvorlige byrden av ESCC.
Introduction
Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) er den dødeligste av humane plateepitelkarsinomer, på grunn av sin sene diagnose, terapiresistens og metastase 1,2. ESCC oppstår fra det stratifiserte plateepitelet, som strekker den luminale overflaten av spiserøret. Det plateepitelet består av proliferative basale celler og differensierte celler i det suprabasale cellelaget. Under fysiologiske forhold uttrykker basalceller markører som p63, Sox2 og cytokeratin K5 og K14, mens differensierte celler uttrykker K4, K13 og IVL. Basalcellene i seg selv er heterogene og inkluderer antatte stamceller definert av markører som K15,3 og CD734. I homeostase gjennomgår basale celler postmitotisk terminal differensiering innenfor det suprabasale cellelaget, mens differensierte celler migrerer og desquamate inn i lumen for å fullføre epitelfornyelse. ESCC minner om deres opprinnelsesceller, og viser plateepiteldifferensiering i varierende grad. ESCC ledsages ofte av multifokale histologiske forløperlesjoner, kjent som intraepitelial neoplasi (IEN) eller dysplasi, som omfatter atypiske basaloidceller. I tillegg til epitelforandringer viser ESCC vevsremodellering i subepitelrommet, hvor aktivering av kreftassosierte fibroblaster (CAF) og rekruttering av immun / inflammatoriske celler finner sted for å fremme det tumorfremmende mikromiljøet.
Patogenesen til ESCC innebærer genetiske endringer og eksponering for miljørisikofaktorer. Viktige genetiske lesjoner inkluderer inaktivering av tumorsuppressorgenene TP53 og CDKN2A (p16INK4A) og aktivering av CCND1 (cyklin D1) og EGFR-onkogener, som kulminerer i nedsatt cellesykluskontrollpunktfunksjon, avvikende proliferasjon og overlevelse under genotoksisk stress relatert til eksponering for miljøkreftfremkallende stoffer. Faktisk samhandler genetiske endringer tett med atferdsmessige og miljømessige risikofaktorer, oftest tobakk og alkoholbruk. Tobakksrøyk inneholder humane kreftfremkallende stoffer som acetaldehyd, som også er hovedmetabolitten av alkohol. Acetaldehyd induserer DNA-addukter og interstrand DNA-kryssbindinger, noe som fører til DNA-skade og akkumulering av DNA-mutasjoner og kromosomal ustabilitet. Gitt overdreven mitogen stimuli og avvikende proliferasjon fra onkogenaktivering, blir den ondartede transformasjonen av esophageal epitelceller lettere av mekanismer for å takle genotoksisk stress, inkludert aktivering av antioksidanter, autofagi og epitel-mesenkymal overgang (EMT). Interessant nok aktiveres disse cytoprotektive funksjonene ofte i ESCC-kreftstamceller (CSC) som er preget av høyt CD44 (CD44H) uttrykk og har evnen til tumorinitiering, invasjon, metastase og terapiresistens 5,6,7.
ESCC har blitt modellert i cellekultur og i gnagermodeller 8,9. I løpet av de siste tre tiårene har robuste genmodifiserte musemodeller av ESCC blitt utviklet. Disse inkluderer CCND1 og EGFR transgene mus 10,11 og p53 og p120Ctn knockout mus 12,13. Imidlertid resulterer enkle genetiske endringer vanligvis ikke i raskt innsettende ESCC. Denne utfordringen har blitt overvunnet med bruk av esophageal carcinogens som rekapitulerer godt de menneskelige genetiske lesjonene i ESCC14. For eksempel akselererer 4-nitrokinolin-1-oksid (4NQO) ESCC-utvikling i CCND1 transgene mus15. I de senere år har antatte esophageal epitelial stamceller, stamceller og deres respektive skjebner blitt undersøkt i celleavstamningssporbare musemodeller 3,4. Videre har disse celleavstamningssporbare musene blitt brukt til å utforske opprinnelsescellene til ESCC og hvordan slike celler gir opphav til CD44H CSC via konvensjonell histologi og omics-basert molekylær karakterisering7.
Et fremvoksende område relatert til disse musemodellene er den nye anvendelsen av cellekulturteknikker for å analysere levende ESCC og forløperceller i et tredimensjonalt (3D) organoidsystem der arkitekturen til det opprinnelige vevet rekapituleres ex vivo 7,8,9. Disse 3D-organoider vokser raskt fra en enkeltcellesuspensjon isolert fra murine vev, inkludert primære og metastaserende svulster (f.eks. Lymfeknute, lunge og leverskader). Cellene er innebygd i kjellermembranekstrakt (BME) og matet med et veldefinert serumfritt cellekulturmedium. 3D-organoidene vokser innen 7-10 dager, og de resulterende sfæriske strukturer er egnet for subkultur, kryopreservering og analyser for å analysere en rekke cellulære egenskaper og funksjoner, inkludert CSC-markører, EMT, autofagi, spredning, differensiering og apoptotisk celledød.
Disse metodene kan i stor grad brukes på 3D-organoidkulturer etablert fra ethvert stratifisert plateepitelvev, for eksempel hode- og nakkeslimhinnen (munnhule, tunge, svelg og strupehode) og til og med formagen. Hode- og nakkeslimhinnen er sammenhengende med spiserøret, og de to vevene deler lignende vevsorganisasjon, funksjon og følsomhet for sykdom. Både hode- og nakkeplateepitelkarsinom (HNSCC) og ESCC deler genetiske lesjoner og livsstilsrelaterte miljørisikofaktorer som tobakk og alkoholeksponering. For å understreke denne likheten, utvikler mus behandlet med tobakksrøykmimetikken 4NQO lett både HNSCC og ESCC. Gitt hvor enkelt protokollene beskrevet nedenfor kan brukes til modellering av HNSCC, inkluderer vi spesifikke instruksjoner for å etablere 3D-organoidkulturer fra disse lesjonene.
Her gir vi detaljerte protokoller for generering av murine esophageal 3D organoider (MEOs) som representerer normale, preneoplastiske og ESCC lesjoner som utvikler seg hos mus behandlet med 4NQO. Ulike musestammer kan benyttes, inkludert vanlige laboratoriestammer som C57BL / 6 og cellelinjesporbare og andre genetisk konstruerte derivater. Vi legger vekt på de viktigste trinnene, inkludert isolering av normalt eller sykt murine esophageal epitel, fremstilling av encellede suspensjoner, dyrking og overvåking av voksende 3D-organoider, subkultur, kryopreservering og behandling for påfølgende analyser, inkludert morfologi og andre applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Murine forsøkene ble planlagt og utført i samsvar med forskrifter og under dyreprotokoll #AABB1502, gjennomgått og godkjent av Columbia University's Institutional Animal Care and Use Committee. Musene ble plassert på et skikkelig dyrepleieanlegg som sikrer human behandling av mus og gir passende veterinærpleie for musene og laboratoriesikkerhetsopplæring for laboratoriepersonellet.
1. Behandling av mus med 4NQO for å indusere esophageal IEN og ESCC lesjoner (tidsvurdering: opptil 28 uker)
MERK: For å generere MEOer som representerer neoplastiske esophageal lesjoner, blir musene utsatt for 4NQO-mediert kjemisk karsinogenese som tidligere beskrevet av Tang et al.14. Normale/ikke-neoplastiske MEO genereres fra ubehandlede mus.
- Mus
- Hus fire til fem mus per bur, og akklimatisere dem til dyreavdelingen i minst 1 uke før du starter et eksperiment. For å redusere muligheten for at aldersrelaterte lidelser resulterer i for tidlig avslutning av hele 28 ukers eksperimentet, start med 8 uker gamle til 16 uker gamle mus.
MERK: C57BL/6 mus som veier ca. 20-30 g ble benyttet i denne protokollen. For kortere eksperimenter kan eldre mus brukes. Mannlige eller kvinnelige mus er akseptable. Kontroll (ingen behandling, se pkt. 1.3.1) Mus må matches i alder og kjønn.
- Hus fire til fem mus per bur, og akklimatisere dem til dyreavdelingen i minst 1 uke før du starter et eksperiment. For å redusere muligheten for at aldersrelaterte lidelser resulterer i for tidlig avslutning av hele 28 ukers eksperimentet, start med 8 uker gamle til 16 uker gamle mus.
- Tilberedning av drikkevann som inneholder 4NQO
- Klargjør 1 mg/ml 4NQO stamløsning i etylenpropylenglykol (materialfortegnelse). Løs opp 100 mg 4NQO i 100 ml 99,9% etylenpropylenglykol i et 500 ml glassbeger dekket med tetningsfilm. Bland godt ved romtemperatur (RT) ved hjelp av en magnetisk omrører ved 800 o / min i 30 minutter. Oppbevares ved 4 °C.
- Tilsett 900 ml autoklavert avionisert vann til 100 ml 1 mg/ml 4NQO stamløsning, og bland ved inversjon i en 2 l plastgradert sylinder dekket med tetningsfilm. Et volum på 1 l 100 μg / ml 4NQO i 10% etylenpropylenglykol vil betjene to musebur utstyrt med en 500 ml drikkeflaske.
FORSIKTIG: Merk at 4NQO er et syntetisk kjemisk kreftfremkallende stoff som kan forårsake kreft. Håndtak med nitrilhansker og en langermet laboratoriefrakk, og bruk sko med lukket tå. Vurder riktig øyevern, ansiktsbeskyttelse og hodeplagg. For avfallshåndtering skal 4NQO plasseres i en merket beholder i samsvar med institusjonelle retningslinjer for håndtering av farlig avfall etter miljøhelse og sikkerhet.
- Behandling med 4NQO og overvåking
- Fest drikkeflasken, og administrer 4NQO via drikkevannet ad libitum til musene i 16 uker. Bruk 10% (w / v) propylenglykol som et kjøretøy (ingen behandling) kontroll.
MERK: Kortere varighet av 4NQO-behandling kan brukes til å indusere IEN. - Fyll på vannet en gang per uke.
- Vei hver mus ukentlig ved å plassere den i en plastbeholder på en laboratorievekt.
- På slutten av 16 ukers 4NQO behandlingsperiode, begynn å gi musene vanlig drikkevann i observasjonsperioden etter 4NQO i opptil 12 uker (figur 1).
- Overvåk musene daglig for tegn på nød (f.eks. Nedsatt mobilitet, hakket habitus og tilbaketrukket oppførsel), dysfagi og dehydrering. I tillegg må du evaluere musene ukentlig for endringer i kroppsvekt eller mat og væskeinntak. Skulle kroppsvekten falle med mer enn 10% fra den opprinnelige kroppsvekten, mate musene med et flytende kosttilskudd.
MERK: Et tap av kroppsvekt ildfast mot flytende kosttilskudd kan være en indikasjon på ESCC, og mus som mister mer enn 20% av kroppsvekten bør avlives. Det er viktig at MEO kan genereres fra for tidlig avlivede mus. Merk at C57BL/6-mus uten genetiske modifikasjoner vanligvis ikke viser tegn på sykelighet eller har synlige ESCC-lesjoner før slutten av observasjonsperioden etter 4NQO.
- Fest drikkeflasken, og administrer 4NQO via drikkevannet ad libitum til musene i 16 uker. Bruk 10% (w / v) propylenglykol som et kjøretøy (ingen behandling) kontroll.
- Dyr forberedelse
- Avlive musene i et CO 2 -kammer fylt med CO2 ved en strømningshastighet som forskyver 30% -70% av kammervolumet per minutt. Bekreft død ved cervikal dislokasjon.
- Fest lemmer og nese på musen i den bakre posisjonen til disseksjonsplattformen ved hjelp av 21 G nåler.
- Desinfiser musens ventrale overflate med 70% etanol.
- Disseksjon (tidsbetraktning: 0,5 t)
- Åpne huden ved å klemme midabdominal pels og hud for å sikre at den frigjøres fra innvollene nedenfor. Bruk kirurgisk saks til å lage et kraniokaudalt, ventralt midtlinjesnitt fra underlivet til haken.
- Starter ved midtlinjen snitt, bruk kirurgisk saks for å gjøre radiale kutt som strekker seg til lemmer på begge sider av musen. Flay huden klaffene åpne.
- For å avsløre livmorhalsrøret, bruk dissekerende saks for å dele spyttkjertlene ved midtlinjen. Luftrøret ligger dypt i kjertlene.
- For å avsløre thoracic luftrøret, fjern brystbenet.
- Klem forsiktig og løft bukhinnen med tang, og bruk saks til å dele bukhinnen kraniokaudalt og lateralt langs ribbeholderen.
- Trekk leveren forsiktig fra membranens kaudale overflate, og bruk saks til å lage et lite snitt i membranen ved sternal hakk, spesielt ved dorsaloverflaten av xiphoidprosessen. Dette frigjør lungen og hjertet fra den viscerale pleura.
- Separat brystkassen fra thoraxinnholdet. Sett saks inn i snittet i membranen, og dissekere kranialt til livmorhalsbeltet. Under denne disseksjonen, hold deg tett til brystbenets dorsale overflate for å unngå skade på organene under. Sørg for at disseksjonsplanet er fremre for luftrøret.
- Klipp ribbeina på hver side av brystbenet med saks, og fjern brystbenet. Sørg for at thoraxinnholdet blir eksponert.
- Utsett magerøret. Løft forsiktig magen anteriort ved å holde antrum med tang. Dissekere milten, bukspyttkjertelen og mesenteri av mage og spiserør med saks.
- Eksponer thorax øsofagus (figur 2).
- Løft luftrøret forsiktig caudalt til skjoldbruskkjertelen, og dissekere spiserøret på dorsalsiden av luftrøret ved hjelp av irissaks.
- Del luftrøret på skjoldbrusk brusk med iris saks.
- Riv luftrøret av resten av spiserøret via forsiktig disseksjon i kaudal retning.
- Fjern lunge, hjerte og thymus en masse med luftrøret. Pass på å unngå skade på spiserøret når du dissekerer og deler aorta og vena cava.
- Del magen på pylorus med saks.
- Separat spiserøret fra vertebraen ved å holde antrum med tang og dissekere kranialt.
- Del spiserøret på nivå med skjoldbrusken og høst spiserøret og magesekken i hopetall (figur 3).
- Separer magesekk og spiserør ved å dele spiserøret i cardia (figur 4, øverste panel, rød linje).
- Dissekere av noen fascia på den ytre overflaten av spiserøret. For å reservere en prøve for histologi (valgfritt), fjern halvparten av spiserøret og del i lengderetningen med saks. Plasser gjenværende intakt spiserør i kald PBS på is.
- Åpne magen langs større krumning, og vask med PBS tilstrekkelig. Skill foremagen, og vask med kald PBS. Legg magesekken i kald PBS på is.
- For å høste tungen, fjern 21 G nålen på nesen, og trekk ut tungen med pinsett. Klipp tungen så lenge som mulig. Legg tungen i kald PBS på is.
2. Etablering av murine esophageal organoid (MEO) kultur
MERK: Denne protokollen kan også brukes til å etablere en murinttungeorganoidkultur med tillegg av et trinn der tungevevet hakkes før trypsinisering. Se notatet i trinn 2.2.3.
- Fremstilling av reagenser
MERK: En liste over reagenser finnes i materialfortegnelsen. Forbered og oppbevar lageroppløsningene i henhold til produsentens instruksjoner med mindre annet er angitt.- Sørg for at engangsalikotene i membranmatrisen i kjelleren (BME) som brukes i denne protokollen, lagres ved -20 °C til bruksdagen, tines deretter på is eller ved 2-8 °C, og holdes på is til enhver tid når de ikke er i bruk.
- Oppløs 250 mg soyabønnetrypsinhemmer (STI) i 1000 ml PBS (250 mg / ml stamkonsentrasjon), og filtrersteriliser (0,22 μm) det. Dispenser 50 ml alikoter i kjegleformede rør, og oppbevar i opptil 6 måneder ved 4 °C.
- Forbered museorganoidmediet (MOM): Suppler avansert DMEM / F12 med 1 mM N-acetyl-L-cystein (NAC), 2% R-Spondin og Noggin betinget medium (RN CM), 1x N-2 supplement, 1x B-27 supplement, 10 mM HEPES, 1x antibiotika-antimykotisk, 1x GlutaMAX supplement og 100 ng / ml mus epidermal vekstfaktor (mEGF). Klargjør MOM 500 ml om gangen, del den i 50 ml alikoter og oppbevar ved 2-8 °C til den er klar til bruk. Tilsett 0,5 μg/ml amfotericin B og 10 μM Y-27632 rett før bruk.
- Forvarm MOM, 0,25% trypsin og soyabønnetrypsinhemmer (STI) til 37 ° C i et vann- eller perlebad før bruk.
- Isolering av keratinocytter fra dissekert musevev (tidsbetraktning: 2 timer)
- Overfør esophageal vev til 500 μL dispase i PBS (2,5-5 enheter totalt), og inkuber i en termomixer i 10 minutter ved 37 ° C og 800 rpm.
- Overfør vevet til en dyrkningsskål, og fjern forsiktig muskellaget fra epitelet ved hjelp av tang (figur 4).
MERK: Dette trinnet kan også utføres av en erfaren forskerfør inkubasjon med dispase. - Overfør epitelet til et mikrosentrifugerør inneholdende 500 μL 0,25% trypsin, og inkuber i en termomixer i 10 minutter ved 37 °C og 800 o / min.
MERK: Hvis utgangsmaterialet er tungevev, hakk vevet med en steril skalpell i mindre biter, ca. 1-2 mm2 i størrelse, før du tilsetter trypsinet. - Kort sentrifuge i 5-10 s ved 2000 x g for å pelletere vevet. Forbered et 50 ml konisk rør med en 100 μm cellesil. Overfør vevet/cellesuspensjonen gjennom silen med en bred borespiss ved hjelp av sirkulære bevegelser.
- Tilsett 3 ml STI gjennom silen, ved hjelp av sirkulære bevegelser for å vaske.
- Skrubb silen med bunnen av et 1 ml tuberkulinsprøytestempel for å presse cellene gjennom.
- Vask silen med 3 ml PBS 3-5 ganger, skrubb silen med sprøytebunnen mellom vaskene.
- Sentrifuger røret ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C for å pelletere cellene.
- Fjern supernatanten, og la 1 ml oppløsning ligge i røret.
- Resuspender pelleten i de resterende 1 ml, og overfør cellesuspensjonen gjennom en 70 μm cellesil til et nytt 50 ml konisk rør.
- Sentrifuger røret ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C for å pelletere cellene.
- Resuspender pelleten i 100 μL MOM; Juster volumet etter behov. Utfør en automatisk celletelling ved å prøve panblå ekskludering.
- Såing av den opprinnelige cellesuspensjonen (tidsvurdering: <1 time)
- Forvarm en 24-brønns cellekulturplate i en 37 ° C inkubator.
- Plate 5,000 levedyktige celler i 75% (v / v) BME / MOM med 50 μL totalt volum per brønn. Maksimer antall brønner belagt og klargjør nok celler i BME for en ekstra brønn i henhold til eksempelberegningene nedenfor.
MERK: Kryokonserverer eventuelle overflødige celler i kryopreserveringsmediet (10% DMSO i FBS) ved en maksimal konsentrasjon på 1 x 106 celler / ml. Oppbevar kryovialene i en frysebeholder over natten ved -80 °C. Overfør dem til flytende nitrogen i dampfase for langtidslagring. - I et mikrosentrifugerør, lag en passende cellefortynning i MOM først, og tilsett deretter BME ved hjelp av en bred borespiss like før plettering.
- Bruk en 200 μL bred borespiss til å tilsette en 50 μL dråpe langsomt i midten av brønnen, og unngå kontakt mellom spissen og bunnen eller sidene av brønnen (figur 5). Vær forsiktig så du ikke bruker for mye kraft for å utvise væsken fra spissen, ellers vil kuppelen flate ut.
- La BME størkne i 30 minutter i en 37 ° C, 5% CO2, 95% relativ fuktighet (RH) inkubator.
- Tilsett forsiktig 500 μL MOM per brønn supplert med 0,5 μg/ml amfotericin B og 10 μM Y-27632.
MERK: Legg amfotericin til alle MOM gjennom den første primære kulturen. Legg til Y-27632 bare på dagen for passering (dag 0) for alle passeringer. - Bytt MOM på dagene 3-4 og deretter hver 2-3 dager etter det til du er klar til å passere.
- På dagene 7-10, bilde organoider, og måle organoid dannelseshastighet (OFR) ved å dele antall organoider dannet av antall celler opprinnelig sådd.
Eksempel på beregninger:
- Passasje og kryopreservering av murine øsofageale organoider (MEO) (tidsvurdering: <1,5 time)
- Tine og holde BME på is. Forvarm MOM, 0,05% trypsin og STI til 37 °C i et vann- eller perlebad før bruk. Forvarm en 24-brønns cellekulturplate i en 37 ° C inkubator.
- Bruk en mikropipettespiss med bred boring til å samle organoidene i BME-kuppelen sammen med supernatanten. Forstyrr BME ved å pipettere opp og ned.
MERK: Kombiner brønnene som inneholder identiske prøver i et enkelt mikrosentrifugerør. - Kort sentrifuge i 10-15 s ved 2,000 x g for å pelletere organoider. Fjern og kast supernatanten.
- Fjern pelleten forsiktig, og resuspender pelleten i 500 μL 0,05% trypsin.
- Inkuber slangen(e) i en termomixer ved 37 °C og 800 o/min i 10 minutter.
- Inaktiver trypsinet med 600 μL STI.
- Sentrifuger røret ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C for å pelletere cellene.
- Fjern og kast supernatanten. Resuspender cellepelleten i 100 μL MOM. Utfør en automatisk celletelling ved å prøve panblå ekskludering.
MERK: Volumet kan justeres etter behov. - Plate 2,000-5,000 levedyktige celler i 75% (v / v) BME / MOM med 50 μL totalt volum per brønn. Maksimere antall belagte brønner og forberede nok celler i BME for en ekstra brønn i henhold til eksempelberegningene nevnt tidligere.
MERK: Kryokonserverer eventuelle overflødige celler i kryopreserveringsmediet (10% DMSO i FBS) ved en maksimal konsentrasjon på 1 x 106 celler / ml. Oppbevar kryovialene i en frysebeholder over natten ved -80 °C. Overfør dem til flytende nitrogen i dampfase for langtidslagring. - I et mikrosentrifugerør, lag en passende cellefortynning i MOM først, og tilsett deretter BME ved hjelp av en bred borespiss like før plettering.
- Bruk en 200 μL bred borespiss, tilsett sakte en 50 μL dråpe i midten av brønnen, og unngå kontakt mellom spissen og bunnen eller sidene av brønnen. Vær forsiktig så du ikke bruker for mye kraft for å utvise væsken fra spissen, ellers vil kuppelen flate ut.
- Inkuber platen i 30 minutter i en 37 °C, 5% CO 2,95% RF-inkubator.
- Tilsett forsiktig 500 μL MOM per brønn supplert med 10 μM Y-27632.
MERK: Legg til Y-27632 bare på dagen for passering (dag 0). Det er unødvendig å legge det til under medieendringene. Tilsetning av amfotericin B er ikke lenger nødvendig. - Bytt MOM på dagene 3-4 og deretter hver 2-3 dager etter det til du er klar til å passere.
- På dagene 7-10, bilde organoider, og måle OFR.
- Tining og gjenvinning av musøsofageale organoider (MEO) (tidsbetraktning: <1 time)
- Tine og holde BME på is. Forvarm en 24-brønns cellekulturplate i en 37 ° C inkubator.
- Forbered 10 ml kald eller RT MOM eller PBS i et 15 ml konisk rør.
- Tine en kryovial i et 37 °C vannbad eller perlebad i ca. 30 til 1 min eller til en liten ispellet gjenstår.
- Med en forfuktet pipetspiss overføres cellesuspensjonen sakte til slangen som inneholder MOM eller PBS på en dråpevis måte.
- Sentrifuger røret i 300 x g og 4 °C i 5 minutter for å pelletere cellene.
- Fjern og kast supernatanten. Resuspendere cellepelleten i 100 μL MOM; Juster volumet etter behov. Utfør en automatisk celletelling ved å prøve panblå ekskludering.
- Plate 5,000-10,000 levedyktige celler i 75% (v / v) BME / MOM med 50 μL totalt volum per brønn. Maksimere antall belagte brønner og forberede nok celler i BME for en ekstra brønn i henhold til eksempelberegninger nevnt tidligere.
- Fortsett med de resterende trinnene i protokollen for passering og kryopreservering av murine esophageal organoids (MEO) (se trinn 2.4.11).
3. Fremstilling av organoider for parafininnbygging (tidsvurdering: <1 time [pluss 1,5 timer for reagensfremstilling])
- Bruk en mikropipettespiss med bred boring til å samle tre brønner per mikrosentrifugerør. Samle organoider i BME-kuppelen sammen med supernatanten. Forstyrr BME ved å pipettere opp og ned.
- Kort sentrifuge i 10-15 s ved 2,000 x g for å pelletere organoider. Fjern og kast supernatanten.
- Fjern pelleten forsiktig, og resuspender pelleten i 300 μL 4% paraformaldehyd (PFA).
- Fest organoidene over natten ved 4 °C.
- Kort sentrifuge i 10-15 s ved 2,000 x g for å pelletere organoider. Fjern og kast så mye PFA som mulig.
- Fjern pelleten forsiktig, og resuspender pelleten i 500 μl PBS.
MERK: Faste organoider kan oppbevares ved 4 °C i opptil 2 uker før du går videre til neste trinn. - Forbered en 50 ml lager av agar gel (2% agar pluss 2,5% gelatin).
MERK: Forbered agargelbestanden på forhånd, på grunn av inkubasjonstiden, etterfulgt av å utføre autoklavsyklusen.- Spenne 1 g Bacto-agar og 1,25 g gelatin i 50 ml vann i et 150 ml autoklaverbart glassbeger.
- Virvle fjæringen, og la den sitte i 30-60 min på RT.
- Autoklav i 20 minutter ved 121 °C.
- Avkjøl litt og dispenser 5 ml alikoter i 15 ml koniske rør.
- Oppbevares i opptil 6 måneder ved RT.
- Forbered en innebyggingsoverflate ved å invertere et mikrosentrifugerørstativ og dekke overflaten med et ark med tetningsfilm. Etikett med tilsvarende organoid-ID(er).
- Sentrifuge røret ved 300 x g i 5 minutter for å pelletere organoider. Fjern og kast supernatanten.
- I mellomtiden fortynner agargelen ved å plassere et 15 ml konisk rør som inneholder agargelen i et 150 ml glassbeger som inneholder 100 ml vann og mikrobølgeovn på høyeste effektinnstilling i 1-2 minutter eller til vannet begynner å koke og agargelen er i flytende tilstand.
FORSIKTIG: Løsne lokket på det koniske røret som inneholder agargelen før mikrobølgeovn. - Senk mikrosentrifugerøret som inneholder organoidpelleten delvis ned i det varme vannet uten å føre vann inn i mikrosentrifugerøret.
- Legg forsiktig over organoidpelleten ved å tilsette 50 μL agar ned på siden av røret.
- Uten å forstyrre pelleten (ikke resuspendere, hold pelleten intakt), overfør pelleten i agargeldråpen til tetningsfilmen på embeddingsoverflaten.
- Gjenta trinn 3.12 og trinn 3.13 med ytterligere 50 μL flytende agargel for å samle opp eventuell gjenværende organoidpellet, og tilsett forsiktig den samme geldråpen.
- Inkuber dråpen som inneholder organoidpelleten i 45 minutter ved 4 °C.
- Bruk tang, overfør forsiktig dråpen som inneholder organoidpelleten til en merket patologikassett.
- Oppbevar kassetten i 70 % etanol ved 4 °C i opptil 1 måned.
- Fortsett med parafininnstøping via rutinemessig histologisk behandling for å forberede parafinblokker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver prosessen med å generere murine esophageal organoids (MEOs) fra normalt esophageal vev eller ESCC-tumorvev fra 4NQO-behandlede mus i henhold til et spesifikt behandlingsregime bestående av 16 uker med 4NQO administrert i drikkevann, etterfulgt av en 10 ukers til 12 ukers observasjonsperiode (figur 1). Musene avlives deretter for disseksjon av tunge eller spiserørsvev (figur 2 og figur 3). Vi beskriver en metode for isolering av epitellaget fra intakt spiserør (figur 4) som skal benyttes ved senere encelleisolering. Epitelceller fra spiserøret er opprinnelig belagt med 5000 celler per brønn i 50 μL dråper inneholdende celler i en kjellermembranmatrise og godt karakterisert serumfritt cellekulturmedium (figur 5) og får danne organoider i løpet av 7-10 dager i gjennomsnitt. Murine esophagus, tunge og forestomach organoider kan videre karakteriseres ved morfologisk analyse ved fasekontrast/brightfield-avbildning og histopatologi (figur 6). Organoidenes selvfornyelseskapasitet kan vurderes ved å bestemme OFR ved subkultur (figur 7). OFR påvirkes i stor grad av innholdet i de proliferative basaloidcellene, noe vekstkinetikkanalysen kombinert med deres morfologi viser (figur 8). Til slutt vokser disse organoidene, inkludert normale strukturer fra 4NQO-ubehandlede mus, kontinuerlig og kan opprettholdes i lang tid (figur 9).
Figur 1: Behandlingsregimet 4NQO. Musene behandles med 4NQO i drikkevann i 16 uker, etterfulgt av en 10 ukers til 12 ukers observasjonsperiode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Eksponering av torakal øsofagus. Luftrøret (blå linjer) skrelles bort fra spiserøret (hvite linjer). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Spiserør (hvite linjer) forbundet med magesekken (gule linjer) i plateepitelovergangen (blå linje). Forkortelser: FS = formage, DS = distal mage, L = lever. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Separering av magesekk og spiserør og isolering av epitelet. Øvre: Magen er skilt fra spiserøret. Den røde linjen angir hvor spiserøret skal løsnes under disseksjon. Midten: Epitelet (hvit linje) skrelles bort fra muskellaget. Nedre: Spiserørsbærende svulster etter behandlingsforløpet beskrevet i figur 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Plettering av BME-dråpen som inneholder enkeltceller ved hjelp av en bred borespiss. Organoidene begynner å danne seg rundt dagene 4-7 og er klare til å bli passert etter 7-10 dager i gjennomsnitt. Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Karakterisering av organoidene ved morfologisk analyse. (A) Representative bilder av normale og ESCC MEOer. Øverst til venstre: Brightfield-bilde av en normal MEO. Nederst til venstre: H&E-farging av normal MEO. Øverst til høyre: Brightfield-bilde av en ESCC MEO fra en 4NQO-behandlet mus. Nederst til høyre: H&E-farging av en ESCC MEO fra en 4NQO-behandlet mus som viser nukleær atypi og brå keratinisering, sistnevnte minner om en keratinperle, som representerer et godt differensiert rom i en SCC-svulst. (B) Representative bilder av normale musetunge og mageorganoider (henholdsvis MTO og MFO). Øverst til venstre: Brightfield-bilde av en vanlig MTO. Nederst til venstre: H&E-farging av en normal MTO. Øverst til høyre: Brightfield-bilde av en vanlig MFO. Nederst til høyre: H&E-farging av en normal MFO. Alle skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Bestemmelse av organoid fornyelseskapasitet. (A) Eksperimentell design for å bestemme organoid fornyelseskapasitet ved subkultur. De voksende primære organoider (P0) dissosieres på forskjellige tidspunkter og gjøres til encellede suspensjoner. Disse cellene passeres for å bestemme OFR på dag 7 i subkulturen (P1). (B) Representative OFR-data fra passerte MEOer generert fra 4NQO-ubehandlede mus. Merk at OFR avtar som funksjon av tid, noe som reflekterer reduserte proliferative basaloide celler i de modne organoidene, som inneholder flere celler som har gjennomgått postmitotisk terminal differensiering (se figur 8). p < 0,001 (n = 6) OFR på dag 7, dag 11 og dag 21 versus OFR på dag 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Vekstkinetikk av organoider som avslørt av deres morfologi på forskjellige tidspunkter. Representative lysfelt- og H&E-fargebilder av en normal MEO fra 4NQO-ubehandlede mus er vist. Legg merke til at keratiniseringen av den indre kjernen av organoider blir fremtredende ved dag 10. De proliferative basaloidcellene forblir i det ytterste cellelaget selv på dag 14 og dag 21 tidspunkter. For immunhistokjemi / immunfluorescens kan akkumulert keratin forårsake uspesifikk farging, som tilfellet er for originale plateepitelvev, noe som garanterer en nøye optimalisering av fargeforholdene, kontroller (f.eks. Kun sekundært antistoff) og datatolkning. Alle skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: En populasjonsdoblingskurve for en representativ normal MTO generert fra 4NQO-ubehandlede mus. Disse organoidene ble tidligere generert, kryopreservert og tint for å demonstrere deres jevne vekst over flere passasjer og langsiktig kultur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere kritiske trinn og hensyn til generering og analyse av MEOer i protokollene beskrevet her. For å sikre reproduserbarhet og strenghet i MEO-eksperimenter er både biologiske og tekniske replikater viktige. For biologiske replikater er to til tre uavhengige mus som bærer ESCC generelt tilstrekkelig per eksperimentell tilstand. Imidlertid kan riktig antall biologiske replikater variere avhengig av parametrene som skal testes i individuelle studier. For eksempel er det foreløpig ukjent hvor tidlig og hvor ofte neoplastiske organoider kan påvises fra 4NQO-behandlede mus uten makroskopisk synlige lesjoner eller histologiske IEN- og ESCC-lesjoner. Selv om 4NQO induserer esophageal lesjoner i forskjellige musestammer14, har MEO kun blitt generert fra C57BL / 6 mus. Utviklingen og progresjonen av ESCC akselereres hos mus med genetisk konstruerte genetiske lesjoner som Trp53-tap og cyklin D1-overuttrykk 7,14,15. I slike mus kan neoplastiske MEOer oppstå hyppigere og tidligere enn i villtype C57BL/6-mus under eller etter 4NQO-behandling. Om nødvendig bør det utføres pilotstudier for å estimere riktig prøvestørrelse på mus i planlagte forsøk. Med flerbrønns cellekulturplater kan tekniske replikater (n = 3-6) enkelt opprettes. Forsiktig pipettering og praksis er imidlertid nødvendig for å minimere variasjon fra brønn til brønn ettersom cellene dispenseres i et tyktflytende medium som inneholder BME.
En nær 100% suksessrate kan forventes for MEO-etablering i protokollene som er beskrevet. Imidlertid avhenger vellykket MEO-kultur av levedyktigheten til de første isolerte esophageal epitelceller, som i stor grad er relatert til kvaliteten på utgangsmaterialet. Når musene ikke umiddelbart kan dissekeres ved avlivning, kan skrottene holdes ved 4 °C over natten for å isolere spiserøret neste dag. Slaktkroppene bør imidlertid ikke fryses, da frosset vev ikke vil gi levedyktige celler. De dissosierte esophageal epitelceller kan kryopreserveres som en enkeltcelle suspensjon i et frysemedium (90% FBS og 10% DMSO) og lagres i flytende nitrogen for å generere organoider på et senere tidspunkt. Esophagi (epitelark) kan være kryopreservert på lignende måte, om enn mindre optimalt. Mens MEO kan initieres med celler renset ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og andre metoder for å rense unike undergrupper av esophageal epitelceller, kan cellens levedyktighet bli redusert etter rensing. Det skal bemerkes at cellelevedyktighetsanalyser som trypanblå ekskluderingstest kan skille levende celler fra døde celler, men ikke døende celler, og dermed undervurdere cellens levedyktighet før organoidkulturinitiering. Etter etablering kan MEO fra både 4NQO-behandlede og ubehandlede mus passeres på ubestemt tid (>20 passasjer), med >80% levedyktighet forventet ved hver passasje i det angitte mediet. Det er bemerkelsesverdig at det er organoide mediumkomponenter hvis krav forblir uklare. Zheng et al. viste nylig at et supplement bestående av Wnt3A, RSpondin-1 og Noggin er nødvendig for å dyrke murine esophageal organoider16. Vi bruker imidlertid ikke Wnt3A i denne protokollen da organoider fra tunge, spiserør og magesekk vokser og kan passeres flere ganger (>10 passasjer) uten at det 7,3,17. Det skal bemerkes at kravene til disse faktorene ikke er testet individuelt.
Epitelark benyttes til å generere MEO fra normal spiserør eller esophageal mucosa uten makroskopisk synlige lesjoner som svulster. Bruk av epitelplater tillater anrikning av epitelceller som utgangsmateriale. Imidlertid er isoleringen av epitelarkene fra den tumorbærende esophageal mucosa vanskelig på grunn av ESCC-invasjon i subepiteliale rom. Hele spiserøret kan brukes til å initiere MEO-kultur, selv om tilstedeværelsen av ikke-epitelcellepopulasjoner kan redusere organoiddannelseshastigheten (OFR) i initialkulturen. OFR forventes å stige i de påfølgende passasjene, ettersom de nåværende MEO-kulturbetingelsene tillater epitelceller å vokse i BME. Merk at protokollene beskrevet her også kan brukes på andre organer, spesielt munntungen og formagen, som begge er utsatt for 4NQO-indusert plateepitelkarsinogenese. Merk at vi har generert musetungeorganoider (MTO) og musens mageorganoider (MFO) fra hele vevet uten å isolere epitelcellene. Om nødvendig kan disse organoider fremstilles fra en underpopulasjon av epitelceller renset ved fluorescensaktivert cellesortering (f.eks. Kreftstamceller karakterisert ved høyt CD44-uttrykk, CD73+ antatte esophageal stamceller).
I tillegg kan ikke-epitelceller, spesielt fibroblaster, migrere ut av BME for å vokse i et monolag på plastoverflaten, og dermed tillate samtidig etablering av murine esophageal fibroblaster, inkludert kreftassosierte fibroblaster. Selektiviteten for epitelcellevekst i 3D BME kan begrense samdyrking av MEO med immunceller og andre celletyper under de nåværende forholdene beskrevet her. Optimalisering for samkultureksperimenter er i gang. I tillegg kan den tumorinvasive fronten bli bedre rekapitulert i epitel-stromale grensesnittet modellert av alternative 3D-kulturmetoder som organotypisk 3D-kultur 8,18. Videre kan MEOer ikke være en egnet plattform for å måle epitelbarrierefunksjonen, som bedre kan evalueres ved å bruke luft-væske-grensesnittkultur for å vurdere transepitelial elektrisk motstand 19,20,21.
Den fremste fordelen med MEOer, og faktisk MTOer og MFOer, er den raske veksten av enkeltcellederiverte strukturer som rekapitulerer de opprinnelige epitelstrukturene, både godartede og ondartede. Doblingstiden (DT) for disse organoidene er vanligvis estimert til å være <20 timer. Vekstkinetikken til normale MTOer fra 4NQO-ubehandlede mus illustrerer både evnen til langtidskultur av normale organoider, samt forventet populasjonsdobling (PD) nivå og DT (figur 9). I dette eksemplet skjedde omtrent 10 populasjonsdoblinger under hver passering, med en beregnet DT på 18,5 timer og 18,3 timer i gjennomsnitt. Etter den første primærkulturen forventes vanligvis en OFR på 15%-25%, uavhengig av såtetthet, og MEOer kan dukke opp så tidlig som dag 4 (figur 8), selv om de kan være mindre i størrelse. Under fasekontrastmikroskopi viser organoider fra den normale esophageal mucosa sfæriske strukturer med glatte overflater. Som en funksjon av tid viser normale organoider en konsentrisk struktur når den indre cellemassen gjennomgår postmitotisk terminal differensiering, og genererer en differensieringsgradient som etterligner det stratifiserte plateepitelet. Neoplastiske organoider viser uregelmessige overflater, noe som reflekterer den høye proliferative aktiviteten til basaloidcellene, som kan ekspandere på en utadgående måte. MEOs evne til å vise en proliferasjonsdifferensieringsgradient kan brukes til å studere hvordan proliferative esophageal basale keratinocytter kan forplante seg og gjennomgå postmitotisk terminal differensiering. Ved subkulturering av dissosierte MEO-celler kan man evaluere selvfornyelse av epitelceller (figur 7), samt regenerering eller transformasjon under genotoksisk stress indusert av 4NQO. Lignende studier kan også utføres ved bruk av MTO-modellen i sammenheng med oral kreft, og utvider anvendelsen av den beskrevne 4NQO museorganoidmodellen til SCC for hode og nakke. Mens epitelfornyelse kan innebære stamceller, er en potensiell svakhet ved MEO-systemet at det kanskje ikke oppdager hvilende eller sjelden deler stamceller, da MEO-dannelse avhenger av celleproliferasjon. En nylig enkeltcelleanalysestudie på MEO ga betydelig innsikt i esophageal epitelcelleheterogenitet22.
Ondartet transformasjon kan vurderes ved nøye morfologisk vurdering av individuelle MEO-strukturer og nukleær atypi av celler som omfatter MEOer. Den molekylære profileringen av MEO ved heleksomsekvensering og RNA-sekvensering kan avsløre den distinkte naturen til preneoplastiske og ESCC-lesjoner. Den endelige testen for ondartet transformasjon kan imidlertid kreve transplantasjon av MEO i enten immundefekte eller immunkompetente mus for å dokumentere tumorgenisiteten til ESCC-cellene. ESCC MEOs transplantert i syngene immunkompetente mus kan også gi en utmerket plattform for å undersøke tumorimmunmikromiljøet.
Anvendelsene av MEOer er brede. I tillegg til morfologi, biokjemi og multi-omics-tilnærminger, kan flowcytometri brukes ikke bare til å analysere cellulære prosesser som DNA-syntese, apoptose, autofagi og mitokondriell respirasjon, men også celleoverflatemarkører som definerer unike undergrupper av celler i MEO som samsvarer med genetiske og farmakologiske modifikasjoner ex vivo 7,23 . Videre kan organoider brukes til samkultureksperimenter for å evaluere samspillet mellom epitelceller og stroma, immunceller eller til og med mikrobiomet24. Endelig kan MEO genereres fra mus som bærer celleavstamningssporbare genetiske modifikasjoner, for eksempel fluorescerende reporterprotein uttrykt under en celletypespesifikk genregulatorisk promotor (f.eks. Sox2, cytokeratins Krt5 og Krt15) 3,4,7,25.
Oppsummert er MEO et uvurderlig verktøy for studiet av ESCC. Protokollene beskrevet her tar sikte på å vise at MEOer representerer en allsidig modell som er relativt enkel å generere, vedlikeholde og karakterisere og har evnen til å rekapitulere funksjonene til ESCC og esophageal neoplasi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker de delte ressursene (flowcytometri, molekylær patologi og konfokal og spesialisert mikroskopi) ved Herbert Irving Comprehensive Cancer Center ved Columbia University for teknisk støtte. Vi takker Dr. Alan Diehl, Adam J. Bass og Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) og medlemmer av Rustgi og Nakagawa laboratorier for nyttige diskusjoner. Denne studien ble støttet av følgende NIH Grants: P01CA098101 (H.N. og A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. og H.N.) og P30CA013696 (A.K.R.). H.N. og C.L. er mottakere av Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award. H.N. er mottaker av Fanconi Anemia Research Fund Award. FMH er mottaker av The Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) og en American Association for Cancer Research Award. J.G. er mottaker av American Gastroenterological Association (AGA)-prisen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
References
- Rustgi, A. K., El-Serag, H. B.
- Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
- Giroux, V., et al. Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kinugasa, H., et al. Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression. Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).
- Whelan, K. A., et al. Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance. Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).
- Natsuizaka, M., et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma. Nature Communications. 8 (1), 1758 (2017).
- Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).
- Sachdeva, U. M., et al. Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids. Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).
- Nakagawa, H., et al. The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach. Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Opitz, O. G., et al. A mouse model of human oral-esophageal cancer. The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).
- Stairs, D. B., et al. Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene. Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).
- Tang, X. -H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).
- Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis. Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- Hisha, H., et al. Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells. Scientific Reports. 3, 3224 (2013).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Nguyen, N., et al. TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).
- Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).
- Ruffner, M. A., et al. Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity. Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).
- Kabir, M. F., et al. Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Shimonosono, M., et al. Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy. Biomolecules. 11 (10), 1479 (2021).
- Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. 3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers. Microorganisms. 9 (11), 2182 (2021).
- Liu, K., et al. Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).
