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निकटता बंधाव परख द्वारा ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया संपर्क साइटों पर अंतर्जात इंट्रा-ऑर्गेनेल प्रोटीन इंटरैक्शन का विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/64750
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2
1Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Saclay, 2Inserm U1280, 3Imagerie-Gif, Light Microscopy Facility, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Saclay

Summary

इन सेलुलर संरचनाओं और उनके घटकों का अध्ययन करने में बढ़ती रुचि के कारण झिल्ली संपर्क साइटों (एमसीएस) का अध्ययन करने के लिए नए दृष्टिकोणों की आवश्यकता बढ़ गई है। यहां, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो एमसीएस में रहने वाले इंट्रा-ऑर्गेनेल और इंटर-ऑर्गेनेल प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए पहले से उपलब्ध माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियों को एकीकृत करता है।

Abstract

झिल्ली संपर्क स्थल (एमसीएस) करीबी झिल्ली निकटता के क्षेत्र हैं जो झिल्ली संलयन को शामिल किए बिना मिश्रित जीवों के बीच विविध बायोमोलेक्यूल्स (यानी, कैल्शियम और लिपिड) के गतिशील आदान-प्रदान की अनुमति देते हैं और विनियमित करते हैं। सेलुलर होमियोस्टैसिस के लिए एमसीएस आवश्यक हैं, और उनके कार्यों को निवासी घटकों द्वारा सुनिश्चित किया जाता है, जो अक्सर मल्टीमेरिक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के रूप में मौजूद होते हैं। एमसीएस में अक्सर एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) शामिल होता है, जो लिपिड संश्लेषण और सेलुलर कैल्शियम भंडारण की एक प्रमुख साइट है, और माइटोकॉन्ड्रिया जैसे ऑर्गेनेल के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं, जिन्हें शास्त्रीय वेसिकुलर परिवहन मार्गों से बाहर रखा गया है। पिछले वर्षों में, ईआर और माइटोकॉन्ड्रिया के बीच एमसीएस का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, क्योंकि उनके कार्य सेलुलर चयापचय / बायोएनर्जेटिक को दृढ़ता से प्रभावित करते हैं। इन संपर्क स्थलों पर कई प्रोटीनों की पहचान की जाने लगी है, जिसमें झिल्ली टेथर, कैल्शियम चैनल और लिपिड ट्रांसफर प्रोटीन शामिल हैं, इस प्रकार इन एमसीएस घटकों का अध्ययन करने के लिए नई पद्धतियों और तकनीकी दृष्टिकोण की आवश्यकता बढ़ गई है। यहां, हम संयुक्त तकनीकी दृष्टिकोणों से युक्त एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें निकटता बंधाव परख (पीएलए), माइटोकॉन्ड्रिया धुंधला और 3 डी इमेजिंग विभाजन शामिल हैं, जो प्रोटीन का पता लगाने की अनुमति देता है जो शारीरिक रूप से एक दूसरे के करीब (>40 एनएम) हैं और जो ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया एमसीएस में एक ही झिल्ली पर रहते हैं। उदाहरण के लिए, हमने दो ईआर-लंगर वाले लिपिड ट्रांसफर प्रोटीन, ओआरपी 5 और ओआरपी 8 का उपयोग किया, जिन्हें पहले ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया और ईआर-प्लाज्मा झिल्ली एमसीएस में बातचीत और स्थानीयकरण करने के लिए दिखाया गया है। सेल इमेजिंग सॉफ्टवेयर विश्लेषण के साथ ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए को जोड़कर, माइटोकॉन्ड्रियल सतह से ओआरपी 5-ओआरपी 8 कॉम्प्लेक्स की दूरी का अनुमान लगाना और यह निर्धारित करना संभव था कि ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए इंटरैक्शन का लगभग 50% ईआर उपडोमेन में माइटोकॉन्ड्रिया के निकट निकटता में होता है।

Introduction

इंटर-ऑर्गेनेल संचार यूकेरियोटिक कोशिकाओं की एक परिभाषित विशेषता है। एक तरीका जिसमें ऑर्गेनेल संवाद करते हैं, झिल्ली संपर्क साइटों (एमसीएस) का निर्माण करके होता है, जो दो ऑर्गेनेल के बीच करीबी झिल्ली विरोध होते हैं जो संरचनात्मक और कार्यात्मक प्रोटीन द्वारा बनाए रखे जाते हैं, जैसे कि टेथर, लिपिड ट्रांसफर प्रोटीन और कैल्शियम चैनल1। एमसीएस को समान या विभिन्न ऑर्गेनेल के बीच स्थापित किया जा सकता है, और वे सेलुलर घटकों के आदान-प्रदान में मध्यस्थता करते हैं, जो सेलुलर होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। आज तक, कई एमसीएस की पहचान की गई है, जिसमें एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर)-माइटोकॉन्ड्रिया, ईआर-प्लाज्मा झिल्ली (पीएम), और ईआर-लिपिड ड्रॉपलेट (एलडी) संपर्क1 शामिल हैं। उनमें से, ईआर और माइटोकॉन्ड्रिया (एमईआरसीएस) के बीच गठित लोग सबसे अधिक अध्ययन किए गए हैं क्योंकि वे लिपिड और कैल्शियम होमियोस्टैसिस2 सहित कई सेलुलर कार्यों के विनियमन में शामिल हैं। चूंकि माइटोकॉन्ड्रिया को शास्त्रीय वेसिकुलर परिवहन मार्गों से काफी हद तक बाहर रखा गया है, वे ईआर से प्रमुख लिपिड या लिपिड अग्रदूतों को आयात करने के लिए एमईआरसीएस और उनके आणविक घटकों पर भरोसा करते हैं। एमईआरसीएस में इन लिपिडों का गैर-वेसिकुलर परिवहन उचित माइटोकॉन्ड्रियल लिपिड संरचना के रखरखाव के साथ-साथ उनकी कार्यात्मक औरसंरचनात्मक अखंडता सुनिश्चित करता है।

विभिन्न सेलुलर कार्यों में एमसीएस की महत्वपूर्ण भागीदारी को देखते हुए, पिछले वर्षों में उनके आणविक घटकों की गहरी समझ प्रदान करने में रुचि बहुत बढ़ गई है। एमसीएस पर ज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए कई प्रकार के इमेजिंग-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग किया गया है। उनमें से, प्रतिदीप्ति जांच-आधारित निकटता बंधाव परख (पीएलए) का व्यापक रूप से अंतर्जातस्तरों 4 पर अंतर-ऑर्गेनेल प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (40 एनएम की पहचान सीमा में) का पता लगाकर एमसीएस की प्रचुरता के संकेतक के रूप में उपयोग किया गया है। उदाहरण के लिए, MERCS को VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 और PTPIP51-VAPB 5,6,7,8 सहित कई माइटोकॉन्ड्रिया-ईआर प्रोटीन जोड़े के बीच PLA का उपयोग करके कल्पना और परिमाणित किया गया है। यद्यपि इस तकनीक का उपयोग एमसीएस 5,7,9,10,11 में मौजूद अंतर-ऑर्गेनेल प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया है, लेकिन अधिकांश अध्ययनों ने पीएलए को ऑर्गेनेल स्टेनिंग के साथ नहीं जोड़ा। नतीजतन, एक मात्रात्मक विधि जो पीएलए इंटरैक्शन और संबंधित ऑर्गेनेल के बीच निकटता के माप की अनुमति देती है, अभी तक विकसित नहीं हुई है। इस प्रकार, अब तक, ईआर प्रोटीन के मामले में, अन्य ऑर्गेनेल के संपर्क में झिल्ली उपडोमेन के भीतर उनकी बातचीत को व्यापक रूप से वितरित ईआर नेटवर्क के भीतर उनकी बातचीत से अलग नहीं किया गया है।

यहां, हम एक ही ऑर्गेनेल की झिल्ली में रहने वाले प्रोटीन के बीच पीएलए इंटरैक्शन का पता लगाने और एमसीएस में पार्टनर ऑर्गेनेल की झिल्ली से उनकी निकटता का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह प्रोटोकॉल दो परिसरों के आधार पर विकसित किया गया था: 1) पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि, ओवरएक्प्रेशन स्थितियों में, ईआर लिपिड ट्रांसफर प्रोटीन ओआरपी 5 और ओआरपी 8 ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया और ईआर-पीएम एमसीएस 12,13,14,15 पर सह-स्थानीयकरण और बातचीत करते हैं और ओआरपी 5 ईआर-एलडी संपर्कों16,17 पर स्थानीयकृत होता है; 2) पीएलए, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, ऑर्गेनेल लेबलिंग और 3 डी इमेजिंग विश्लेषण सहित मौजूदा प्रौद्योगिकियां।

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Protocol

1. माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला पन और निकटता बंधाव परख (पीएलए)

  1. प्लेट 0.5 x 10 5-2 x 10 5हेला कोशिकाएं, जिन्हें डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में बनाए रखा जाता है, 10% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ पूरक किया जाता है, 13 मिमी ग्लास कवरलिप्स में 24-वेल प्लेटों में1.5 में एक कमजोर पड़ने पर जो प्रक्रिया के दिन 75% -90% सेल संगम की अनुमति देता है।
    नोट: ध्यान दें, हेला कोशिकाओं को माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला होने और पीएलए से पहले अतिरिक्त उपचार, जैसे कि सीआरएनए उपचार और / या डीएनए प्लास्मिड अभिकर्मक के लिए प्रस्तुत किया जा सकता है।
  2. माइटोकॉन्ड्रियल धुंधलापन
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गर्म सीरम मुक्त माध्यम में कोशिकाओं को एक बार धो लें। कोशिकाओं को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पूर्व-गर्म सीरम-मुक्त माध्यम के साथ इनक्यूबेट करें।
    2. पूर्व-गर्म सीरम-मुक्त माध्यम में 1 μM लाल माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर तैयार करें।
    3. कोशिकाओं को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर समाधान के 500 μL के साथ इनक्यूबेट करें। माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर उपचार और प्रोटोकॉल के निम्नलिखित चरणों के दौरान, कवरलिप्स पर कोशिकाओं को जितना संभव हो उतना प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    4. इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को पूर्व-गर्म सीरम मुक्त माध्यम में 1x और 1x फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (PBS) में 2x धो लें। इस चरण को जितनी जल्दी हो सके करें क्योंकि निर्धारण से पहले लंबे समय तक धोने के कदम माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान को प्रभावित कर सकते हैं।
    5. कवरलिप्स से 1x PBS को निकालें, और रासायनिक हुड के तहत कमरे के तापमान (अंधेरे में) पर 30 मिनट के लिए ताजा तैयार 4% पीएफए (1x PBS में) में उन्हें इंजेक्ट करके कोशिकाओं को ठीक करें। 1x PBS के 500 μL में 2 मिनट के लिए 3x धोएं (डिस्पोजेबल पिपेट ्स या पंप से जुड़े वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करके)।
    6. 1x PBS को निकालें, और कमरे के तापमान (अंधेरे में) पर 15 मिनट के लिए 50mM NH4Cl के 500 μL के साथ कवरलिप्स को इनक्यूबेट करें। वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करके 1x PSB के 500 μL में 2 मिनट के लिए 1x धोएं।
    7. ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए के लिए बफर 1 (बीबी 1, 1% बीएसए, 1एक्स पीबीएस में 0.1% सैपोनिन) या ओआरपी 8-PTPIP51 पीएलए के लिए बफर 2 (बीबी 2, 2% बीएसए, 0.1% सामान्य बकरी सीरम, 1 x पीबीएस में 0.1 सैपोनिन) को अवरुद्ध करने के 500 μL में 2 मिनट के लिए 3x धोएं।
    8. 24-वेल प्लेट से कवरलिप्स को आर्द्रता कक्ष में स्थानांतरित करें। कक्ष में कवरलिप्स को स्थानांतरित करने के बाद, सूखापन से बचने के लिए बीबी के 100 μL (बीबी 1 या बीबी 2, उपयोग किए गए एंटीबॉडी के जोड़े के अनुसार) जोड़ें।
      नोट: प्रकाश से संरक्षित एक आर्द्रता कक्ष एल्यूमीनियम पन्नी में पेट्री डिश (प्लास्टिक या ग्लास) लपेटकर और पेट्री डिश की परिधि में गीले पेपर तौलिया के कुछ टुकड़े जोड़कर आसानी से और तेजी से प्राप्त किया जा सकता है।
  3. निकटता बंधाव परख (पीएलए)
    नोट: पीएलए प्रोटोकॉल मामूली संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों का पालन करता है।
    1. प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन
      1. प्राथमिक एंटीबॉडी काम करने वाला समाधान तैयार करें। बीबी 1 में पतला खरगोश एंटी-ओआरपी 5 (1:150) प्लस माउस एंटी-ओआरपी 8 (1:200), बीबी 2 में माउस एंटी-ओआरपी 8 (1:200) प्लस खरगोश विरोधी PTPIP51 (1:200), और बीबी 1 में खरगोश एंटी-ओआरपी 5 (1:150) प्लस माउस एंटी-PTPIP51 (1:200)। प्रति कवरस्लिप प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के (कम से कम) 40 μL तैयार करें (उदाहरण के लिए, खरगोश एंटी-ओआरपी 5 का 0.27 μL, माउस एंटी-ओआरपी 8 का 0.2 μL, BB1 का 39.53 μL)।
      2. वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करके पिछले वॉश (चरण 1.2.8) से बीबी को हटा दें, और कवरलिप्स में 40 μL प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें। प्रकाश से संरक्षित आर्द्रता कक्ष में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करके संबंधित बीबी के 100 μL के साथ 5 मिनट के लिए 3x कवरलिप्स धोएं।
    3. पीएलए की जांच इनक्यूबेशन
      1. पीएलए प्रोब्स वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें। बीबी में पतला खरगोश प्लस (1: 5) और माउस माइनस (1: 5) पीएलए जांच, और मिश्रण। प्रत्येक कवरस्लिप के लिए, पीएलए जांच समाधान के (कम से कम) 40 μL तैयार करें (उदाहरण के लिए, खरगोश प्लस पीएलए जांच का 8 μL, माउस माइनस पीएलए जांच का 8 μL, BB का 24 μL)। उपयोग से पहले पीएलए जांच समाधान को कमरे के तापमान पर 20 मिनट तक बैठने दें।
      2. वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करके बीबी को कवरलिप्स (चरण 1.3.2 से) से हटा दें, और कवरलिप्स में पीएलए जांच समाधान के 40 μL जोड़ें। प्रकाश से संरक्षित आर्द्रता कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. कमरे के तापमान पर 1x वॉश बफर A के 100 μL में 5 मिनट के लिए कवरलिप्स 2x धोएं।
    5. बंधाव
      1. अल्ट्रा-शुद्ध पानी में 5x बंधाव बफर को 1: 5 तक पतला करें और मिलाएं। प्रत्येक कवरस्लिप के लिए, (कम से कम) 40 μL बंधाव समाधान तैयार करें (5x बंधाव बफर का 8 μL, 31 μL अल्ट्रा-शुद्ध पानी)।
      2. पिछले चरण में तैयार किए गए 1x लिगेशन बफर में लिगेज (पीएलए किट में आपूर्ति की गई 1 यू / μL) जोड़ें, और मिलाएं।
      3. वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करके कवरलिप्स (चरण 1.3.4 से) से 1x वॉश बफर ए निकालें, कवरलिप्स में 40 μL लिगेज समाधान जोड़ें, और प्रकाश से सुरक्षित आर्द्रता कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करके कमरे के तापमान पर 1x वॉश बफर ए के 100 μL में 2 x के लिए कवरलिप्स 2x धोएं।
    7. बहुलकीकरण
      1. अल्ट्रा-शुद्ध पानी में 5x प्रवर्धन बफर 1: 5 पतला करें, और मिलाएं। प्रत्येक कवरस्लिप के लिए, (कम से कम) 40 μL प्रवर्धन समाधान (5x प्रवर्धन बफर का 8 μL, अल्ट्रा-शुद्ध पानी का 31.5 μL) तैयार करें।
      2. पोलीमरेज़ (10 यू / μL, पीएलए किट में आपूर्ति की गई) को 1: 80 के कमजोर पड़ने पर पिछले चरण में तैयार किए गए 1x पोलीमराइजेशन बफर में जोड़ें, और मिलाएं।
      3. वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करके कवरलिप्स (चरण 1.3.6 से) से 1x वॉश बफर ए निकालें, कवरलिप्स में 40 μL पोलीमरेज़ घोल जोड़ें, और प्रकाश से संरक्षित आर्द्रता कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे 40 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    8. कवरलिप्स से पोलीमरेज़ घोल निकालें, और प्रकाश से संरक्षित आर्द्रता कक्ष में कमरे के तापमान पर 1x वॉश बफर बी के 100 μL में 10 मिनट के लिए 2x धोएं।
    9. प्रकाश से संरक्षित आर्द्रता कक्ष में कमरे के तापमान पर 0.001x वॉश बफर बी के 100 μL में 1 मिनट के लिए कवरलिप्स 1x धोएं।
    10. DAPI (1.6-0.4 μg / mL के बीच एकाग्रता) के साथ माउंटिंग माध्यम का उपयोग करके माइक्रोस्कोपी के लिए ग्लास स्लाइड पर कवरलिप्स माउंट करें। नेल पॉलिश से सील करें।

2. छवि अधिग्रहण

  1. पीएलए परिणामों का निरीक्षण करें, और साथ के सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 63x तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ फ्लोरेसेंस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके छवियां प्राप्त करें।
  2. 405 एनएम लेजर डायोड या एक सफेद प्रकाश लेजर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति उत्तेजना सेट करें, और जीएएएसपी पीएमटी या हाइब्रिड डिटेक्टरों के साथ वर्णक्रमीय खिड़कियां एकत्र करें। प्रत्येक फोकल प्लेन (300 एनएम तक फैले) पर, पीएलए के लिए प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त करें (3एक्स = 488 एनएम, 3एम = 505-560 एनएम) और माइटोकॉन्ड्रिया (एक्स = 543 एनएम, 306-670 एनएम)।

3. माइटोकॉन्ड्रिया से जुड़े पीएलए स्पॉट की छवि प्रसंस्करण और मूल्यांकन।

  1. छवि विश्लेषण के लिए एक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कॉन्फोकल छवियों को संसाधित करें जो सेलुलर घटकों के बीच दूरी के नक्शे उत्पन्न करता है। पीएलए स्पॉट और माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क के 3 डी पुनर्गठन उत्पन्न करने और सेल इमेजिंग सॉफ्टवेयर (चित्रा 1) का उपयोग करके उनके बीच की दूरी तक पहुंचने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
  2. 3 डी दूरी मानचित्र एक्सटेंशन की स्थापना
    1. एक्सटी विकल्प और MATLAB सॉफ़्टवेयर या केवल MATLAB कंपाइलर रनटाइम (MRC) के साथ सेल विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पैकेज दोनों स्थापित करें, जिसे वेबसाइट से स्वतंत्र रूप से डाउनलोड किया जा सकता है।
    2. XTension लॉन्च होने पर MATLAB प्रारंभ करने के लिए सेल विश्लेषण सॉफ़्टवेयर निम्नानुसार सेट करें: विकल्प Imaris (Mac OS X) या संपादन मेनू (विंडोज) से, प्राथमिकताएं चुनें, कस्टम उपकरण पैनल में बदलें, और तब पथ सेट करें:
      C:\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe Windows के लिए या/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab for Mac OS X.
  3. छवियों को सॉफ़्टवेयर में आयात करें
    1. कॉन्फोकल स्टैक छवियों को एक में परिवर्तित करें। आईएमएस फ़ाइल, या तो सीधे एरिना अनुभाग के माध्यम से या स्टैंडअलोन फ़ाइल कनवर्टर का उपयोग करके जो बैच रूपांतरण की अनुमति देता है।
    2. आयात के बाद, जांचें कि छवियां ठीक से कैलिब्रेट डे हैं। छवि ज्यामिति > छवि गुण संपादित करें > पर क्लिक करें, और जांचें कि वोक्सेल आकार वास्तविक छवि के लिए अपेक्षित पिक्सेल आकार से एक्स और वाई में मेल खाता है (अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में छवि अंशांकन देखें) और जेड में वोक्सेल आकार जेड-स्टैक उत्पन्न करने के लिए माइक्रोस्कोप द्वारा लागू चरण से मेल खाता है। यदि मान सही नहीं हैं, तो निम्न चरणों में दूरी का सही अनुमान सुनिश्चित करने के लिए उन्हें संशोधित करें।
    3. प्रदर्शन समायोजन संपादित करें > दिखाएँ पर क्लिक करके मेनू प्रदर्शन समायोजन में विभिन्न चैनलों के कंट्रास्ट को समायोजित करें। प्रत्येक रंग के प्रदर्शन को अनुकूलित करने के लिए प्रत्येक चैनल को स्वतंत्र रूप से समायोजित करें। यह चरण सीधे छवि मानों को प्रभावित नहीं करता है, लेकिन सटीक थ्रेसहोल्ड सेट करने या कमजोर वस्तुओं का पता लगाने के लिए आवश्यक है।
    4. क्रॉप 3 डी संपादित करें विकल्पों का उपयोग करके छवि को क्रॉप करके विश्लेषण > सीमित करें। दृश्य के एक ही क्षेत्र में किसी अन्य सेल का विश्लेषण करने के लिए, एक ही छवि को एक बार फिर से खोलें, और इसे अलग तरह से क्रॉप करें।
  4. ORP5-ORP8 स्पॉट डिटेक्शन
    1. नए स्पॉट जोड़ें विकल्प पर क्लिक करके ORP5 और ORP8 इंटरैक्शन के स्थान पर उत्पन्न PLA संकेतों का पता लगाएं, जो ऑब्जेक्ट्स का एक नया सेट बनाता है और स्पॉट डिटेक्शन विज़ार्ड खोलता है।
    2. उस चैनल का चयन करें जिस पर स्पॉट डिटेक्शन किया जाना चाहिए।
    3. अनुमानित XY व्यास समायोजित करें (यदि ऑब्जेक्ट का आकार भिन्न होता है तो सीमा को अनुकूलित किया जाना चाहिए) ताकि स्पॉट डिटेक्शन एल्गोरिदम को रुचि की वस्तुओं को खोजने में मदद मिल सके। ध्यान दें कि यदि चुना गया मान बहुत अधिक है, तो आस-पास की वस्तुएं फ्यूज हो जाएंगी। यदि मान बहुत छोटा है, तो एक संकेत को कई वस्तुओं के रूप में माना जा सकता है, या असामान्य संकेतों का पता लगाया जा सकता है।
    4. रुचि की वस्तुओं के आसपास स्थानीय कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए स्पॉट डिटेक्शन से पहले छवि पृष्ठभूमि को हटाने के लिए पृष्ठभूमि घटाव पर क्लिक करें।
    5. थ्रेशोल्ड पैरामीटर और सॉफ़्टवेयर ऑटो-थ्रेशोल्ड के रूप में गुणवत्ता (ऑब्जेक्ट सेंटर पर तीव्रता) रखकर स्पॉट डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड को समायोजित करें, या सभी ऑब्जेक्ट्स का पता लगाने के लिए इस मान को थोड़ा संशोधित करें। स्पॉट डिटेक्शन समाप्त होने के बाद, डिटेक्शन पैरामीटर को सहेजें, और अन्य छवियों को संसाधित करने के लिए उनका पुन: उपयोग करें।
  5. माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क का पता लगाना।
    1. एक नया ऑब्जेक्ट बनाने के लिए नई सरफेस जोड़ें पर क्लिक करके सतह रेंडरिंग उत्पन्न करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क का पता लगाएं, और सतह का पता लगाने वाला विज़ार्ड खोलें।
    2. उस चैनल का चयन करें जिस पर सतह निर्माण किया जाना चाहिए।
    3. चिकनी चेकबॉक्स पर क्लिक करके और सतह पर देखे जाने वाले सबसे छोटे विवरण को इंगित करने वाली एक सीमा निर्धारित करके चिकनी सतह प्राप्त करने के लिए गॉसियन फ़िल्टर लागू करें।
    4. स्थानीय विरोधाभासों को बढ़ाने और दहलीज चरण में मदद करने के लिए पृष्ठभूमि घटाव करें।
    5. सिग्नल की तीव्रता के आधार पर माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क का पता लगाने के लिए दहलीज को समायोजित करें। यदि सीमा को ठीक से सेट करना मुश्किल है, तो चिकनाई और पृष्ठभूमि घटाव की डिग्री को समायोजित करने के लिए पिछले चरण पर वापस जाने की सिफारिश की जाती है।
    6. यदि आवश्यक हो, तो दहलीज से उत्पन्न छोटे अवशिष्ट को हटाने के लिए सतह पर एक फिल्टर लागू करें। ऐसा करने के लिए, वर्गीकृत सतह विंडो पर Voxels फ़िल्टर की संख्या का चयन करें, और केवल रुचि की वस्तुओं को रखने के लिए ऊपरी और निचले थ्रेसहोल्ड के साथ खेलें। एक बार सतह निर्माण समाप्त हो जाने के बाद, निर्माण मापदंडों को सहेजें, और अन्य छवियों को संसाधित करने के लिए उनका पुन: उपयोग करें।
  6. माइटोकॉन्ड्रिया के चारों ओर 3 डी दूरी मानचित्र की पीढ़ी
    1. माइटोकॉन्ड्रियल सतह के बाहर एक दूरी मानचित्र उत्पन्न करें जो पहले निम्नानुसार बनाया गया था। दृश्य ट्री बॉक्स में माइटोकॉन्ड्रिया सतह का चयन करें। इमेज प्रोसेसिंग > सरफेस फ़ंक्शन > डिस्टेंस ट्रांसफॉर्मेशन पर क्लिक करें। यह एक Matlab XTension को कॉल करेगा जो उपयोगकर्ता को यह चुनने के लिए कहता है कि मानचित्र की गणना ऑब्जेक्ट सतह के बाहर या अंदर की जानी चाहिए या नहीं।
    2. पीएलए स्पॉट और माइटोकॉन्ड्रिया की सतह के बीच की दूरी को मापने के लिए बाहरी सतह वस्तु का चयन करें। एक बार उत्पन्न होने के बाद, दूरी मानचित्र प्रदर्शन समायोजन पैनल में एक नए चैनल के रूप में दिखाई देता है। इस चैनल में, प्रत्येक पिक्सेल का मूल्य निकटतम माइटोकॉन्ड्रिया की दूरी के अनुरूप होता है।
  7. निकटतम माइटोकॉन्ड्रियन से वस्तुओं की दूरी का निष्कर्षण।
    1. प्रत्येक बिंदु से निकटतम माइटोकॉन्ड्रियन की दूरी को मापने के लिए और निकटतम लोगों की पहचान और कल्पना करने के लिए, दृश्य ट्री बॉक्स में पहले उत्पन्न स्थानों का चयन करें।
    2. आँकड़े और विस्तृत लॉग में, विशिष्ट मान चुनें (प्रत्येक स्थान के लिए एक माप प्राप्त करने के लिए). केंद्र तीव्रता Ch = X का चयन करें (दूरी मानचित्र चैनल की संख्या के अनुरूप X के साथ)। यह प्रत्येक स्पॉट सेंटर के मूल्य को मापेगा, जो दूरी के नक्शे में निकटतम माइटोकॉन्ड्रियन की दूरी से मेल खाता है।
    3. विंडो के निचले बाईं ओर फ़्लॉपी डिस्क आइकन पर क्लिक करके डेटा को .csv फ़ाइल के रूप में निर्यात करें।
    4. माइटोकॉन्ड्रिया से उनकी दूरी के आधार पर धब्बों की एक उप-आबादी निकालने के लिए, दृश्य पेड़ में धब्बे का चयन करें, और फ़िल्टर टैब पर क्लिक करें।
    5. इस विंडो में, सेंटर इंटेंसिटी सीएच = एक्स पर एक बार फिर से आधारित एक नया फ़िल्टर जोड़ें, और निचली सीमा को 0 μm और ऊपरी सीमा को 0.380 μm पर सेट करके माइटोकॉन्ड्रिया से 380 एनएम से कम धब्बे निकालें।
      नोट: 380 एनएम की सीमा का अनुमान पीएलए प्रतिक्रिया के आधार पर लगाया गया था, जिसमें प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी (30 एनएम) और पीएलए प्रवर्धन संकेतों (350 एनएम) के आधे अधिकतम (एफडब्ल्यूएचएम) पर पूर्ण चौड़ाई का आधा हिस्सा शामिल था।
    6. चयनित स्थानों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, और उदाहरण के लिए, उन्हें एक अलग रंग दें, नए स्पॉट में डुप्लिकेट चयन बटन दबाकर दोहराव चरण करें।

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Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने दो ईआर-लंगर वाले लिपिड ट्रांसफर प्रोटीन, ओआरपी 5 और ओआरपी 8 की बातचीत की साइटों का पता लगाया, और अन्य ऑर्गेनेल के संपर्क में ईआर झिल्ली उपडोमेन में उनकी घटना का आकलन किया, विशेष रूप से, माइटोकॉन्ड्रिया के साथ। इसके लिए, हेला कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को एक लाल माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर से दाग दिया गया था, और ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए हरे धब्बे प्राथमिक एंटीबॉडी एंटी-ओआरपी 5 और एंटी-ओआरपी 8 का उपयोग करके निर्धारण के बाद पाए गए थे, जिनकी विशिष्टता का परीक्षण पहले इम्यूनोफ्लोरेसेंस15 द्वारा किया गया था। कॉन्फोकल छवियों से पता चला है कि हेला कोशिकाओं में अंतर्जात ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए इंटरैक्शन जालीदार ईआर, कॉर्टिकल ईआर और ईआर उपडोमेन में माइटोकॉन्ड्रिया के निकट संपर्क में हुआ, जिसे आमतौर पर माइटोकॉन्ड्रिया से जुड़े ईआर झिल्ली (एमएएम) के रूप में जाना जाता है; चित्रा 2 ए)। एमएएम में होने वाले ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए इंटरैक्शन को निर्धारित करने के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया से प्रत्येक पीएलए स्पॉट की दूरी का मूल्यांकन 3 डी छवि विश्लेषण का उपयोग करके किया गया था। 380 एनएम की दूरी सीमा का उपयोग करते हुए, 3 डी इमेजिंग विश्लेषण से पता चला कि एमएएम (चित्रा 2 ए, बी) में लगभग 50% अंतर्जात ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए इंटरैक्शन का पता लगाया गया था। अन्य 50% इंटरैक्शन कॉर्टिकल और रेटिकुलर ईआर15 के बीच वितरित किए गए थे। पीएलए की विशिष्टता को सत्यापित करने के लिए, ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए प्रयोग ों को या तो ओआरपी 5-लक्ष्यीकरण और ओआरपी 8-लक्ष्यीकरण एसआईआरएनए (नकारात्मक नियंत्रण) के साथ इलाज की गई कोशिकाओं में या ओआरपी 5 और ओआरपी 8 (सकारात्मक नियंत्रण) को सह-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में किया गया था। ओआरपी 5 और ओआरपी 8 डाउनरेगुलेशन ने पीएलए संकेतों की कुल संख्या में भारी कमी को प्रेरित किया (एमएएम पर, जालीदार ईआर पर, और कॉर्टिकल ईआर में; चित्रा 2 ए, सी), जबकि उनके सह-ओवरएक्प्रेशन के परिणामस्वरूप पीएलए (चित्रा 2 ए, सी) में वृद्धि हुई, जो ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए की विशिष्टता की पुष्टि करता है। हालांकि, दिलचस्प बात यह है कि ओआरपी 5 और ओआरपी 8 को सह-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में एमएएम में होने वाले ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए इंटरैक्शन का प्रतिशत उन कोशिकाओं में देखे गए समान था जहां इन प्रोटीनों को अंतर्जात स्तरों (चित्रा 2 बी) पर व्यक्त किया गया था, जो एमएएम में एक जटिल के रूप में उनके अस्तित्व का समर्थन करते थे। माइटोकॉन्ड्रिया के निकट संपर्क में ईआर झिल्ली उपडोमेन में ओआरपी 5 और ओआरपी 8 की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, ओआरपी 5 या ओआरपी 8 और बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली प्रोटीन PTPIP51 के बीच अतिरिक्त मात्रात्मक पीएलए विश्लेषण किया गया, जो ओआरपी 5 और ओआरपी 813 का एक ज्ञात बाध्यकारी भागीदार है। ओआरपी 5-PTPIP51 और ओआरपी 8-PTPIP51 जोड़ों दोनों में पीएलए संकेतों का पता लगाया गया था, और उनकी औसत संख्या ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए जोड़े के समान थी, जो ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया एमसीएस (चित्रा 3) में ओआरपी 5 और ओआरपी 8 स्थानीयकरण की पुष्टि करती है।

अंत में, हमारी प्रयोगशाला के हाल के कार्यों में, क्रमशः पीएम या एलडी को चिह्नित करने के लिए PHPLCD-RFP या mcherry-PLN1 के साथ स्थानांतरित HeLa कोशिकाओं में एक समान दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम ईआर-पीएम संपर्कों पर ORP5-ORP8 PLA इंटरैक्शन की घटना का विश्लेषण करने और माइटोकॉन्ड्रिया, ईआर और LDs के बीच तीन-तरफा संपर्क स्थल की पहचान करने में सक्षम थे (चित्रा 4)15, 17.

Figure 1
चित्रा 1: माइटोकॉन्ड्रिया के करीब निकटता में पीएलए संकेतों की पहचान के लिए वर्कफ़्लो। सबसे पहले, कॉन्फोकल स्टैक को पीएलए फॉसी (स्पॉट) और माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क (सतहों) की पहचान करने के लिए विभाजित किया जाता है। फिर, 3 डी दूरी के नक्शे सतहों (माइटोकॉन्ड्रिया) के बाहर की ओर गणना की जाती है, जिससे निकटतम माइटोकॉन्ड्रियन से प्रत्येक स्थान की दूरी का माप होता है। अंत में, पीएलए स्पॉट को पहचान प्रणाली की सटीकता के आधार पर स्थापित 380 एनएम की निकटता सीमा के आधार पर दो आबादी (लाल और हरे) में वर्गीकृत किया जाता है। इस आंकड़े को मोंटेइरो-कार्डोसो एट अल.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया संपर्कों पर अंतर्जात स्तरों पर व्यक्त ओआरपी 5-ओआरपी 8 कॉम्प्लेक्स की प्रतिनिधि छवियां। (ए) ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए कॉन्फोकल श्रृंखला और संबंधित 3 डी पुनर्गठन। स्केल बार: 10 μm और 2 μm (विस्तारित छवियां)। (बी) माइटोकॉन्ड्रिया के निकट संपर्क में ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए फॉसी का परिमाणीकरण। एंडो, एन = 33 कोशिकाएं, और ओवरएक्सपी ओआरपी 5 + ओआरपी 8, एन = 27 कोशिकाएं। डेटा को एसईएम (माध्य की मानक त्रुटि) ± रूप में प्रस्तुत किया जाता है। इस छवि को मोंटेइरो-कार्डोसो एट अल.15 से संशोधित किया गया है। (ग) कुल ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए फॉसी का परिमाणीकरण। एंडो, एन = 38 कोशिकाएं, एसआईओआरपी 5 + एसआईओआरपी 8, एन = 38 कोशिकाएं, और ओवरएक्सपी ओआरपी 5 + ओआरपी 8, एन = 35 कोशिकाएं। डेटा को एसईएम (माध्य की मानक त्रुटि) ± रूप में प्रस्तुत किया जाता है। इस छवि को मोंटेइरो-कार्डोसो एट अल.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन PTPIP51 के साथ ओआरपी 5 या ओआरपी 8 के बीच पीएलए संकेतों की प्रतिनिधि छवियां (ए) कॉन्फोकल श्रृंखला का उपयोग 3 डी पुनर्गठन और दूरी मानचित्र उत्पन्न करने के लिए किया गया था ताकि यह पुष्टि की जा सके कि ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया करीबी संपर्कों में ओआरपीआर 5 या ओआरपी 8 पीएलए इंटरैक्शन PTPIP51 साथ होते हैं। स्केल बार: 10 μm और 2 μm (विस्तारित छवियां)। (बी) नियंत्रण में इम्यूनोफ्लोरेसेंस कॉन्फोकल छवियों (एकल फोकल प्लेन) और सीआरएनए लक्ष्यीकरण PTPIP51 के साथ इलाज किए गए हेला कोशिकाओं PTPIP51। स्केल बार: 10 μm और 2 μm (विस्तारित छवियां)। (ग) ओआरपी 5-PTPIP51 और ओआरपी 8-PTPIP51 पीएलए कॉन्फोकल छवियां नियंत्रण में हैं और हेला कोशिकाओं को सीआरएनए लक्ष्यीकरण PTPIP51 के साथ इलाज किया गया है। स्केल बार: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ईआर-पीएम और ईआर-माइटोकॉन्ड्रिया-एलडी संपर्कों पर ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए कॉम्प्लेक्स को स्थानीयकृत करने के लिए उपयोग किए जाने वाले 3 डी पुनर्निर्माण के उदाहरण। (ए) ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए के साथ एक हेला सेल का कॉन्फोकल छवि और संबंधित 3 डी पुनर्गठन, जिसे हरे धब्बों द्वारा दर्शाया गया है, पीएम को पीएचपीएलसीडी-आरएफपी के साथ चिह्नित किया गया है, जिसे लाल सेल द्वारा दर्शाया गया है, और माइटोकॉन्ड्रिया को माइटोकॉन्ड्रिया के साथ चिह्नित किया गया है, जिसे नीली सतहों द्वारा दर्शाया गया है। बाएं और केंद्र छवियां: पूरे हेला सेल का प्रतिनिधित्व। दाईं छवि: सेल के अंदर एक ज़ूम किए गए क्षेत्र का प्रतिनिधित्व। (बी) ओआरपी 5-ओआरपी 8 पीएलए के साथ हेला सेल के ज़ूम-इन क्षेत्र का कॉन्फोकल छवि और संबंधित 3 डी पुनर्गठन, हरे धब्बे द्वारा दर्शाया गया, एमचेरी-पीएलएन 1 के साथ चिह्नित एलडी, लाल सतहों द्वारा दर्शाया गया, और मिटो-बीएफपी, नीली सतहों द्वारा दर्शाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल को एमसीएस में अंतर-ऑर्गेनेल प्रोटीन पीएलए इंटरैक्शन की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, विशेष रूप से एमईआरसीएस में। प्रोटोकॉल की नवीनता यह है कि यह पीएलए को कई ऑर्गेनेल, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और 3 डी छवि विश्लेषण के लेबलिंग के साथ जोड़ती है ताकि एक ही झिल्ली में रहने वाले दो प्रोटीनों के बीच पीएलए इंटरैक्शन को स्थानीयकृत और परिमाणित किया जा सके, इस मामले में ईआर झिल्ली के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया (एमएएम) की झिल्ली के साथ निकटता में या एमएएम और एलडी के साथ एक साथ। इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रोटीन को मान्य करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया जा सकता है जो संभावित रूप से विशिष्ट एमईआरसीएस पर स्थानीयकृत होता है, लेकिन अन्य एमसीएस पर भी।

2006 में इसके विकास के बाद से, ईआर और माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के बीच पीएलए का व्यापक रूप से एमईआरसीएस 7,9,10,11 की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया है। हालांकि, कोशिकाओं में एमईआरसीएस बहुतायत के संकेतक के रूप में पीएलए के उपयोग को उच्च-रिज़ॉल्यूशन दृष्टिकोण द्वारा सावधानीपूर्वक सत्यापित करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, एसएएम 50 का पृथक्करण, एक माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन जो एमईआरसीएस की प्रचुरता को प्रभावित नहीं करता है (जैसा कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा परिमाणित किया गया है)15, ईआर प्रोटीन ओआरपी 8 और माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन टीओएम 20 के बीच पीएलए इंटरैक्शन को भी नहीं बदलता है, लेकिन यह ओआरपी 8 और माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन मेटैक्सिन 2 के बीच पीएलए इंटरैक्शन को उनके अभिव्यक्ति स्तर 15 को कम किए बिना कम करता है।. ये परिणाम दर्शाते हैं कि पीएलए इंटरैक्शन परख में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन की जोड़ी के लिए विशिष्ट हो सकता है और एमईआरसीएस की प्रचुरता का आकलन करने के लिए एकमात्र पैरामीटर के रूप में उपयोग नहीं किया जा सकता है।

बहरहाल, पीएलए सीटू अंतर्जात प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए एक सिद्ध संवेदनशील दृष्टिकोण है। स्प्लिट-जीएफपी और फ्रेट, या उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग दृष्टिकोण सहित अन्य फ्लोरोसेंट जांच-आधारित पहचान विधियों के विपरीत, पीएलए को टैग किए गए प्रोटीन के ओवरएक्प्रेशन की आवश्यकता नहीं होती है, अंतर्निहित प्रयोगात्मक कलाकृतियों से बचना, जैसे कि लक्षित ऑर्गेनेल15 के भौतिक गुणों का परिवर्तन। पीएलए द्वारा प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने से अन्य इम्यूनोडिटेक्शन विधियों के संबंध में भी लाभ मिलता है, जैसे कि पश्चिमी धब्बा के साथ सह-इम्यूनोप्रेसिट्रेशन। जबकि पीएलए एकल-कोशिका स्तर पर एकल प्रतिदीप्ति धब्बे की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देता है, सह-इम्यूनोप्रेसिपेशन के लिए उच्च मात्रा में जैविक सामग्री की आवश्यकता होती है और केवल हेटरोजेनस कोशिकाओं के पूल से निकाले गए प्रोटीन की सापेक्ष मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देता है, जिसके लिए एक उपयुक्त लोडिंगनियंत्रण प्राप्त करना मुश्किल है। सह-इम्यूनोप्रेसिपेशन पर ऑर्गेनेल स्टेनिंग और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त पीएलए के उपयोग का अतिरिक्त लाभ यह है कि पहला दृष्टिकोण उपकोशिकीय स्तर पर प्रोटीन इंटरैक्शन के स्थानीयकरण की अनुमति देता है।

दूसरी ओर, इस प्रोटोकॉल की प्रमुख कमियां लगभग 40 एनएम की पीएलए डिटेक्शन रेंज से जुड़ी हैं, जो एमईआरसीएस से बड़ी है, और लगभग 250 एनएम की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त अधिकतम रिज़ॉल्यूशन के साथ, जिससे संपर्क साइटों को स्पष्ट रूप से पहचानना मुश्किल हो जाता है। हालांकि, यहां, पीएलए प्रतिक्रिया के आकार के आधार पर माइटोकॉन्ड्रिया सतहों से जुड़े पीएलए स्पॉट का अनुमान लगाने के लिए 380 एनएम की एक सीमा का उपयोग किया गया था, जिसमें प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी (30 एनएम) और पीएलए प्रवर्धन संकेतों (350 एनएम) के एफडब्ल्यूएचएम का आधा हिस्सा शामिल था। पीएलए की एक और सीमा इस तथ्य से संबंधित है कि इसका उपयोग केवल निश्चित नमूनों में किया जा सकता है, और एक अलग, विशिष्ट और मात्रात्मक पीएलए सिग्नल के अधिग्रहण के लिए एंटीबॉडी की उपलब्धता की आवश्यकता होती है जो प्रोटीन ऑफ इंटरेस्ट15 के लिए अत्यधिक विशिष्ट हैं। इसके अतिरिक्त, दूरी अनुमान के लिए 3 डी इमेजिंग विश्लेषण के लिए विशिष्ट सॉफ़्टवेयर की आवश्यकता होती है जो सभी प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकती है।

विशेष रूप से, ऊपर उल्लिखित कुछ नुकसानों को हाल ही में उपलब्ध प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी को उच्च रिज़ॉल्यूशन स्तर पर इमेजिंग तकनीकों द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जैसे कि एयरस्कैन या संरचित इल्यूमिनेटेड माइक्रोस्कोपी (सिम)17, और सीआरआईएसपीआर-कैस 9 तकनीक18 का उपयोग करके अंतर्जात प्रोटीन को स्थिर रूप से टैग करके रुचि के प्रोटीन के लिए अच्छे प्राथमिक एंटीबॉडी की कमी को दूर किया जा सकता है।. अंत में, एंटीबॉडी और पीएलए संकेतों की गुणवत्ता और विशिष्टता को निम्नलिखित नियंत्रणों का उपयोग करके सत्यापित किया जा सकता है: 1) नियंत्रण कोशिकाओं में इम्यूनोफ्लोरेसेंस और वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी का परीक्षण करना और उन कोशिकाओं में जिनमें रुचि का प्रोटीन समाप्त या अतिरंजित हो गया है; 2) उन कोशिकाओं में पीएलए का प्रदर्शन करना जिनमें रुचि के एक या दोनों प्रोटीन समाप्त हो गए हैं; 3) कोशिकाओं में पीएलए का प्रदर्शन करना रुचि के प्रोटीन को सह-अतिरंजित करता है; 4) रुचि के प्रोटीन के लिए दोनों एंटीबॉडी को छोड़ते हुए पीएलए का प्रदर्शन करना; 5) रुचि के प्रोटीन के लिए दो एंटीबॉडी में से केवल एक का उपयोग करके पीएलए का प्रदर्शन करना; 6) पीएलए को उसी आईजीजी के साथ इनक्यूबेशन के साथ प्रदर्शन करना जिस प्रजाति से प्राथमिक एंटीबॉडी उत्पन्न हुए थे। उनकी विशिष्टता का आकलन करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी का परीक्षण नियंत्रण कोशिकाओं में इम्यूनोफ्लोरेसेंस और वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा किया गया था और उन कोशिकाओं में जिनका इलाज ओआरपी 5 15, ओआरपी 815, या PTPIP51 (चित्रा 3 बी और गुयार्ड एट अल .17) को लक्षित करने वाले सीआरएनए के साथ किया गया था। इसके अलावा, एंटीबॉडी डिटेक्शन सिग्नल और ईजीएफपी सिग्नल15 के बीच पियरसन के गुणांक का मूल्यांकन करके ईजीएफपी-टैग किए गए ओआरपी 5 या ओआरपी 8 को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में एंटी-ओआरपी 5 और एंटी-ओआरपी 8 विशिष्टता का आकलन किया गया है। एंटी-ओआरपी 515, एंटी-ओआरपी 815, और एंटी-PTPIP51 (चित्रा 1 और चित्रा 3 सी) एंटीबॉडी की विशिष्टताओं का उन कोशिकाओं में विश्लेषण किया गया था जिनमें ये प्रोटीन समाप्त हो गए थे, जिससे पीएलए संकेतों में कमी आई थी। ध्यान दें, एंटीबॉडी एकाग्रता जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के लिए उपयुक्त है, आमतौर पर पीएलए के लिए भी उपयुक्त है; हालांकि, उपयोग किए गए एंटीबॉडी के आधार पर, पीएलए धुंधला पन में सुधार के लिए ब्लॉकिंग समाधान और / या एंटीबॉडी सांद्रता में कुछ समायोजन किए जा सकते हैं। ब्लॉकिंग समाधान को समायोजित करने के बाद ओआरपी 5-ओआरपी 8 और ओआरपी 8-PTPIP51 पीएलए धुंधला होने में सुधार किया गया था। उच्च गुणवत्ता वाले माइटोकॉन्ड्रियल और पीएलए धुंधला प्राप्त करने के लिए, कम पृष्ठभूमि संकेतों के साथ उच्च गुणवत्ता वाले कॉन्फोकल चित्र प्राप्त करना आवश्यक है, जो 3 डी मॉड्यूलेशन की सुविधा के लिए महत्वपूर्ण हैं। उदाहरण के लिए, उच्च पृष्ठभूमि प्रभाव सीमा समायोजन के साथ कॉन्फोकल छवियां और, परिणामस्वरूप, माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क या पीएलए के 3 डी मॉड्यूलेशन की सटीकता को प्रभावित करती हैं।

अंत में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल विशिष्ट एमईआरसीएस उप-डोमेन (एमसीएस में लगे एक ही झिल्ली के भीतर सीआईएस में स्थानीयकृत प्रोटीन के बीच या मिश्रित झिल्ली के भीतर ट्रांस में स्थानीयकृत प्रोटीन के बीच बातचीत) पर पीएलए प्रोटीन इंटरैक्शन के स्थानीयकरण और परिमाणीकरण को सक्षम बनाता है। यद्यपि यहां वर्णित प्रक्रियाएं एमईआरसीएस में प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए अन्य पद्धतियों की तुलना में तकनीकी रूप से सरल और अपेक्षाकृत तेज हैं, प्राप्त डेटा अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल रुचि के प्रोटीन के लिए उपलब्ध एंटीबॉडी के रूप में और ऑर्गेनेल को दागने के लिए उपलब्ध मार्करों के रूप में बहुमुखी है। इसलिए, इसे प्रोटीन के जोड़े और कई ऑर्गेनेल और एमसीएस की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एएनआर ज्यून चेर्चेउर (ANR0015TD), एटीआईपी-एवेनिर प्रोग्राम, फोंडेशन पोर ला रेचरचे मेडिकल (एन °206548), और फोंडेशन वैंकर अल्जाइमर (ईओटीपी: 669122 एलएस 212527), आई'एजेंस नेशनल डे ला रेचरचे (एएनआर -11-ईक्यूपीएक्स -0029 / ANR-11-IDEX-0003-02/ Saclay Plant Sciences)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) Gibco 14190-094
Ammonium chloride (NH4Cl) VWR 21236.291
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7906
Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 Agar Scientific L46R13-15
CMXRos red MitoTracker Invitrogen M7512 red mitochondrial marker
Confocal inverted microscope SP8-X Leica DMI 6000
Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates Merck CLS3526
Duolink In Situ Detection Reagents Green  Sigma DUO92002
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI  Sigma DUO82040
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS  Sigma DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma DUO92014
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence  Sigma DUO82049
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement  Gibco 51985026 serum free medium
Imaris software v 9.3 Bitplane N/A cell imaging software
Incubator UINCU-line IL10 VWR 390-0384
Microscope slide StarFrost (3“ x 1“)  Knittel Glass
mouse anti-ORP8  Santa Cruz 134409
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148
rabbit anti-ORP5  Sigma HAP038712
Saponin Sigma 84510
Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free Invitrogen 10977-035

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References

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