Summary
La necesidad de nuevos enfoques para estudiar los sitios de contacto de membrana (MCS) ha crecido debido al creciente interés en el estudio de estas estructuras celulares y sus componentes. Aquí, presentamos un protocolo que integra tecnologías de microscopía previamente disponibles para identificar y cuantificar complejos de proteínas intra-orgánulos e inter-orgánulos que residen en los SQM.
Abstract
Los sitios de contacto de membrana (MCS) son áreas de proximidad cercana a la membrana que permiten y regulan el intercambio dinámico de diversas biomoléculas (es decir, calcio y lípidos) entre los orgánulos yuxtapuestos sin involucrar la fusión de la membrana. Las SQM son esenciales para la homeostasis celular, y sus funciones están aseguradas por los componentes residentes, que a menudo existen como complejos de proteínas multiméricas. Las SQM a menudo involucran el retículo endoplásmico (RE), un sitio importante de síntesis de lípidos y almacenamiento de calcio celular, y son particularmente importantes para los orgánulos, como las mitocondrias, que están excluidos de las vías clásicas de transporte vesicular. En los últimos años, las SQM entre el RE y las mitocondrias han sido ampliamente estudiadas, ya que sus funciones tienen un fuerte impacto en el metabolismo/bioenergética celular. Se han comenzado a identificar varias proteínas en estos sitios de contacto, incluidas las ataduras de membrana, los canales de calcio y las proteínas de transferencia de lípidos, lo que plantea la necesidad de nuevas metodologías y enfoques técnicos para estudiar estos componentes de la SQM. Aquí, describimos un protocolo que consiste en enfoques técnicos combinados, que incluyen el ensayo de ligadura de proximidad (PLA), la tinción de mitocondrias y la segmentación por imágenes 3D, que permite la detección de proteínas que están físicamente cerca (>40 nm) entre sí y que residen en la misma membrana en los MCS ER-mitocondrias. Por ejemplo, utilizamos dos proteínas de transferencia de lípidos ancladas al RE, ORP5 y ORP8, que previamente se ha demostrado que interactúan y se localizan en las MCS de la mitocondria del RE y de la membrana plasmática del RE. Al asociar el PLA ORP5-ORP8 con el análisis de software de imágenes celulares, fue posible estimar la distancia del complejo ORP5-ORP8 desde la superficie mitocondrial y determinar que aproximadamente el 50% de la interacción ORP5-ORP8 PLA ocurre en los subdominios RE en las proximidades de las mitocondrias.
Introduction
La comunicación entre orgánulos es una característica definitoria de las células eucariotas. Una forma en que los orgánulos se comunican es mediante la formación de sitios de contacto de membrana (MCS), que son oposiciones de membrana cercanas entre dos orgánulos que son mantenidas por proteínas estructurales y funcionales, como ataduras, proteínas de transferencia de lípidos y canales de calcio1. Los SQM pueden establecerse entre orgánulos similares o diferentes, y median el intercambio de componentes celulares, lo cual es importante para mantener la homeostasis celular. Hasta la fecha, se han identificado varias SQM, incluidos los contactos del retículo endoplásmico (RE)-mitocondrias, RE-membrana plasmática (PM) y ER-gotitas lipídicas (LD)1. Entre ellas, las que se forman entre el RE y las mitocondrias (MERCSs) se encuentran entre las más estudiadas, ya que están implicadas en la regulación de varias funciones celulares, entre ellas la homeostasis lipídica y cálcica2. Dado que las mitocondrias están excluidas en gran medida de las vías clásicas de transporte vesicular, dependen de MERCS y de sus constituyentes moleculares para importar lípidos o precursores lipídicos clave del RE. El transporte no vesicular de estos lípidos a través de los MERCS garantiza el mantenimiento de la composición lipídica mitocondrial adecuada, así como su integridad funcional y estructural3.
Dada la participación crucial de las SQM en diversas funciones celulares, el interés por proporcionar una comprensión más profunda de sus componentes moleculares ha aumentado considerablemente en los últimos años. Se han utilizado varios tipos de enfoques basados en imágenes para avanzar en el conocimiento de las SQM. Entre ellos, el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) basado en sonda de fluorescencia ha sido ampliamente utilizado como indicador de la abundancia de SQM mediante la detección de interacciones proteína-proteína entre orgánulos (en un rango de detección de 40 nm) a niveles endógenos4. Por ejemplo, los MERCS se han visualizado y cuantificado mediante el uso de PLA entre varios pares de proteínas mitocondrias-ER, incluidos VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 y PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Aunque esta tecnología se ha utilizado para detectar y cuantificar las interacciones proteína-proteína entre orgánulos que están presentes en el MCS 5,7,9,10,11, la mayoría de los estudios no combinaron PLA con tinción de orgánulos. En consecuencia, aún no se ha desarrollado un método cuantitativo que permita medir la proximidad entre las interacciones del PLA y los orgánulos asociados. Por lo tanto, hasta ahora, en el caso de las proteínas RE, su interacción dentro de los subdominios de membrana en contacto con otros orgánulos no se ha distinguido de su interacción dentro de la red RE ampliamente distribuida.
Aquí, describimos un protocolo para detectar interacciones de PLA entre proteínas que residen en la membrana del mismo orgánulo y analizar su proximidad a la membrana del orgánulo asociado en el MCS. Este protocolo se desarrolló en base a dos premisas: 1) estudios previos que muestran que, en condiciones de sobreexpresión, las proteínas de transferencia de lípidos del RE ORP5 y ORP8 se colocalizan e interactúan en las mitocondrias del RE y en los MCS del RE-PM 12,13,14,15 y que el ORP5 se localiza en los contactos del RE-LD 16,17; 2) las tecnologías existentes, como el PLA, la microscopía confocal, el marcaje de orgánulos y el análisis de imágenes en 3D.
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Protocol
1. Tinción mitocondrial y ensayo de ligadura de proximidad (PLA)
- Placa 0,5 x 10 5-2 x 10 5 5 células HeLa, mantenidas en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de aminoácidos no esenciales a 37 °C con 5% de CO2, en cubreobjetos de vidrio de 13 mm en placas de1,5 en 24 pocillos a una dilución que permite una confluencia celular del 75%-90% el día del procedimiento.
NOTA: Cabe destacar que las células HeLa pueden someterse a tratamientos adicionales, como el tratamiento con siRNA y/o la transfección de plásmidos de ADN, antes de la tinción mitocondrial y el PLA. - Tinción mitocondrial
- Lavar las células una vez en un medio sin suero precalentado a 37 °C. Incubar las células con medio precalentado sin suero durante 10 min a 37 °C con 5% de CO2.
- Prepare 1 μM de marcador mitocondrial rojo en medio libre de suero precalentado.
- Incubar las células con 500 μL de solución marcadora mitocondrial durante 30 min a 37 °C con 5% de CO2. Durante el tratamiento con marcadores mitocondriales y los siguientes pasos del protocolo, mantenga las células en cubreobjetos protegidas de la luz tanto como sea posible.
- Después de la incubación, lavar las células 1 vez en medio libre de suero precalentado y 2 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x. Realice este paso lo más rápido posible, ya que los largos pasos de lavado antes de la fijación pueden afectar la morfología mitocondrial.
- Retire el 1x PBS de los cubreobjetos y fije las células incubándolas en PFA al 4% recién preparado (en 1x PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente (en la oscuridad) bajo la cubierta química. Lavar 3 veces durante 2 minutos en 500 μL de 1x PBS (usando pipetas desechables o un sistema de vacío conectado a una bomba).
- Retire el 1x PBS e incube los cubreobjetos con 500 μL de 50 mM de NH4Cl durante 15 min a temperatura ambiente (en la oscuridad). Lavar 1 vez durante 2 minutos en 500 μL de 1x PSB utilizando un sistema de vacío.
- Lavar 3 veces durante 2 min en 500 μL de tampón de bloqueo 1 (BB1, 1% BSA, 0,1% saponina en 1x PBS) para el PLA ORP5-ORP8 o tampón de bloqueo 2 (BB2, 2% BSA, 0,1% suero normal de cabra, 0,1 saponina en 1x PBS) para el ORP8-PTPIP51 PLA.
- Transfiera los cubreobjetos de la placa de 24 pocillos a una cámara de humedad. Después de transferir los cubreobjetos a la cámara, agregue 100 μL de BB (BB1 o BB2, según los pares de anticuerpos utilizados) para evitar la sequedad.
NOTA: Se puede obtener fácil y rápidamente una cámara de humedad protegida de la luz envolviendo una placa de Petri (plástico o vidrio) en papel de aluminio y agregando algunos trozos de toalla de papel húmeda en la periferia de la placa de Petri.
- Ensayo de ligadura de proximidad (PLA)
NOTA: El protocolo PLA sigue las instrucciones del fabricante con ligeras modificaciones.- Incubación primaria de anticuerpos
- Prepare la solución de trabajo de anticuerpos primarios. Diluir anti-ORP5 de conejo (1:150) más anti-ORP8 de ratón (1:200) en BB1, anti-ORP8 de ratón (1:200) más anti-PTPIP51 de conejo (1:200) en BB2 y anti-ORP5 de conejo (1:150) más anti-PTPIP51 de ratón (1:200) en BB1. Prepare (al menos) 40 μL de solución de anticuerpos primarios por cubreobjetos (p. ej., 0,27 μL de anti-ORP5 de conejo, 0,2 μL de anti-ORP8 de ratón, 39,53 μL de BB1).
- Retire el BB del lavado anterior (paso 1.2.8) mediante un sistema de vacío y añada 40 μL de solución primaria de anticuerpos a los cubreobjetos. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara de humedad protegida de la luz.
- Lave los cubreobjetos 3 veces durante 5 minutos con 100 μL del BB correspondiente utilizando el sistema de vacío.
- Incubación de sondas de PLA
- Prepare la solución de trabajo de las sondas PLA. Diluir las sondas de PLA de conejo PLUS (1:5) y MINUS (1:5) de ratón en BB y mezclar. Para cada cubreobjetos, prepare (al menos) 40 μL de solución de sonda de PLA (p. ej., 8 μL de sonda de PLA PLUS de conejo, 8 μL de sonda de PLA MENOS de ratón, 24 μL de BB). Deje reposar la solución de la sonda de PLA durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de usarla.
- Retire el BB de los cubreobjetos (a partir del paso 1.3.2) utilizando un sistema de vacío y añada 40 μL de solución de sonda de PLA a los cubreobjetos. Incubar durante 1 h a 37°C en una cámara de humedad protegida de la luz.
- Lave los cubreobjetos 2 veces durante 5 min en 100 μL de 1 tampón de lavado A a temperatura ambiente.
- Ligadura
- Diluir el tampón de ligadura 5x a 1:5 en agua ultrapura y mezclar. Para cada cubreobjetos, prepare (al menos) 40 μL de solución de ligadura (8 μL de tampón de ligadura 5x, 31 μL de agua ultrapura).
- Añadir la ligasa (1 U/μL, suministrada en el kit de PLA) a 1x tampón de ligadura preparado en el paso anterior a una dilución de 1:40, y mezclar.
- Retirar 1x tampón de lavado A de los cubreobjetos (a partir del paso 1.3.4) mediante un sistema de vacío, añadir 40 μL de solución de ligasa a los cubreobjetos e incubar durante 30 min a 37 °C en una cámara de humedad protegida de la luz.
- Lave los cubreobjetos 2 veces durante 2 minutos en 100 μL de 1 tampón de lavado A a temperatura ambiente utilizando el sistema de aspiración.
- Polimerización
- Diluir 5 tampones de amplificación 1:5 en agua ultrapura y mezclar. Para cada cubreobjetos, prepare (al menos) 40 μl de solución de amplificación (8 μl de tampón de amplificación 5x, 31,5 μl de agua ultrapura).
- Añadir la polimerasa (10 U/μL, suministrada en el kit de PLA) al tampón de polimerización 1x preparado en el paso anterior a una dilución de 1:80, y mezclar.
- Retirar 1x tampón de lavado A de los cubreobjetos (del paso 1.3.6) mediante un sistema de vacío, añadir 40 μL de solución de polimerasa a los cubreobjetos e incubar durante 1 h 40 min a 37 °C en una cámara de humedad protegida de la luz.
- Retire la solución de polimerasa de los cubreobjetos y lave 2 veces durante 10 min en 100 μL de 1 tampón de lavado B a temperatura ambiente en una cámara de humedad protegida de la luz.
- Lave los cubreobjetos 1 vez durante 1 min en 100 μL de 0,001x tampón de lavado B a temperatura ambiente en una cámara de humedad protegida de la luz.
- Monte los cubreobjetos en portaobjetos de vidrio para microscopía utilizando un medio de montaje con DAPI (concentración entre 1,6-0,4 μg/mL). Sella con esmalte de uñas.
- Incubación primaria de anticuerpos
2. Adquisición de imágenes
- Observe los resultados del PLA y adquiera imágenes mediante microscopía confocal de fluorescencia con un objetivo de inmersión en aceite de 63x utilizando el software adjunto.
- Establezca la excitación de fluorescencia con un diodo láser de 405 nm o un láser de luz blanca, y recoja las ventanas espectrales con PMT de GaAsP o detectores híbridos. En cada plano focal (que abarca 300 nm), adquiera las señales de fluorescencia para PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) y mitocondrias (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm).
3. Procesamiento de imágenes y evaluación de manchas de PLA asociadas a mitocondrias
- Procese las imágenes confocales utilizando un software para el análisis de imágenes que genera mapas de distancia entre los componentes celulares. Siga los pasos que se indican a continuación para generar reconstituciones 3D de los puntos de PLA y la red mitocondrial y para acceder a la distancia entre ellos mediante un software de imágenes celulares (Figura 1).
- Instalación de la extensión de mapa de distancia 3D
- Instale tanto el paquete de software de análisis celular con la opción XT como el software de MATLAB o solo un tiempo de ejecución del compilador de MATLAB (MRC), que se puede descargar gratuitamente desde el sitio web.
- Configure el software de análisis celular para iniciar MATLAB cuando se inicie un XTension de la siguiente manera: en la opción Imaris (Mac OS X) o en el menú Editar (Windows), seleccione Preferencias, cambie al panel Herramientas personalizadas y, a continuación, establezca la ruta:
C:\Archivos de programa\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe para Windows o/Aplicaciones/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab para Mac OS X.
- Importar las imágenes al software
- Convierta las imágenes de pila confocal en un archivo . IMS, ya sea directamente a través de la sección Arena o utilizando el convertidor de archivos independiente que permite la conversión por lotes.
- Después de la importación, compruebe que las imágenes permanezcan correctamente calibradas. Haga clic en Editar > Propiedades de la imagen > Geometría de la imagen y compruebe que el tamaño del vóxel corresponde en X e Y al tamaño de píxel esperado para la imagen real (consulte la calibración de la imagen en el software de adquisición) y que el tamaño del vóxel en Z corresponde al paso aplicado por el microscopio para generar la pila Z. Si los valores no son correctos, modifíquelos para garantizar una estimación correcta de las distancias en los siguientes pasos.
- Ajuste el contraste de los diferentes canales en el menú Ajuste de pantalla haciendo clic en Editar > Mostrar ajuste de pantalla. Ajuste cada canal de forma independiente para optimizar la visualización de cada color. Este paso no afecta directamente a los valores de la imagen, pero es esencial para establecer umbrales precisos o detectar objetos débiles.
- Limite el análisis a una sola celda recortando la imagen con las opciones Editar > Recortar 3D. Para analizar otra celda en el mismo campo de visión, abra la misma imagen una vez más y recórtela de manera diferente.
- Detección puntual ORP5-ORP8
- Detecte las señales PLA generadas en la ubicación de la interacción de ORP5 y ORP8 haciendo clic en la opción Agregar nuevos puntos, que crea un nuevo conjunto de objetos y abre el asistente de detección de puntos.
- Seleccione el canal en el que se debe realizar la detección puntual.
- Ajuste el diámetro XY estimado (el rango debe adaptarse si el tamaño del objeto difiere) para ayudar al algoritmo de detección de puntos a encontrar los objetos de interés. Tenga en cuenta que si el valor elegido es demasiado alto, los objetos cercanos se fusionarán. Si el valor es demasiado pequeño, una señal puede considerarse como varios objetos, o se pueden detectar señales aberrantes.
- Haga clic en Sustracción de fondo para eliminar el fondo de la imagen antes de la detección puntual para mejorar el contraste local alrededor de los objetos de interés.
- Ajuste el umbral de detección puntual manteniendo la calidad (intensidad en el centro del objeto) como parámetro de umbral y el umbral automático del software, o modifique ligeramente este valor para detectar todos los objetos. Una vez finalizada la detección puntual, guarde los parámetros de detección y reutilícelos para procesar otras imágenes.
- Detección de redes mitocondriales
- Detecte la red mitocondrial para generar una representación de superficie haciendo clic en Agregar nuevas superficies para crear un nuevo objeto y abra el asistente de detección de superficies.
- Seleccione el canal en el que se debe realizar la creación de superficies.
- Aplique un filtro gaussiano para obtener una superficie más suave haciendo clic en la casilla de verificación Suavizar y estableciendo un umbral que indique los detalles más pequeños observables en la superficie.
- Realice una resta de fondo para mejorar los contrastes locales y ayudar con el paso de umbral.
- Ajuste el umbral para detectar la red mitocondrial en función de la intensidad de la señal. Si es difícil establecer correctamente el umbral, se recomienda volver al paso anterior para ajustar el grado de suavidad y la resta de fondo.
- Si es necesario, aplique un filtro en la superficie para eliminar los pequeños residuos resultantes del umbral. Para ello, seleccione el filtro Número de vóxeles en la ventana de clasificación de superficie y juegue con los umbrales superior e inferior para mantener solo los objetos de interés. Una vez finalizada la creación de la superficie, guarde los parámetros de creación y reutilícelos para procesar otras imágenes.
- Generación del mapa de distancias 3D alrededor de las mitocondrias
- Genere un mapa de distancia fuera de la superficie mitocondrial creado previamente de la siguiente manera. Seleccione la superficie de las mitocondrias en el cuadro del árbol de escenas. Haga clic en Procesamiento de imágenes > Función de superficies > Transformación de distancia. Esto llamará a un Matlab XTension que pide al usuario que elija si el mapa debe calcularse fuera o dentro de la superficie del objeto.
- Seleccione Objeto de superficie exterior para medir la distancia entre los puntos de PLA y la superficie de las mitocondrias. Una vez generado, el mapa de distancia aparece como un nuevo canal en el panel de ajuste de visualización. En este canal, cada píxel tiene un valor correspondiente a la distancia a la mitocondria más cercana.
- Extracción de las distancias de los objetos a la mitocondria más cercana
- Para medir la distancia desde cada punto hasta la mitocondria más cercana e identificar y visualizar las más cercanas, seleccione los puntos generados previamente en el cuadro del árbol de escenas.
- En las estadísticas y el registro detallado, seleccione Valores específicos (para obtener una medición para cada punto). Seleccione Intensidad central Ch=X (donde X corresponde al número del canal del mapa de distancia). Esto medirá el valor de cada centro puntual, que corresponde a su distancia a la mitocondria más cercana, en el mapa de distancias.
- Exporte los datos como un archivo .csv haciendo clic en el icono de disquete en la parte inferior izquierda de la ventana.
- Para extraer una subpoblación de puntos en función de sus distancias a las mitocondrias, seleccione los puntos en el árbol de escenas y haga clic en la pestaña Filtros .
- En esta ventana, agregue un nuevo filtro basado una vez más en la intensidad central Ch=X, y extraiga los puntos a menos de 380 nm de distancia de las mitocondrias estableciendo el umbral inferior en 0 μm y el umbral superior en 0,380 μm.
NOTA: El umbral de 380 nm se estimó sobre la base de una reacción de PLA que incluía la asociación entre los anticuerpos primarios y secundarios (30 nm) más la mitad del ancho total a la mitad del máximo (FWHM) de las señales de amplificación de PLA (350 nm). - Para enfocar las manchas seleccionadas y, por ejemplo, darles un color distinto, realice un paso de duplicación pulsando el botón Duplicar selección a nuevas tintas .
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Representative Results
Utilizando el protocolo descrito anteriormente, detectamos los sitios de interacción de dos proteínas de transferencia de lípidos ancladas al RE, ORP5 y ORP8, y evaluamos su ocurrencia en los subdominios de la membrana del RE en contacto con otros orgánulos, en particular, con las mitocondrias. Para ello, se tiñó la red mitocondrial en las células HeLa con un marcador mitocondrial rojo, y se detectaron puntos verdes de PLA ORP5-ORP8 después de la fijación utilizando los anticuerpos primarios anti-ORP5 y anti-ORP8, cuya especificidad se probó previamente mediante inmunofluorescencia15. Las imágenes confocales mostraron que las interacciones endógenas de ORP5-ORP8 PLA en las células HeLa ocurrieron en el RE reticular, el RE cortical y en los subdominios del RE en estrecho contacto con las mitocondrias, comúnmente conocidas como membranas del RE asociadas a mitocondrias (MAM; Figura 2A). Con el fin de cuantificar las interacciones ORP5-ORP8 PLA que ocurren en los MAM, se evaluó la distancia de cada punto de PLA a las mitocondrias mediante análisis de imágenes 3D. Utilizando un umbral de distancia de 380 nm, el análisis de imágenes 3D reveló que alrededor del 50% de las interacciones endógenas ORP5-ORP8 PLA se detectaron en los MAM (Figura 2A, B). El otro 50% de las interacciones se distribuyeron entre el RE cortical y reticular15. Para validar la especificidad del PLA, se realizaron experimentos de PLA ORP5-ORP8 en células tratadas con siRNAs dirigidos a ORP5 y dirigidos a ORP8 (control negativo) o en células que co-sobreexpresan ORP5 y ORP8 (control positivo). La regulación negativa de ORP5 y ORP8 indujo una disminución masiva en el número total de señales de PLA (en los MAM, en el RE reticular y en el RE cortical; Figura 2A,C), mientras que su co-sobreexpresión resultó en un aumento del PLA (Figura 2A,C), confirmando la especificidad del PLA ORP5-ORP8. Sin embargo, curiosamente, el porcentaje de interacciones ORP5-ORP8 PLA que se producen en los MAM en las células que co-sobreexpresan ORP5 y ORP8 fue similar al observado en las células donde estas proteínas se expresaron a niveles endógenos (Figura 2B), lo que respalda su existencia como un complejo en los MAM. Para confirmar aún más la presencia de ORP5 y ORP8 en los subdominios de la membrana del RE en estrecho contacto con las mitocondrias, se llevaron a cabo análisis cuantitativos adicionales de PLA entre ORP5 u ORP8 y la proteína de la membrana mitocondrial externa PTPIP51, un socio de unión conocido de ORP5 y ORP813. Las señales de PLA se detectaron tanto en las parejas ORP5-PTPIP51 como en las ORP8-PTPIP51, y sus números promedio fueron similares a los de la pareja ORP5-ORP8 PLA, lo que confirma la localización de ORP5 y ORP8 en los SQM ER-mitocondrias (Figura 3).
Finalmente, en trabajos recientes de nuestro laboratorio, mediante el uso de un enfoque similar en células HeLa transfectadas con PHPLCd-RFP o mcherry-PLN1 para marcar el PM o el LD, respectivamente, pudimos analizar la ocurrencia de interacciones ORP5-ORP8 PLA en los contactos ER-PM e identificar un sitio de contacto de tres vías entre las mitocondrias, el RE y los LD (Figura 4)15, Artículo 17.
Figura 1: Flujo de trabajo para la identificación de señales de PLA en las proximidades de las mitocondrias. En primer lugar, se segmentan las pilas confocales para identificar los focos (manchas) de PLA y la red mitocondrial (superficies). Luego, se calculan mapas de distancia en 3D hacia el exterior de las superficies (mitocondrias), lo que permite medir la distancia de cada punto a la mitocondria más cercana. Por último, las manchas de PLA se clasifican en dos poblaciones (rojo y verde) en función de un umbral de proximidad de 380 nm establecido en función de la precisión del sistema de detección. Esta cifra ha sido modificada a partir de Monteiro-Cardoso et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas del complejo ORP5-ORP8 expresado a niveles endógenos localizándose en los contactos ER-mitocondrias. (A) Serie confocal ORP5-ORP8 PLA y sus respectivas reconstituciones 3D. Barras de escala: 10 μm y 2 μm (imágenes ampliadas). (B) Cuantificación de focos de PLA ORP5-ORP8 en estrecho contacto con mitocondrias. Endo, n = 33 células, y Overexp ORP5+ORP8, n = 27 células. Los datos se presentan como media ± SEM (error estándar de la media). Esta imagen ha sido modificada a partir de Monteiro-Cardoso et al.15. (C) Cuantificación de los focos totales de ORP5-ORP8 PLA. Endo, n = 38 células, siORP5+siORP8, n = 38 células, y Overexp ORP5+ORP8, n = 35 células. Los datos se presentan como media ± SEM (error estándar de la media). Esta imagen ha sido modificada a partir de Monteiro-Cardoso et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas de las señales de PLA entre ORP5 u ORP8 con la proteína mitocondrial PTPIP51. (A) Se utilizaron series confocales para generar reconstituciones 3D y mapas de distancia para confirmar que las interacciones de ORPR5 u ORP8 PLA con PTPIP51 ocurren en contactos cercanos ER-mitocondrias. Barras de escala: 10 μm y 2 μm (imágenes ampliadas). (B) PTPIP51 imágenes confocales de inmunofluorescencia (plano focal único) en células control y HeLa tratadas con PTPIP51 dirigidas a siRNA. Barras de escala: 10 μm y 2 μm (imágenes ampliadas). (C) Imágenes confocales de PLA ORP5-PTPIP51 y ORP8-PTPIP51 en células control y HeLa tratadas con PTPIP51 diana de siRNA. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplos de reconstrucciones 3D utilizadas para localizar el complejo PLA ORP5-ORP8 en los contactos ER-PM y ER-mitocondrias-LD. (A) Imagen confocal y respectiva reconstitución 3D de una célula HeLa con ORP5-ORP8 PLA, representada por los puntos verdes, la PM marcada con PHPLCd-RFP, representada por el glóbulo rojo, y las mitocondrias marcadas con Mito-BFP, representadas por superficies azules. Imágenes a la izquierda y al centro: representación de toda la célula HeLa. Imagen derecha: representación de una región ampliada dentro de la celda. (B) Imagen confocal y respectiva reconstitución 3D de una región ampliada de una célula HeLa con ORP5-ORP8 PLA, representada por los puntos verdes, LD marcados con mCherry-PLN1, representados por las superficies rojas, y Mito-BFP, representado por las superficies azules. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo fue diseñado para identificar y cuantificar las interacciones de PLA entre las proteínas de los orgánulos en los SQM, en particular en los MERCS. La novedad del protocolo es que combina el PLA con el marcaje de múltiples orgánulos, la microscopía confocal y el análisis de imágenes 3D para localizar y cuantificar las interacciones del PLA entre dos proteínas que residen en la misma membrana, en este caso dentro de la membrana del RE en estrecha proximidad con la membrana de las mitocondrias (MAM) o con el MAM y las LD simultáneamente. Este protocolo se puede utilizar como una herramienta para validar proteínas que potencialmente se localizan en MERCS específicos, pero también en otros MCS.
Desde su desarrollo en 2006, el PLA entre un RE y una proteína mitocondrial ha sido ampliamente utilizado para cuantificar los MERCS 7,9,10,11. Sin embargo, el uso de PLA como indicador de la abundancia de MERCS en las células debe verificarse cuidadosamente mediante enfoques de alta resolución. Por ejemplo, la ablación de SAM50, una proteína mitocondrial que no afecta a la abundancia de MERCS (cuantificada por microscopía electrónica)15, tampoco altera las interacciones de PLA entre la proteína RE ORP8 y la proteína mitocondrial TOM20, pero reduce las interacciones de PLA entre ORP8 y la proteína mitocondrial Metaxin2 sin reducir sus niveles de expresión 15. Estos resultados reflejan que las interacciones de PLA pueden ser específicas para el par de proteínas utilizadas en el ensayo y no pueden utilizarse como único parámetro para evaluar la abundancia de MERCS.
No obstante, el PLA es un enfoque sensible comprobado para detectar interacciones de proteínas endógenas in situ . A diferencia de otros métodos de detección basados en sondas fluorescentes, como el GFP dividido y el FRET, o los enfoques de imagen de alta resolución, el PLA no requiere la sobreexpresión de proteínas marcadas, evitando artefactos experimentales inherentes, como la alteración de las propiedades físicas de los orgánulos diana15. La detección de interacciones proteicas mediante PLA también ofrece ventajas en relación con otros métodos de inmunodetección, como la coinmunoprecipitación con Western blot. Mientras que el PLA permite la cuantificación de puntos de fluorescencia individuales a nivel de una sola célula, la coinmunoprecipitación requiere una gran cantidad de material biológico y solo permite la cuantificación relativa de la proteína extraída de un conjunto de células heterogéneas, para las cuales es difícil obtener un control de carga adecuado15. La ventaja adicional del uso de PLA combinado con la tinción de orgánulos y la microscopía confocal sobre la coinmunoprecipitación es que el primer enfoque permite la localización de las interacciones proteicas a nivel subcelular.
Por otro lado, los principales inconvenientes de este protocolo están asociados con el rango de detección de PLA de unos 40 nm, que es mayor que el de los MERCS, y con la resolución máxima alcanzada por la microscopía confocal de unos 250 nm, lo que dificulta la identificación inequívoca de los sitios de contacto. Sin embargo, aquí, se utilizó un umbral de 380 nm para estimar los puntos de PLA asociados con las superficies de las mitocondrias en función del tamaño de la reacción de PLA, incluida la asociación de los anticuerpos primarios y secundarios (30 nm) más la mitad del FWHM de las señales de amplificación de PLA (350 nm). Otra limitación del PLA está relacionada con el hecho de que solo puede ser utilizado en muestras fijas, y la adquisición de una señal de PLA distinta, específica y cuantificable requiere la disponibilidad de anticuerpos altamente específicos para la proteína de interés15. Además, el análisis de imágenes 3D para la estimación de distancias requiere un software específico que puede no estar disponible en todos los laboratorios.
En particular, algunas de las desventajas mencionadas anteriormente pueden abordarse mediante el uso de tecnologías disponibles recientemente. Por ejemplo, la microscopía confocal convencional puede ser sustituida por técnicas de imagen a un nivel de resolución más alto, como Airyscan o la microscopía iluminada estructurada (SIM)17, y la falta de buenos anticuerpos primarios para las proteínas de interés puede superarse marcando de forma estable las proteínas endógenas utilizando la tecnología CRISPR-Cas918. Por último, la calidad y especificidad de los anticuerpos y las señales de PLA pueden verificarse mediante el uso de los siguientes controles: 1) probando los anticuerpos primarios mediante inmunofluorescencia y Western blot en células control y en células en las que la proteína de interés se ha agotado o sobreexpresado; 2) realizar PLA en células en las que se han agotado una o ambas proteínas de interés; 3) realizar PLA en células co-sobreexpresando las proteínas de interés; 4) realizar PLA omitiendo ambos anticuerpos para las proteínas de interés; 5) realizar PLA utilizando solo uno de los dos anticuerpos para las proteínas de interés; 6) realizar PLA con incubación con la misma IgG que la especie a partir de la cual se generaron los anticuerpos primarios. Para evaluar su especificidad, los anticuerpos utilizados en este protocolo se probaron mediante inmunofluorescencia y western blot en células control y en células tratadas con siRNA dirigido a ORP5 15, ORP8 15 o PTPIP51 (Figura 3B y Guyard et al.17). Además, se ha evaluado la especificidad anti-ORP5 y anti-ORP8 en células que expresan ORP5 u ORP8 marcados con EGFP mediante la evaluación del coeficiente de Pearson entre la señal de detección de anticuerpos y la señal EGFP15. Las especificidades de los anticuerpos anti-ORP5 15, anti-ORP815 y anti-PTPIP51 (Figura 1 y Figura 3C) se analizaron más a fondo en células en las que estas proteínas estaban agotadas, lo que condujo a una disminución de las señales de PLA. Cabe destacar que la concentración de anticuerpos que es adecuada para la tinción de inmunofluorescencia suele ser también adecuada para el PLA; sin embargo, dependiendo de los anticuerpos utilizados, se pueden realizar algunos ajustes en la solución de bloqueo y/o en las concentraciones de anticuerpos para mejorar la tinción de PLA. La tinción de PLA de ORP5-ORP8 y ORP8-PTPIP51 mejoró después de ajustar la solución de bloqueo. Para obtener tinciones mitocondriales y PLA de alta calidad, es esencial obtener imágenes confocales de alta calidad con señales de fondo bajas, que son importantes para facilitar la modulación 3D. Por ejemplo, las imágenes confocales con un alto fondo afectan a los ajustes del umbral y, en consecuencia, afectan a la precisión de la modulación 3D de la red mitocondrial o PLA.
En conclusión, el protocolo aquí presentado permite la localización y cuantificación de las interacciones de la proteína PLA en subdominios MERCS específicos (interacciones entre proteínas localizadas en cis dentro de la misma membrana involucrada en MCS o entre proteínas localizadas en trans dentro de las membranas yuxtapuestas) mediante el uso de etiquetado de orgánulos multicelulares y la generación de mapas de distancia en imágenes confocales reconstruidas en 3D. Aunque los procedimientos aquí descritos son técnicamente simples y relativamente rápidos en comparación con otras metodologías para detectar interacciones proteicas en MERCS, los datos obtenidos son altamente reproducibles. Además, este protocolo es tan versátil como los anticuerpos disponibles para las proteínas de interés y como los marcadores disponibles para teñir los orgánulos. Por lo tanto, se puede aplicar a una amplia gama de pares de proteínas y varios orgánulos y MCS.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de la ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), el Programa ATIP-Avenir, la Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) y la Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), la I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Ciencias de las Plantas Saclay).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 | Agar Scientific | L46R13-15 | |
| CMXRos red MitoTracker | Invitrogen | M7512 | red mitochondrial marker |
| Confocal inverted microscope SP8-X | Leica | DMI 6000 | |
| Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates | Merck | CLS3526 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 51985026 | serum free medium |
| Imaris software v 9.3 | Bitplane | N/A | cell imaging software |
| Incubator UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) | Knittel Glass | ||
| mouse anti-ORP8 | Santa Cruz | 134409 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| rabbit anti-ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free | Invitrogen | 10977-035 |
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