Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering og kvantifisering av endogene intraorganelle proteininteraksjoner på ER-mitokondrier kontaktsteder ved nærhetsligeringsanalyser

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/64750
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2
1Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Saclay, 2Inserm U1280, 3Imagerie-Gif, Light Microscopy Facility, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Saclay

Summary

Behovet for nye tilnærminger for å studere membrankontaktsteder (MCS) har vokst på grunn av økende interesse for å studere disse cellulære strukturer og deres komponenter. Her presenterer vi en protokoll som integrerer tidligere tilgjengelige mikroskopiteknologier for å identifisere og kvantifisere intraorganelle og interorganelle proteinkomplekser som ligger på MCS.

Abstract

Membrankontaktsteder (MCS) er områder med nær membrannærhet som tillater og regulerer den dynamiske utvekslingen av forskjellige biomolekyler (dvs. kalsium og lipider) mellom de sidestilte organellene uten å involvere membranfusjon. MCS er avgjørende for cellulær homeostase, og deres funksjoner sikres av de bosatte komponentene, som ofte eksisterer som multimere proteinkomplekser. MCS involverer ofte endoplasmatisk retikulum (ER), et viktig sted for lipidsyntese og cellulær kalsiumlagring, og er spesielt viktige for organeller, som mitokondriene, som er utelukket fra de klassiske vesikulære transportveiene. I de siste årene har MCS mellom ER og mitokondrier blitt grundig studert, da deres funksjoner sterkt påvirker cellulær metabolisme / bioenergetikk. Flere proteiner har begynt å bli identifisert på disse kontaktstedene, inkludert membranbånd, kalsiumkanaler og lipidoverføringsproteiner, og øker dermed behovet for nye metoder og tekniske tilnærminger for å studere disse MCS-komponentene. Her beskriver vi en protokoll bestående av kombinerte tekniske tilnærminger, som inkluderer nærhetsligeringsanalyse (PLA), mitokondrierfarging og 3D-bildesegmentering, som gjør det mulig å oppdage proteiner som er fysisk nær (>40 nm) til hverandre og som ligger på samme membran ved ER-mitokondrier MCS. For eksempel brukte vi to ER-forankrede lipidoverføringsproteiner, ORP5 og ORP8, som tidligere har vist seg å interagere og lokalisere ved ER-mitokondrier og ER-plasmamembran MCS. Ved å knytte ORP5-ORP8 PLA til cellebildebehandlingsprogramvareanalyse, var det mulig å estimere avstanden til ORP5-ORP8-komplekset fra mitokondrieoverflaten og bestemme at ca. 50% av ORP5-ORP8 PLA-interaksjonen skjer ved ER-underdomener i nærheten av mitokondrier.

Introduction

Interorganell kommunikasjon er en definerende egenskap for eukaryote celler. En måte organeller kommuniserer på er ved å danne membrankontaktsteder (MCS), som er nære membranopposisjoner mellom to organeller som opprettholdes av strukturelle og funksjonelle proteiner, som tetere, lipidoverføringsproteiner og kalsiumkanaler1. MCS kan etableres mellom lignende eller forskjellige organeller, og de formidler utvekslingen av cellulære komponenter, noe som er viktig for å opprettholde cellulær homeostase. Hittil har flere MCSer blitt identifisert, inkludert endoplasmatisk retikulum (ER)-mitokondrier, ER-plasmamembran (PM) og ER-lipiddråpe (LD) kontakter1. Blant dem er de som dannes mellom ER og mitokondriene (MERCS) blant de mest studerte, da de er involvert i reguleringen av flere cellulære funksjoner, inkludert lipid- og kalsiumhomeostase2. Siden mitokondrier i stor grad er utelukket fra de klassiske vesikulære transportveiene, er de avhengige av MERCS og deres molekylære bestanddeler for å importere viktige lipider eller lipidforløpere fra ER. Den ikke-vesikulære transporten av disse lipidene over MERCS sikrer opprettholdelse av riktig mitokondriell lipidsammensetning, samt deres funksjonelle og strukturelle integritet3.

Gitt den avgjørende involveringen av MCSer i forskjellige cellulære funksjoner, har interessen for å gi en dypere forståelse av deres molekylære komponenter økt kraftig de siste årene. Flere typer bildebaserte tilnærminger har blitt brukt for å fremme kunnskapen om MCS. Blant dem har fluorescenssondebasert nærhetsligeringsanalyse (PLA) blitt mye brukt som en indikator på overflod av MCSer ved å oppdage interorganelle protein-protein-protein-interaksjoner (i et deteksjonsområde på 40 nm) ved endogene nivåer4. For eksempel har MERCS blitt visualisert og kvantifisert ved å bruke PLA mellom flere mitokondrier-ER-proteinpar, inkludert VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 og PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Selv om denne teknologien har blitt brukt til å oppdage og kvantifisere interorganelle protein-protein-interaksjoner som er tilstede ved MCS 5,7,9,10,11, kombinerte de fleste studiene ikke PLA med organellfarging. Følgelig er det ikke utviklet en kvantitativ metode som gjør det mulig å måle nærheten mellom PLA-interaksjoner og tilhørende organeller ennå. Således, så langt, når det gjelder ER-proteiner, har deres interaksjon i membranunderdomener i kontakt med andre organeller ikke blitt skilt fra deres interaksjon i det vidt distribuerte ER-nettverket.

Her beskriver vi en protokoll for å oppdage PLA-interaksjoner mellom proteiner som ligger i membranen til samme organelle og for å analysere deres nærhet til membranen til partnerorganellen ved MCS. Denne protokollen ble utviklet basert på to premisser: 1) tidligere studier som viser at ER-lipidoverføringsproteinene ORP5 og ORP8 under overekspresjonsbetingelser samlokaliserer og interagerer ved ER-mitokondrier og ER-PM MCSer 12,13,14,15 og at ORP5 lokaliseres ved ER-LD-kontakter 16,17; 2) eksisterende teknologier, inkludert PLA, konfokalmikroskopi, organellmerking og 3D-bildeanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mitokondriell farging og nærhetsligeringsanalyse (PLA)

  1. Plate 0,5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa-celler, vedlikeholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin og 1% ikke-essensielle aminosyrer ved 37 ° C med 5% CO2, i 13 mm glassdeksler i1,5 i 24-brønnsplater ved en fortynning som tillater 75% -90% cellekonfluens på prosedyredagen.
    MERK: Merk: HeLa-celler kan sendes til ytterligere behandlinger, for eksempel siRNA-behandling og / eller DNA-plasmidtransfeksjon, før mitokondriell farging og PLA.
  2. Mitokondriell farging
    1. Vask cellene én gang i serumfritt medium forvarmet ved 37 °C. Inkuber cellene med forvarmet serumfritt medium i 10 minutter ved 37 °C med 5% CO2.
    2. Forbered 1 μM rød mitokondriemarkør i forvarmet serumfritt medium.
    3. Inkuber cellene med 500 μL mitokondriemarkørløsning i 30 minutter ved 37 °C med 5% CO2. Under mitokondriemarkørbehandlingen og de følgende trinnene i protokollen, hold cellene på dekselene beskyttet mot lys så mye som mulig.
    4. Etter inkubasjonen, vask cellene 1x i forvarmet serumfritt medium og 2x i 1x fosfatbufret saltvann (PBS). Utfør dette trinnet så raskt som mulig, siden lange vasketrinn før fiksering kan påvirke mitokondriell morfologi.
    5. Fjern 1x PBS fra dekslene, og fest cellene ved å inkubere dem i nylaget 4% PFA (i 1x PBS) i 30 minutter ved romtemperatur (i mørket) under den kjemiske hetten. Vask 3x i 2 minutter i 500 mikrol 1x PBS (ved bruk av engangspipetter eller et vakuumsystem koblet til en pumpe).
    6. Fjern 1x PBS, og inkuber dekslene med 500 μL 50mM NH4Cl i 15 minutter ved romtemperatur (i mørket). Vask 1x i 2 min i 500 μL av 1x PSB ved hjelp av et vakuumsystem.
    7. Vask 3x i 2 min i 500 μL blokkeringsbuffer 1 (BB1, 1% BSA, 0,1% saponin i 1x PBS) for ORP5-ORP8 PLA eller blokkeringsbuffer 2 (BB2, 2% BSA, 0,1% normalt geiteserum, 0,1 saponin i 1x PBS) for ORP8-PTPIP51 PLA.
    8. Overfør dekslene fra 24-brønnsplaten til et fuktighetskammer. Etter overføring av dekslene inn i kammeret, tilsett 100 μL BB (BB1 eller BB2, i henhold til antistoffparene som brukes) for å unngå tørrhet.
      MERK: Et fuktighetskammer beskyttet mot lys kan enkelt og raskt oppnås ved å pakke inn en petriskål (plast eller glass) i aluminiumsfolie og legge til noen biter vått papirhåndkle i periferien av petriskålen.
  3. Nærhetsligeringsanalyse (PLA)
    MERK: PLA-protokollen følger produsentens instruksjoner med små modifikasjoner.
    1. Primær antistoffinkubasjon
      1. Forbered den primære antistoffarbeidsløsningen. Fortynnet kanin anti-ORP5 (01:150) pluss mus anti-ORP8 (01:200) i BB1, mus anti-ORP8 (01:200) pluss kanin anti-PTPIP51 (1:200) i BB2, og kanin anti-ORP5 (1:150) pluss mus anti-PTPIP51 (01:200) i BB1. Klargjør (minst) 40 mikrol primære antistoffer oppløsning per dekkslipp (f.eks. 0,27 mikrol kaninanti-ORP5, 0,2 mikrol mus anti-ORP8, 39,53 mikrol BB1).
      2. Fjern BB fra forrige vask (trinn 1.2.8) ved hjelp av et vakuumsystem, og tilsett 40 μL primær antistoffoppløsning til dekslene. Inkuber i 1 time ved romtemperatur i et fuktighetskammer beskyttet mot lys.
    2. Vask deksler 3x i 5 min med 100 μL av tilsvarende BB ved hjelp av vakuumsystemet.
    3. PLA-sonde inkubasjon
      1. Forbered PLA-sondernes arbeidsløsning. Fortynn kanin PLUS (1:5) og mus MINUS (1:5) PLA-sonder i BB, og bland. For hver dekkslipp, klargjør (minst) 40 μL PLA-sondeoppløsning (f.eks. 8 μL kanin PLUS PLA-sonde, 8 μL mus MINUS PLA-sonde, 24 μL BB). La PLA-sondeoppløsningen stå i 20 minutter ved romtemperatur før bruk.
      2. Fjern BB fra dekslene (fra trinn 1.3.2) ved hjelp av et vakuumsystem, og tilsett 40 μL PLA-sondeoppløsning til dekslene. Inkuber i 1 time ved 37 °C i et fuktighetskammer beskyttet mot lys.
    4. Vask dekslene 2x i 5 min i 100 μL med 1x vaskebuffer A ved romtemperatur.
    5. Ligation
      1. Fortynn 5x ligeringsbuffer til 1:5 i ultrarent vann og bland. For hver dekkslipp, lag (minst) 40 μL ligeringsløsning (8 μL 5x ligeringsbuffer, 31 μL ultrarent vann).
      2. Tilsett ligasen (1 U / μL, levert i PLA-settet) til 1x ligeringsbuffer fremstilt i forrige trinn ved en fortynning på 1:40, og bland.
      3. Fjern 1x vaskebuffer A fra dekslene (fra trinn 1.3.4) ved hjelp av et vakuumsystem, tilsett 40 μL ligaseoppløsning til dekslene og inkuber i 30 minutter ved 37 °C i et fuktighetskammer beskyttet mot lyset.
    6. Vask dekslene 2x i 2 min i 100 μL med 1x vaskebuffer A ved romtemperatur ved bruk av vakuumsystemet.
    7. polymerisering
      1. Fortynn 5x amplifikasjonsbuffer 1:5 i ultrarent vann, og bland. For hver dekkslipp, klargjør (minst) 40 μL amplifikasjonsløsning (8 μL 5x amplifikasjonsbuffer, 31,5 μL ultrarent vann).
      2. Tilsett polymerasen (10 E / μL, levert i PLA-settet) til 1x polymerisasjonsbufferen fremstilt i forrige trinn ved en fortynning på 1:80, og bland.
      3. Fjern 1x vaskebuffer A fra dekslene (fra trinn 1.3.6) ved hjelp av et vakuumsystem, tilsett 40 μL polymeraseoppløsning til dekslene og inkuber i 1 time 40 min ved 37 °C i et fuktighetskammer beskyttet mot lyset.
    8. Fjern polymeraseoppløsning fra deksel, og vask 2x i 10 minutter i 100 μL 1x vaskebuffer B ved romtemperatur i et fuktighetskammer beskyttet mot lyset.
    9. Vask dekslene 1x i 1 min i 100 μL med 0,001x vaskebuffer B ved romtemperatur i et fuktighetskammer beskyttet mot lyset.
    10. Monter dekslene på glassglass for mikroskopi ved bruk av monteringsmedium med DAPI (konsentrasjon mellom 1,6-0,4 μg/ml). Forsegling med neglelakk.

2. Oppkjøp av bilder

  1. Observer PLA-resultatene, og ta bilder ved hjelp av fluorescens konfokalmikroskopi med et 63x oljenedsenkingsmål ved hjelp av den medfølgende programvaren.
  2. Still fluorescenseksitasjonen ved hjelp av en 405 nm laserdiode eller en hvit lyslaser, og samle spektralvinduene med GaAsP PMT eller hybriddetektorer. Ved hvert fokalplan (som spenner over 300 nm) får du fluorescenssignalene for PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) og mitokondrier (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm).

3. Bildebehandling og vurdering av PLA-flekker assosiert med mitokondrier

  1. Behandle konfokalbildene ved hjelp av en programvare for bildeanalyse som genererer avstandskart mellom de cellulære komponentene. Følg trinnene nedenfor for å generere 3D-rekonstitueringer av PLA-flekker og mitokondrienettverket og for å få tilgang til avstanden mellom dem ved hjelp av cellebildeprogramvare (figur 1).
  2. Installasjon av utvidelsen for 3D-avstandskart
    1. Installer både celleanalyseprogramvarepakken med XT-alternativet og MATLAB-programvaren eller bare en MATLAB-kompilatorkjøretid (MRC), som fritt kan lastes ned fra nettstedet.
    2. Konfigurer celleanalyseprogrammet til å starte MATLAB når en XTension startes, på følgende måte: Fra menyen Imaris (Mac OS X) eller Rediger (Windows) velger du Innstillinger, bytter til Egendefinerte verktøy-panelet og angir deretter banen:
      C:\Programfiler\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe for Windows eller/Programmer/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab for Mac OS X.
  3. Importer bildene til programvaren
    1. Konverter de konfokale stakkbildene til en . IMS-fil, enten direkte gjennom Arena-delen eller ved hjelp av den frittstående filkonvertereren som tillater batchkonvertering.
    2. Etter importen må du kontrollere at bildene forblir riktig kalibrert. Klikk på Rediger > bildeegenskaper > bildegeometri, og kontroller at voksestørrelsen i X og Y tilsvarer pikselstørrelsen som forventes for det faktiske bildet (se bildekalibrering i oppkjøpsprogramvaren) og at voxelstørrelsen i Z tilsvarer trinnet som brukes av mikroskopet for å generere Z-stakken. Hvis verdiene ikke er riktige, endrer du dem for å sikre en korrekt estimering av avstandene i de følgende trinnene.
    3. Juster kontrasten til de forskjellige kanalene i menyen Skjermjustering ved å klikke på Rediger > Vis skjermjustering. Juster hver kanal uavhengig av hverandre for å optimalisere visningen av hver farge. Dette trinnet påvirker ikke bildeverdiene direkte, men er avgjørende for å angi nøyaktige terskler eller oppdage svake objekter.
    4. Begrens analysen til én enkelt celle ved å beskjære bildet ved hjelp av alternativene Rediger > Beskjær 3D. Hvis du vil analysere en annen celle i samme synsfelt, åpner du det samme bildet på nytt og beskjærer det på en annen måte.
  4. ORP5-ORP8 punktdeteksjon
    1. Oppdag PLA-signalene som genereres på stedet for ORP5- og ORP8-interaksjon ved å klikke på alternativet Legg til nye flekker , som oppretter et nytt sett med objekter og åpner veiviseren for flekkdeteksjon.
    2. Velg kanalen som punktregistreringen skal utføres på.
    3. Juster den estimerte XY-diameteren (området må tilpasses hvis objektstørrelsen er forskjellig) for å hjelpe spotdeteksjonsalgoritmen med å finne objektene av interesse. Legg merke til at hvis den valgte verdien er for høy, vil gjenstandene i nærheten smelte sammen. Hvis verdien er for liten, kan ett signal betraktes som flere objekter, eller avvikende signaler kan oppdages.
    4. Klikk på Bakgrunnssubtraksjon for å fjerne bildebakgrunnen før punktdeteksjon for å forbedre den lokale kontrasten rundt objektene av interesse.
    5. Juster punktdeteksjonsterskelen ved å beholde kvaliteten (intensiteten i objektsenteret) som terskelparameter og programvarens autoterskel, eller endre denne verdien litt for å oppdage alle objektene. Når punktregistreringen er ferdig, lagrer du deteksjonsparametrene og bruker dem på nytt til å behandle andre bilder.
  5. Mitokondriell nettverksdeteksjon
    1. Oppdag mitokondrienettverket for å generere en overflategjengivelse ved å klikke på Legg til nye overflater for å opprette et nytt objekt, og åpne veiviseren for overflatedeteksjon.
    2. Velg kanalen som overflateopprettelsen skal utføres på.
    3. Bruk et Gauss-filter for å få en jevnere overflate ved å klikke på avmerkingsboksen Glatt ut og ved å angi en terskel som angir de minste detaljene som kan observeres på overflaten.
    4. Utfør en bakgrunnssubtraksjon for å forbedre de lokale kontrastene og for å hjelpe med terskeltrinnet.
    5. Juster terskelen for å oppdage mitokondrienettverket basert på signalets intensitet. Hvis det er vanskelig å sette terskelen riktig, anbefales det å gå tilbake til forrige trinn for å justere graden av glatthet og bakgrunnsubtraksjon.
    6. Påfør om nødvendig et filter på overflaten for å fjerne små rester som følge av terskelen. For å gjøre dette, velg filteret Antall Voxels i klassifiser overflatevinduet, og spill med øvre og nedre terskel for å beholde bare objektene av interesse. Når overflateopprettingen er over, lagrer du opprettelsesparametrene og bruker dem på nytt til å behandle andre bilder.
  6. Generering av 3D-avstandskartet rundt mitokondriene
    1. Generer et avstandskart utenfor mitokondrieoverflaten som tidligere ble opprettet som følger. Velg mitokondrieoverflaten i scenetreboksen. Klikk på bildebehandling > overflater funksjon > avstandstransformasjon. Dette vil kalle en Matlab XTension som ber brukeren velge om kartet skal beregnes utenfor eller inne i objektoverflaten.
    2. Velg Utvendig overflateobjekt for å måle avstanden mellom PLA-punktene og overflaten av mitokondriene. Når avstandskartet er generert, vises det som en ny kanal i skjermjusteringspanelet. I denne kanalen har hver piksel en verdi som tilsvarer avstanden til nærmeste mitokondrier.
  7. Ekstraksjon av objektenes avstand fra nærmeste mitokondrie
    1. Hvis du vil måle avstanden fra hvert punkt til nærmeste mitokondrie og identifisere og visualisere de nærmeste, velger du flekkene som tidligere ble generert i scenetreboksen.
    2. I statistikken og den detaljerte loggen velger du Spesifikke verdier (for å få én måling for hvert punkt). Velg Senterintensitet Ch=X (der X tilsvarer nummeret på avstandskartkanalen). Dette vil måle verdien av hvert spotsenter, som tilsvarer avstanden til nærmeste mitokondrion, i avstandskartet.
    3. Eksporter dataene som en .csv-fil ved å klikke på diskettikonet nederst til venstre i vinduet.
    4. For å trekke ut en underpopulasjon av flekker basert på deres avstander til mitokondrier, velg flekkene i scenetreet og klikk på Filtre-fanen .
    5. I dette vinduet legger du til et nytt filter basert igjen på Center Intensity Ch=X, og trekker ut flekkene mindre enn 380 nm unna mitokondrier ved å sette den nedre terskelen til 0 μm og den øvre terskelen til 0,380 μm.
      MERK: Terskelen på 380 nm ble estimert basert på en PLA-reaksjon inkludert sammenhengen mellom primære og sekundære antistoffer (30 nm) pluss halvparten av full bredde ved halv maksimum (FWHM) av PLA-amplifikasjonssignalene (350 nm).
    6. Hvis du vil fokusere på de merkede flekkene og for eksempel gi dem en distinkt farge, utfører du et dupliseringstrinn ved å trykke på knappen Dupliser merking til nye flekker .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor oppdaget vi interaksjonsstedene til to ER-forankrede lipidoverføringsproteiner, ORP5 og ORP8, og vurderte deres forekomst ved ER-membranunderdomener i kontakt med andre organeller, spesielt med mitokondriene. For det ble mitokondrienettverket i HeLa-celler farget med en rød mitokondriemarkør, og ORP5-ORP8 PLA grønne flekker ble detektert etter fiksering ved bruk av de primære antistoffene anti-ORP5 og anti-ORP8, hvis spesifisitet tidligere ble testet ved immunfluorescens15. Konfokale bilder viste at endogene ORP5-ORP8 PLA-interaksjoner i HeLa-cellene forekom i retikulær ER, kortikal ER og i ER-underdomener i nær kontakt med mitokondrier, ofte referert til som mitokondriassosierte ER-membraner (MAMs; Figur 2A). For å kvantifisere ORP5-ORP8 PLA-interaksjonene som forekommer ved MAMs, ble avstanden til hvert PLA-punkt fra mitokondrier evaluert ved hjelp av 3D-bildeanalyse. Ved å bruke en avstandsterskel på 380 nm, viste 3D-bildeanalyse at omtrent 50% av endogene ORP5-ORP8 PLA-interaksjoner ble detektert ved MAMs (figur 2A, B). De andre 50 % av interaksjonene ble fordelt mellom kortikal og retikulær ER15. For å validere spesifisiteten til PLA ble ORP5-ORP8 PLA-eksperimenter utført enten i celler behandlet med ORP5-målretting og ORP8-målrettede siRNA (negativ kontroll) eller i celler som overuttrykker ORP5 og ORP8 (positiv kontroll). ORP5 og ORP8 nedregulering induserte en massiv reduksjon i det totale antall PLA-signaler (ved MAMs, ved retikulært ER og ved kortikal ER; Figur 2A,C), mens deres co-overexpression resulterte i en økning i PLA (figur 2A,C), noe som bekrefter spesifisiteten til ORP5-ORP8 PLA. Imidlertid var prosentandelen av ORP5-ORP8 PLA-interaksjoner som forekommer ved MAMer i celler som overuttrykker ORP5 og ORP8 lik den som ble observert i celler der disse proteinene ble uttrykt på endogene nivåer (figur 2B), noe som støtter deres eksistens som et kompleks ved MAMs. For ytterligere å bekrefte tilstedeværelsen av ORP5 og ORP8 ved ER-membransubdomener i nær kontakt med mitokondrier, ble det utført ytterligere kvantitative PLA-analyser mellom ORP5 eller ORP8 og det ytre mitokondriemembranproteinet PTPIP51, en kjent bindingspartner av ORP5 og ORP813. PLA-signaler ble påvist hos både ORP5-PTPIP51 og ORP8-PTPIP51-par, og deres gjennomsnittlige tall var lik ORP5-ORP8 PLA-paret, noe som bekreftet ORP5- og ORP8-lokalisering ved ER-mitokondrier MCS (figur 3).

Til slutt, i nyere arbeider fra laboratoriet vårt, ved å bruke en lignende tilnærming i HeLa-celler transfektet med PHPLCd-RFP eller mcherry-PLN1 for å markere henholdsvis PM eller LD, var vi i stand til å analysere forekomsten av ORP5-ORP8 PLA-interaksjoner ved ER-PM-kontakter og å identifisere et treveis kontaktsted mellom mitokondrier, ER og LD (figur 4) 15, 17.

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyt for identifisering av PLA-signaler i nærheten av mitokondriene. Først er konfokalstablene segmentert for å identifisere PLA-foci (flekker) og mitokondrienettverket (overflater). Deretter beregnes 3D-avstandskart mot utsiden av overflatene (mitokondrier), slik at avstanden til hvert sted fra nærmeste mitokondrion kan måles. Til slutt klassifiseres PLA-flekker i to populasjoner (rød og grønn) basert på en nærhetsterskel på 380 nm etablert basert på deteksjonssystemets presisjon. Denne figuren er modifisert fraMonteiro-Cardoso et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative bilder av ORP5-ORP8-komplekset uttrykt ved endogene nivåer lokalisert ved ER-mitokondrie-kontakter. (A) ORP5-ORP8 PLA konfokalserie og respektive 3D-rekonstitusjoner. Skalastenger: 10 μm og 2 μm (utvidede bilder). (B) Kvantifisering av ORP5-ORP8 PLA-foci i nær kontakt med mitokondrier. Endo, n = 33 celler og Overexp ORP5+ORP8, n = 27 celler. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (standardfeil av gjennomsnittet). Dette bildet er modifisert fra Monteiro-Cardoso et al.15. (C) Kvantifisering av total ORP5-ORP8 PLA foci. Endo, n = 38 celler, siORP5+siORP8, n = 38 celler og Overexp ORP5+ORP8, n = 35 celler. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (standardfeil av gjennomsnittet). Dette bildet er modifisert fra Monteiro-Cardoso et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative bilder av PLA-signaler mellom ORP5 eller ORP8 med mitokondrieproteinet PTPIP51. (A) Konfokale serier ble brukt til å generere 3D-rekonstitusjoner og avstandskart for å bekrefte at ORPR5 eller ORP8 PLA-interaksjoner med PTPIP51 forekommer ved ER-mitokondrier nærkontakter. Skalastenger: 10 μm og 2 μm (utvidede bilder). (B) PTPIP51 immunfluorescens konfokale bilder (enkelt fokalplan) i kontroll og HeLa-celler behandlet med siRNA rettet mot PTPIP51. Skalastenger: 10 μm og 2 μm (utvidede bilder). (C) ORP5-PTPIP51 og ORP8-PTPIP51 PLA konfokale bilder i kontroll og HeLa-celler behandlet med siRNA rettet mot PTPIP51. Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Eksempler på 3D-rekonstruksjoner brukt til å lokalisere ORP5-ORP8 PLA-komplekset ved ER-PM og ER-mitokondrier-LD-kontakter. (A) Konfokalbilde og respektive 3D-rekonstituering av en HeLa-celle med ORP5-ORP8 PLA, representert ved de grønne flekkene, PM merket med PHPLCd-RFP, representert av den røde cellen, og mitokondrier merket med Mito-BFP, representert av blå overflater. Venstre og midterste bilder: representasjon av hele HeLa-cellen. Høyre bilde: representasjon av et zoomet område inne i cellen. (B) Konfokalbilde og respektive 3D-rekonstituering av et innzoomet område av en HeLa-celle med ORP5-ORP8 PLA, representert ved de grønne flekkene, LD-er merket med mCherry-PLN1, representert av de røde flatene, og Mito-BFP, representert av de blå flatene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen ble designet for å identifisere og kvantifisere interorganelle protein PLA-interaksjoner ved MCS-er, spesielt ved MERCS-er. Nyheten av protokollen er at den kombinerer PLA med merking av flere organeller, konfokal mikroskopi og 3D-bildeanalyse for å lokalisere og kvantifisere PLA-interaksjoner mellom to proteiner som bor i samme membran, i dette tilfellet innenfor ER-membranen i nærheten av membranen til mitokondrier (MAM) eller med MAM og LD samtidig. Denne protokollen kan brukes som et verktøy for å validere proteiner som potensielt lokaliseres ved spesifikke MERCS-er, men også hos andre MCS-er.

Siden utviklingen i 2006 har PLA mellom et ER og et mitokondrielt protein blitt mye brukt til å kvantifisere MERCS 7,9,10,11. Imidlertid må bruken av PLA som en indikator på MERCS-overflod i celler nøye verifiseres ved høyoppløselige tilnærminger. For eksempel endrer ablasjonen av SAM50, et mitokondrielt protein som ikke påvirker overflod av MERCS (kvantifisert ved elektronmikroskopi)15, heller ikke PLA-interaksjoner mellom ER-proteinet ORP8 og mitokondrieproteinet TOM20, men det reduserer PLA-interaksjoner mellom ORP8 og mitokondrieproteinet Metaxin2 uten å redusere ekspresjonsnivåene15. Disse resultatene gjenspeiler at PLA-interaksjoner kan være spesifikke for proteinparet som brukes i analysen og ikke kan brukes som den eneste parameteren for å vurdere overflod av MERCS.

Ikke desto mindre er PLA en bevist sensitiv tilnærming for å oppdage in situ endogene proteininteraksjoner. I motsetning til andre fluorescerende sondebaserte deteksjonsmetoder, inkludert split-GFP og FRET, eller høyoppløselige bildebehandlingsmetoder, krever PLA ikke overekspresjon av merkede proteiner, og unngår iboende eksperimentelle artefakter, for eksempel endring av de fysiske egenskapene til de målrettede organellene15. Deteksjon av proteininteraksjoner ved PLA gir også fordeler i forhold til andre immunodeteksjonsmetoder, for eksempel co-immunoprecipitation med western blot. Mens PLA tillater kvantifisering av enkeltfluorescenspunkter på enkeltcellenivå, krever koimmunopresipitering en høy mengde biologisk materiale og tillater bare den relative kvantifiseringen av proteinet ekstrahert fra et basseng av heterogene celler, for hvilket en passende lastkontroll er vanskelig å oppnå15. Den ekstra fordelen ved bruk av PLA kombinert med organellfarging og konfokalmikroskopi over co-immunoprecipitation er at den første tilnærmingen tillater lokalisering av proteininteraksjoner på subcellulært nivå.

På den annen side er de fremtredende ulempene ved denne protokollen forbundet med PLA-deteksjonsområdet på ca. 40 nm, som er større enn MERCS, og med maksimal oppløsning oppnådd ved konfokalmikroskopi på ca. 250 nm, noe som gjør det vanskelig å utvetydig identifisere kontaktsteder. Her ble imidlertid en terskel på 380 nm brukt til å estimere PLA-flekkene assosiert med mitokondrieoverflater basert på størrelsen på PLA-reaksjonen, inkludert foreningen av de primære og sekundære antistoffene (30 nm) pluss halvparten av FWHM av PLA-amplifikasjonssignalene (350 nm). En annen begrensning av PLA er relatert til det faktum at den bare kan brukes i faste prøver, og oppkjøpet av et distinkt, spesifikt og kvantifiserbart PLA-signal krever tilgjengeligheten av antistoffer som er svært spesifikke for proteinet av interesse15. I tillegg krever 3D-bildeanalyse for avstandsestimering spesifikk programvare som kanskje ikke er lett tilgjengelig i alle laboratorier.

Spesielt kan noen av ulempene nevnt ovenfor løses ved å bruke nylig tilgjengelige teknologier. For eksempel kan konvensjonell konfokalmikroskopi erstattes av avbildningsteknikker på et høyere oppløsningsnivå, for eksempel Airyscan eller strukturert belyst mikroskopi (SIM)17, og mangelen på gode primære antistoffer for proteinene av interesse kan overvinnes ved stabil merking av endogene proteiner ved hjelp av CRISPR-Cas9-teknologien18. Endelig kan kvaliteten og spesifisiteten til antistoffene og PLA-signalene verifiseres ved å bruke følgende kontroller: 1) testing av de primære antistoffene ved immunfluorescens og western blot i kontrollceller og i celler der proteinet av interesse er utarmet eller overuttrykt; 2) utfører PLA i celler der ett eller begge proteiner av interesse har blitt utarmet; 3) utfører PLA i celler som overuttrykker proteinene av interesse; 4) utfører PLA mens du utelater begge antistoffene for proteinene av interesse; 5) utfører PLA ved å bruke bare ett av de to antistoffene for proteinene av interesse; 6) utføre PLA med inkubasjon med samme IgG som arten som de primære antistoffene ble generert fra. For å vurdere deres spesifisitet ble antistoffene som ble brukt i denne protokollen testet av immunfluorescens og western blot i kontrollceller og i celler som ble behandlet med siRNA rettet mot ORP5 15, ORP8 15 eller PTPIP51 (figur 3B og Guyard et al.17). Videre har anti-ORP5- og anti-ORP8-spesifisiteten blitt vurdert i celler som uttrykker EGFP-merket ORP5 eller ORP8 ved å evaluere Pearsons koeffisient mellom antistoffdeteksjonssignalet og EGFP-signalet15. Spesifisitetene til antistoffene anti-ORP5 15, anti-ORP815 og anti-PTPIP51 (figur 1 og figur 3C) ble videre analysert i celler der disse proteinene var utarmet, noe som førte til en reduksjon i PLA-signaler. Merk at antistoffkonsentrasjonen som er egnet for immunfluorescensfarging vanligvis også er egnet for PLA; Avhengig av antistoffene som brukes, kan det imidlertid gjøres noen justeringer i blokkeringsløsningen og/eller antistoffkonsentrasjonene for å forbedre PLA-fargingen. ORP5-ORP8 og ORP8-PTPIP51 PLA-fargingen ble forbedret etter justering av blokkeringsløsningen. For å oppnå høy kvalitet mitokondriell og PLA-farging, er det viktig å skaffe konfokale bilder av høy kvalitet med lave bakgrunnssignaler, noe som er viktig for å lette 3D-modulering. For eksempel konfokale bilder med høy bakgrunnspåvirkningsterskeljustering og følgelig påvirker nøyaktigheten av 3D-modulasjonen av mitokondrienettverket eller PLA.

Avslutningsvis muliggjør protokollen som presenteres her lokalisering og kvantifisering av PLA-proteininteraksjoner ved spesifikke MERCS-underdomener (interaksjoner mellom proteiner lokalisert i cis innenfor samme membran engasjert i MCS eller mellom proteiner lokalisert i trans i sidestilte membraner) ved å bruke multicellulær organellmerking og generere avstandskart i 3D-rekonstruerte konfokale bilder. Selv om prosedyrene beskrevet her er teknisk enkle og relativt raske sammenlignet med andre metoder for å oppdage proteininteraksjoner ved MERCS, er dataene som er oppnådd svært reproduserbare. Videre er denne protokollen like allsidig som antistoffene som er tilgjengelige for proteinene av interesse og som markørene som er tilgjengelige for å flekke organellene. Derfor kan den brukes på et bredt spekter av par proteiner og flere organeller og MCS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), ATIP-Avenir-programmet, Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548), og Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay plantevitenskap).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) Gibco 14190-094
Ammonium chloride (NH4Cl) VWR 21236.291
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7906
Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 Agar Scientific L46R13-15
CMXRos red MitoTracker Invitrogen M7512 red mitochondrial marker
Confocal inverted microscope SP8-X Leica DMI 6000
Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates Merck CLS3526
Duolink In Situ Detection Reagents Green  Sigma DUO92002
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI  Sigma DUO82040
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS  Sigma DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma DUO92014
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence  Sigma DUO82049
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement  Gibco 51985026 serum free medium
Imaris software v 9.3 Bitplane N/A cell imaging software
Incubator UINCU-line IL10 VWR 390-0384
Microscope slide StarFrost (3“ x 1“)  Knittel Glass
mouse anti-ORP8  Santa Cruz 134409
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148
rabbit anti-ORP5  Sigma HAP038712
Saponin Sigma 84510
Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free Invitrogen 10977-035

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287 (2019).
  2. Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).
  3. Giordano, F. Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface. Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).
  4. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  5. Gomez-Suaga, P., et al. The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy. Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).
  6. Han, S., et al. The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo. Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).
  7. Stoica, R., et al. ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3β to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations. EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).
  8. Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).
  9. Cuello, F., et al. Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation. EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).
  10. Paillusson, S., et al. α-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production. Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).
  11. Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).
  12. Chung, J., et al. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  13. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  14. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8, 757 (2017).
  15. Monteiro-Cardoso, V. F., et al. ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine. Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).
  16. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).
  17. Guyard, V., et al. ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites. The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 200 PLA 3D-bildeanalyse lysmikroskopi membrankontaktsteder endoplasmatisk retikulum-mitokondrie-kontaktsteder proteininteraksjon membrankontaktkomponenter
Visualisering og kvantifisering av endogene intraorganelle proteininteraksjoner på ER-mitokondrier kontaktsteder ved nærhetsligeringsanalyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monteiro-Cardoso, V. F., Le Bars,… More

Monteiro-Cardoso, V. F., Le Bars, R., Giordano, F. Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays. J. Vis. Exp. (200), e64750, doi:10.3791/64750 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter