Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

إصابة الرباط الصليبي الأمامي الناجم عن الانضغاط (ACL) غير الغازية والتصوير في الجسم الحي لنشاط الأنزيم البروتيني في الفئران

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65249
Automatic Translation
1, 1
1Lawrence J. Ellison Musculoskeletal Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of California Davis Health

Summary

تعد إصابة الرباط الصليبي الأمامي غير الغازية طريقة موثوقة وذات صلة سريريا لبدء هشاشة العظام بعد الصدمة (PTOA) في الفئران. تسمح طريقة الإصابة هذه أيضا بالقياس الكمي في الجسم الحي لنشاط الأنزيم البروتيني في المفصل في نقاط زمنية مبكرة بعد الإصابة باستخدام مجسات الأشعة تحت الحمراء القريبة القابلة للتنشيط بالبروتياز وتصوير انعكاس التألق.

Abstract

عادة ما تؤدي إصابات المفاصل الرضحية مثل تمزق الرباط الصليبي الأمامي (ACL) أو تمزق الغضروف المفصلي إلى هشاشة العظام بعد الصدمة (PTOA) في غضون 10-20 سنة بعد الإصابة. يعد فهم العمليات البيولوجية المبكرة التي بدأتها إصابات المفاصل (على سبيل المثال ، الالتهاب ، والبروتينات المعدنية المصفوفة (MMPs) ، وبروتياز الكاثيبسين ، وارتشاف العظام) أمرا بالغ الأهمية لفهم مسببات PTOA. ومع ذلك ، هناك خيارات قليلة لقياس هذه العمليات البيولوجية في الجسم الحي ، وقد يتم الخلط بين الاستجابات البيولوجية المبكرة إذا تم استخدام التقنيات الجراحية الغازية أو الحقن لبدء الزراعة العضوية. في دراساتنا ل PTOA، استخدمنا مجسات قابلة للتنشيط للبروتياز بالقرب من الأشعة تحت الحمراء المتاحة تجاريا جنبا إلى جنب مع تصوير انعكاس التألق (FRI) لتحديد نشاط الأنزيم البروتيني في الجسم الحي بعد إصابة الرباط الصليبي الأمامي غير الغازية الناجمة عن الضغط في الفئران. تلخص طريقة إصابة الرباط الصليبي الأمامي غير الغازية هذه عن كثب حالات الإصابة ذات الصلة سريريا وهي معقمة تماما لأنها لا تنطوي على تعطيل الجلد أو كبسولة المفصل. يسمح لنا الجمع بين هذه الإصابات وطرق التصوير بدراسة المسار الزمني لنشاط الأنزيم البروتيني في نقاط زمنية متعددة بعد إصابة المفصل الرضحية.

Introduction

هشاشة العظام هي مشكلة صحية منتشرة تؤثر على ملايين الأشخاص في الولايات المتحدة1. هشاشة العظام بعد الصدمة (PTOA) هي مجموعة فرعية من هشاشة العظام التي تبدأ بإصابة مشتركة مثل تمزق الرباط الصليبي الأمامي (ACL) أو إصابة الغضروف المفصلي أو الكسر داخل المفصل2. تبلغ نسبة مرضى هشاشة العظام الذين تظهر عليهم الأعراض والتي يمكن تصنيفها على أنها PTOA 12٪ على الأقل 3 ، وتؤثر هذه المسببات عادة على السكان الأصغر سنا من OA4 مجهول السبب. تعد نماذج الفئران من الزراعة العضوية أدوات حاسمة للتحقيق في مسببات الأمراض وعلاجات الزراعة العضوية المحتملة في جدول زمني أقصر بكثير (4-12 أسبوعا في نماذج الفئران مقارنة ب 10-20 عاما في البشر). ومع ذلك ، فإن طرق بدء هشاشة العظام في الفئران تتضمن عادة تقنيات جراحية غازية مثل استئصال الرباط الصليبي الأمامي5،6 ، أو إزالة أو زعزعة استقرار الغضروف المفصليالإنسي 5،7،8،9،10،11،12،13،14،15،16 ، أو مزيج من الاثنين17،18،19 ، والتي لا تعيد إنتاج حالات الإصابة ذات الصلة سريريا. تؤدي النماذج الجراحية أيضا إلى تفاقم الالتهاب في المفصل بسبب اضطراب كبسولة المفصل ، مما قد يسرع من تطور هشاشة العظام.

توفر نماذج الفئران غير الغازية لإصابة الركبة الفرصة لدراسة التغيرات البيولوجية والميكانيكية الحيوية في نقاط زمنية مبكرة بعد الإصابة وقد تسفر عن نتائج أكثر صلة سريريا20. أنشأ مختبرنا نموذجا غير جراحي للإصابات يستخدم ضغطا زائدا واحدا مطبقا خارجيا لإحداث تمزق في الرباط الصليبي الأمامي (ACL) في الفئران21،22،23،24. طريقة الإصابة غير الغازية هذه قادرة على إنتاج إصابة معقمة في المفصل دون تعطيل الجلد أو كبسولة المفصل.

تصوير انعكاس التألق (FRI) هو طريقة تصوير بصري تتضمن إثارة هدف بضوء الأشعة تحت الحمراء بطول موجي محدد وتحديد كمية الضوء المنعكس المنبعث عند طول موجي آخر. يمكن حقن مجسات خاصة بالبروتياز المتاحة تجاريا في النماذج الحيوانية ويمكن بعد ذلك استخدام FRI لتحديد نشاط الأنزيم البروتيني في مواقع محددة مثل مفصل الركبة. تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع للكشف في الجسم الحي عن الأنشطة البيولوجية مثل الالتهاب. يتم إخماد المجسات المستخدمة لهذا التطبيق بشكل فلوري حتى تواجه البروتياز ذات الصلة. ستقوم هذه البروتياز بعد ذلك بكسر موقع انشقاق الإنزيم على المجسات ، وبعد ذلك ستنتج إشارة فلورية قريبة من الأشعة تحت الحمراء. تم التحقق من صحة هذه المجسات وطريقة التصوير هذه على نطاق واسع واستخدامها في دراسات السرطان25،26،27،28 وتصلب الشرايين29،30،31،32 ، وقد استخدمتها مجموعتنا لدراسات الجهاز العضلي الهيكلي لقياس علامات الالتهاب وتدهور المصفوفة23،24،33.

معا ، توفر إصابة المفاصل غير الغازية جنبا إلى جنب مع مجسات FRI في الجسم الحي والمجسات القابلة للتنشيط البروتيني قدرة فريدة على تتبع الالتهاب ونشاط الأنزيم البروتيني بعد إصابة المفاصل المؤلمة. يمكن إجراء هذا التحليل في وقت مبكر من ساعات أو حتى دقائق بعد الإصابة ، ويمكن تقييم نفس عدة مرات لدراسة المسار الزمني لنشاط البروتياز في المفصل. الأهم من ذلك ، قد لا تكون طريقة التصوير هذه ممكنة عند دمجها مع النماذج الجراحية ل OA ، لأن اضطراب الجلد وكبسولة المفصل يؤدي إلى إشارة مضان من شأنها أن تربك الإشارة من داخل المفصل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في جامعة كاليفورنيا ديفيس. تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 3 أشهر في الدراسة الحالية.

1. إصابة الرباط الصليبي الأمامي غير الغازية

ملاحظة: إصابة الرباط الصليبي الأمامي الناتجة عن حمل ضغط مطبق خارجيا هي طريقة بسيطة وقابلة للتكرار تلخص عن كثب حالات إصابة الرباط الصليبي الأمامي لدى البشر. تمت كتابة هذا البروتوكول لأداة إطار تحميل متاحة تجاريا (انظر جدول المواد) ، ولكن يمكن تكييفها لأنظمة مماثلة.

  1. افتح البرنامج المتوافق مع أداة إطار التحميل (انظر جدول المواد) وحدد ملف تحكم موجود أو أنشئ ملفا جديدا.
  2. قم بتشغيل قوة المشغل.
  3. في قائمة المعايرة ، قم بقراءة القوة لخلية التحميل واضبط إزاحة المشغل على 0.
  4. استخدم 1٪ -4٪ إيزوفلوران مستنشق في الأكسجين لتخدير الفئران والتأكد من تخدير بالكامل عن طريق قرصة إصبع القدم و / أو قرصة الذيل.
  5. ضع الماوس في وضع الانبطاح على المنصة. ضع الجزء السفلي من الساق عموديا بين تركيبتي تحميل (الشكل 1) (انظر جدول المواد). ضع القدم في فتحة المباراة العلوية والركبة في كوب المباراة السفلية.
  6. اضبط ارتفاع التركيبات السفلية يدويا لتطبيق تحميل مسبق من 1-2 نيوتن (يتم مراقبته في الوقت الفعلي على شاشة الكمبيوتر) وشد المسمار اللولبي لتثبيت الموضع. التحميل المسبق ضروري لتثبيت الساق في الموضع الصحيح قبل تطبيق حمل الإصابة.
  7. قم بتطبيق حمل ضغط واحد على قوة مستهدفة (~ 12-15 نيوتن) أو إزاحة مستهدفة (~ 1.5-2.0 مم).
    ملاحظة: سيوفر تطبيق الحمل بمعدل تحميل أبطأ (~ 1 مم / ثانية) مستوى أكبر من المراقبة والتحكم في الوقت الفعلي ولكن من المحتمل أن يؤدي إلى فشل قلع في ACL. من المرجح أن يؤدي تطبيق معدل تحميل أسرع (~ 200 مم / ثانية) إلى إصابة الرباط الصليبي الأمامي متوسطة المادة22. إذا تم تحديد حدوث كسر في الظنبوب أو إصابة مفرطة أخرى ، فقم بالقتل الرحيم للحيوان باستخدام طريقة معتمدة من IACUC قبل تعافي من التخدير.
    1. اضبط معدل التحميل في ملف التحكم في البرنامج وقم بالتأكيد باستخدام بيانات إزاحة القوة.
      ملاحظة: عادة لا يكون كسر العظام أثناء تحميل ضغط الظنبوب مصدر قلق لأن قوة الكسر (~ 20 نيوتن) أعلى بكثير من قوة إصابة الرباط الصليبي الأمامي. ومع ذلك ، يجب مراقبة ذلك بالجس ، ويمكن استخدام التصوير (أي الأشعة السينية) للتأكد من عدم حدوث كسور في الظنبوب.
  8. يشار إلى الإصابة عادة بصوت ("نقرة" أو "أزمة") وإطلاق قوة يمكن التعرف عليه في مخططات إزاحة القوة (الشكل 1C). إذا تم استخدام معدل تحميل أبطأ ، فقم بإيقاف الحمل الضاغط فورا بعد الإصابة لمنع المزيد من التحميل والضرر المحتمل لأنسجة المفاصل الأخرى.
    ملاحظة: تحدث إصابة الرباط الصليبي الأمامي عادة عند 8-15 نيوتن اعتمادا على كتلة الجسم34. من المهم تحديد قوة مستهدفة أكبر من قوة إصابة الرباط الصليبي الأمامي المتوقعة.
  9. قم بتأكيد إصابة الرباط الصليبي الأمامي باستخدام اختبار الدرج الأمامي الخلفي35,36 أو تقييم مماثل لعدم استقرار المفصل.
  10. تطبيق جرعة تعتمد على وزن (على سبيل المثال، 0.05-0.1 ملغم/كغ من البوبرينورفين، انظر جدول المواد) للفئران بعد الإصابة، مع المدة والجرعة على النحو الموصى به والمعتمد من قبل المؤسسة المحلية IACUC.
    ملاحظة: قد تغير مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية تطور PTOA بعد الإصابة ، لذلك لا يوصى باستخدام مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية لإدارة الألم في نموذج الإصابة هذا ما لم يكن هدفا محددا للدراسة.

2. إعداد لتصوير FRI

ملاحظة: بالنسبة للتصوير البصري ، فإن فراء (خاصة الفراء الداكن) فعال للغاية في حجب الضوء وامتصاصه وتشتيته ، لذلك يجب إزالة الفراء قدر الإمكان من المنطقة المحيطة بمفاصل الركبة قبل التصوير. عادة ما يكون كريم مزيل الشعر أكثر فعالية لإزالة الفراء من كليبرز . الفئران العارية أو الخالية من الشعر لا تتطلب إزالة الفراء. ومع ذلك ، فإن إزالة الفراء ضرورية لسلالات الفئران الأكثر استخداما (على سبيل المثال ، C57BL / 6). إذا أمكن ، قم بإطعام الفئران بطعام منقى منخفض التألق قبل التصوير. يحتوي تشاو الفأر القياسي على الكلوروفيل ، الذي يتألق تلقائيا بطول موجي يبلغ حوالي 700 نانومتر وقد يؤثر على جمع البيانات من نظام FRI القريب من الأشعة تحت الحمراء.

  1. تخدير الفئران مع 1 ٪ -4 ٪ استنشاق isoflurane في الأكسجين. إبقاء الفئران على وسادة التدفئة قدر الإمكان وتطبيق مرهم العين لمنع تهيج العينين.
  2. استخدم قطعة قطن لتطبيق كريم مزيل الشعر (انظر جدول المواد) على الجانب الأمامي (الجمجمة) من أرجل الفئران حول مفصل الركبة.
  3. دع الكريم يقف لمدة ~ 1 دقيقة ، ثم استخدم المناديل لإزالة الكريم والفراء من الساق. كرر إذا لزم الأمر.
  4. بمجرد انكشاف مفاصل الركبة بالكامل دون أي فرو يغطي المنطقة ، نظف الساقين بمناديل كحولية لإزالة أي كريم مزيل شعر متبقي.
    ملاحظة: يمكن استخدام كريم مزيل الشعر على نفس الفئران عدة مرات خلال الدراسة ، ولكن يجب أن تكون هذه التطبيقات على بعد أسبوع واحد على الأقل لمنع تهيج الجلد غير الضروري.

3. إعداد حل التحقيق

  1. إذا لزم الأمر ، قم بتخفيف المسبار القابل للتنشيط الفلوري وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في محلول ملحي معقم 1x مخزن بالفوسفات (PBS). تحتوي قارورة واحدة من المسبار المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) عادة على 20 نانومول في 0.15 مل من 1x PBS. لتخفيف المحلول في القارورة ، أضف 1.35 مل من 1x PBS لعمل 20 نانومول في 1.5 مل من 1x PBS.
    ملاحظة: بعد التخفيف ، يمكن استخدام قارورة واحدة لتصوير عشرة فئران عند حقن 0.15 مل لكل فأر.
  2. دوامة الحل مع الحد الأدنى من السرعة (~ 2000 دورة في الدقيقة) لمدة 30 ثانية لضمان أن يتم إذابة المسبار في الحل ، ثم أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لضمان أن كل السائل خارج الغطاء.
    ملاحظة: يمكن تخزين المحلول في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية في مكان محمي من الضوء لمدة تصل إلى 12 شهرا.

4. الحقن المداري الرجعي

ملاحظة: ارجع إلى Yardeni et al. فيما يتعلق بتفاصيل هذا الإجراء37.

  1. استخدم 1٪ -4٪ إيزوفلوران مستنشق في الأكسجين لتخدير الفئران ووضع الماوس على جانبه مع الخطم في مخروط الأنف.
  2. استخدم محاقن الأنسولين ~ 29 G لحقن محلول المسبار (أعدت في الخطوة 3).
  3. حافظ على تغطية المحقنة قبل الاستخدام لمنع التعرض للضوء.
  4. عند إعطاء الحقن:
    1. الحقن في داخل العين (القرنية الدمعية) ، وتأكد من أن شطبة المحقنة مائلة نحو العين. بالنسبة للأشخاص الذين يستخدمون اليد اليمنى ، يوصى بالحقن في العين اليمنى للماوس مع مواجهة لليمين.
    2. باستخدام اليد غير المحقونة ، اسحب الجلد حول العين برفق لتثبيت الرأس والتسبب في بروز العين.
    3. زاوية المحقنة موازية لجسم الماوس.
    4. تقدم المحقنة برفق عبر العين حتى تواجه مقاومة صلبة ؛ لا تحاول تجاوز هذه النقطة.
    5. قم بحقن محلول المسبار ببطء في الجيب الحجاجي الخلفي ، ثم اسحب الإبرة ببطء من مقبس العين. إذا لم يخرج أي محلول بالإبرة ، يكون الحقن ناجحا.
    6. ضع محلول ملحي أو مرهم للعين على العين المحقونة.
      ملاحظة: استنادا إلى الوثائق المقدمة مع مجسات التصوير ، يكون وقت التصوير الأمثل عادة ما بين 1 و 2 أيام بعد حقن محلول المسبار. إذا أمكن ، يوصى بإجراء فحص أولي لتحديد وقت التصوير الأمثل لكل تطبيق محدد. ستقوم الفئران باستقلاب المسبار المحقون في غضون 7 أيام تقريبا ، وبعد ذلك ستحتاج إلى حقن جرعة جديدة من محلول المسبار إذا كانت هناك حاجة إلى نقاط زمنية إضافية.

5. تصوير انعكاس مضان

ملاحظة: الإجراءات الواردة في هذا القسم خاصة بنظام التصوير البصري المتاح تجاريا (انظر جدول المواد). يمكن إجراء تصوير مماثل باستخدام أنظمة مماثلة.

  1. تخدير الفئران بنسبة 1٪ -4٪ من الأيزوفلوران المستنشق في الأكسجين ووضع مستلق في نظام التصوير مع الخطم في مخروط الأنف.
  2. ضع الماوس مع تمديد أسفل الساقين بحيث يتم توجيه الركبتين قليلا في الهواء (قد يكون من الضروري وضع شريط على القدمين). من الأهمية بمكان استخدام وضع ثابت لجميع.
  3. افتح البرنامج المتوافق (انظر جدول المواد) على كمبيوتر نظام التصوير ؛ ستظهر "لوحة التحكم في الاستحواذ".
  4. لتسخين النظام ، انقر فوق تهيئة وانتظر حتى يتحول ضوء درجة الحرارة إلى اللون الأخضر.
  5. انقر فوق معالج التصوير ، وتأكد من ظهور نافذة "معالج التصوير".
  6. انقر فوق تصفية الزوج ، وتأكد من أن الإعداد على "إضاءة Epi-Illumination" ، ثم اضغط على التالي.
  7. لتحديد إعدادات الإثارة / الانبعاث الصحيحة ، ابحث عن مسبار الاهتمام من القائمة المنسدلة. إذا لم يتمكن المرء من العثور على المسبار الصحيح ، فابحث عن الاسم "Input Ex / Em" واكتب يدويا قيمة ذروة الإثارة وذروة الانبعاث بناء على خاصية المسبار الذي سيتم استخدامه (على سبيل المثال ، لذروة الإثارة ، أدخل 675 ، ولذروة الانبعاث ، أدخل 720). انقر فوق التالي.
  8. اختر الماوس ل "موضوع التصوير". في "معلمات التعريض الضوئي" ، تأكد من تحديد الإعدادات التلقائية ، وتحديد خيارات الفلورسنت والصورة الفوتوغرافية. حدد D-22.6 سم في قائمة التحقق من "مجال الرؤية". اضغط على التالي.
  9. يمكن رؤية إعداد التصوير وتعديله على اللوحة اليمنى من "لوحة التحكم في الاستحواذ". تأكد من صحة جميع الإعدادات، واضغط على الزر Acquisition Sequence . بعد ظهور الصورة ، تأكد من أن الصورة بها تعرض كاف. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتغيير إعداد وقت التعرض وانقر فوق الحصول على تسلسل مرة أخرى.
  10. لتحليل الصورة ، ضع دائرة منطقة الاهتمام (ROI) بحجم ثابت فوق كل مفصل ركبة على الصورة بالأبيض والأسود (وهذا يمنع تحديد المواقع المتحيزة بناء على مناطق إشارة الفلورسنت).
  11. احسب الكفاءة الإشعاعية الكلية و / أو متوسط الكفاءة المشعة لكل مفصل ركبة. إذا تم حساب الكفاءة المشعة أيضا على الأرجل المقابلة ، فقم بتطبيع البيانات بقسمة قياس الكفاءة المشعة للساق المصابة على قياس الكفاءة المشعة للساق المقابلة.
    ملاحظة: إذا تم استخدام منطقة ذات أهمية ذات مساحة ثابتة لجميع الركبتين ، فإن كلا من الكفاءة الإشعاعية الكلية ومتوسط الكفاءة الإشعاعية سيسفر عن نتائج مماثلة. يوصى باستخدام متوسط الكفاءة المشعة إذا تم استخدام مناطق الاهتمام بأحجام مختلفة. سيوفر تطبيع بيانات الكفاءة المشعة من المفصل المصاب مع البيانات من الركبة المقابلة غير المصابة تحكما داخليا لحساب أي اختلافات في كمية المسبار المحقون وكفاءة التوصيل بين المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد تطبيق قوة ضغط واحدة (1 مم / ثانية حتى الإصابة) على أسفل الساقين لذكور الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 3 أشهر ، تم إحداث إصابة الرباط الصليبي الأمامي باستمرار في جميع الفئران. كان متوسط قوة الضغط عند إصابة الركبة حوالي 10 نيوتن (الشكل 1).

أظهر تحليل FRI نشاطا أكبر بكثير للبروتياز في المفاصل المصابة للفئران المعرضة لإصابة الرباط الصليبي الأمامي غير الغازية في 7 أيام بعد الإصابة (الشكل 2). كما تم إجراء تحليل FRI لمفاصل الركبة على الفئران التي خضعت لإعادة التثبيت الجراحي لمفصل الركبة مباشرة بعد إصابة الرباط الصليبي الأمامي غير الغازية ، على غرار ما تم وصفه سابقا في الفئران35،36،38. أظهر هذا التحليل إشارة فلورية أكبر بكثير في الفئران التي خضعت لجراحة إعادة الاستقرار من الفئران التي لم تخضع لعملية جراحية في كل من 2 و 4 أسابيع بعد الإصابة. تشير هذه البيانات إلى أن الإجراءات الجراحية الغازية يمكن أن تربك تحليل نشاط الأنزيم البروتيني في المفصل.

Figure 1
الشكل 1: إعداد إصابة الرباط الصليبي الأمامي غير الغازية ومخطط وقت القوة أثناء الإصابة. (أ ، ب) يتم وضع الجزء السفلي من ساق الفأر عموديا في النظام ، مع وضع الكاحل في شق من التركيبات العلوية ووضع مفصل الركبة في كوب ضحل في التركيبات السفلية. يتم تثبيت التركيبات السفلية في مكانها باستخدام برغي مثبت بعد تطبيق التحميل المسبق يدويا من 1-2 N. (C) مخطط إزاحة القوة ، والذي يظهر إصابة الرباط الصليبي الأمامي عند حوالي 9 نيوتن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تصوير انعكاس مضان للكشف عن نشاط الأنزيم البروتيني في مفاصل ركبة الفأر. (أ ، ب) صور تمثيلية للفئران غير المصابة (أ) والمصابة (ب) بعد الإصابة. (ج) متوسط الكفاءة الإشعاعية لكل من مفاصل الركبة للفئران غير المصابة والمصابة بعد أسبوع واحد من إصابة الرباط الصليبي الأمامي غير الغازية. أظهرت المفاصل المصابة متوسط كفاءة مشعة أكبر بنسبة 43٪ مقارنة بالمفاصل المقابلة والمفاصل من الفئران غير المصابة. (د) الكفاءة الإشعاعية الكلية الطبيعية (R / L) للفئران غير المصابة جراحيا والفئران المصابة التي خضعت أيضا لجراحة إعادة تثبيت المفاصل. لوحظ ~ 30٪ -80٪ كفاءة إشعاعية أكبر في المفاصل المصابة مقارنة بالمفاصل المقابلة في 1-4 أسابيع بعد الإصابة. في المقابل ، أظهرت المفاصل التي يتم تشغيلها جراحيا ~ 300٪ كفاءة مشعة أكبر في الأسبوع 4 مقارنة بالمفاصل المقابلة ، مما يشير إلى وجود تأثير مربك ملحوظ للجراحة. ** P < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أنشأ هذا البروتوكول ووصف بدقة طريقة غير جراحية قابلة للتكرار لإحداث إصابة الرباط الصليبي الأمامي في الفئران20،21،24،33. يمكن إجراء طريقة الإصابة البسيطة والفعالة هذه في بضع دقائق فقط ، مما يسهل إجراء دراسات عالية الإنتاجية ل PTOA. تلخص طريقة الإصابة هذه أيضا عن كثب حالات الإصابة ذات الصلة بإصابة الرباط الصليبي الأمامي البشري. قد تمنع الطرق الجراحية المستخدمة للحث على هشاشة العظام في الفئران استخدام طرق التصوير في الجسم الحي لقياس المسار الزمني وحجم نشاط الأنزيم البروتيني في المفصل بعد الإصابة. في المقابل ، توفر نماذج الفئران OA غير الغازية (التي تمت مراجعتها في20) جنبا إلى جنب مع FRI قدرة فريدة للتصوير في الجسم الحي لنشاط الأنزيم البروتيني في مفاصل ركبة الفأر بعد الإصابة.

الاستجابة الالتهابية بعد الإصابة مهمة للغاية في تطور الزراعة العضوية. ومع ذلك ، فإن الطرق المستخدمة لتحليل الالتهاب في المفصل عادة ما تكون باهظة الثمن وتستغرق وقتا طويلا ومدمرة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام تقنيات مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT-PCR) أو RNAseq لتحديد مجموعة واسعة من الجينات في المفاصل الكاملة أو الأنسجة الفردية أو الخلايا المفردة. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة القتل الرحيم للفئران للحصول على مفاصل الركبة المصابة وغير المصابة. لا يمكن تحليل هذه الفئران في نقاط زمنية متعددة ، مثل نقطة زمنية مبكرة أثناء ذروة استجابة الأنزيم البروتيني (أي بعد 3-14 يوما من الإصابة) ونقطة زمنية لاحقة عندما يكون OA أكثر شدة (أي بعد 4-6 أسابيع من الإصابة). في المقابل ، يوفر FRI جنبا إلى جنب مع إصابة المفاصل غير الغازية القدرة على تحليل نشاط الأنزيم البروتيني في نقاط زمنية متعددة في مفاصل الركبة للفئران في الجسم الحي39. وهذا يسمح بالتحليل الطولي لنفس الفئران ويجعل FRI نتيجة أقل تكلفة نسبيا من RT-PCR أو RNAseq. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصوير مجسات أو أهداف متعددة في وقت واحد بأطوال موجية مختلفة ، والتي يمكن أن توفر نتائج متعددة لأغراض مختلفة. لا يوفر قياس نشاط الأنزيم البروتيني في المفصل باستخدام FRI تقديرا كميا صارما لجميع العمليات الالتهابية التي تحدث أثناء تطور هشاشة العظام ، ولكن البيانات في الجسم الحي والطولية التي توفرها هذه الطريقة قد تظل مفيدة لتتبع حجم ومسار نشاط الأنزيم البروتيني الالتهابي بعد إصابة المفاصل.

يجب تسليم محلول المسبار القابل للتنشيط الفلوري المستخدم في تصوير FRI لنشاط الأنزيم البروتيني عن طريق الوريد (IV). الطرق الأكثر شيوعا لإجراء الحقن الوريدي في الفئران هي حقن الوريد الذيل والحقن الحجاجي الخلفي. غالبا ما يكون الحقن الحجاجي الخلفي أسهل في الأداء ويسهل حجم الحقن الضروري بسهولة أكبر من حقن الوريد الذيل. تشير الأدبيات أيضا إلى أن التوصيل خلف الحجاج قد يسبب ضغطا أقل على الفئران دون اختلاف في توصيل الدواء أو فعاليته مقارنة بحقن الوريد الذيلي40. تشير هذه النتائج إلى أن الحقن المداري الخلفي مناسب لحقن محلول المسبار القابل للتنشيط الفلوري لتصوير FRI.

دقة FRI منخفضة نسبيا مقارنة ببعض تقنيات التصوير الأخرى ، ولكن النتائج الكمية يمكن أن توفر معلومات كافية عن المسار الزمني وحجم استجابة الأنزيم البروتيني الالتهابي أثناء تطور OA. يتمثل أحد قيود هذه التقنية في أن التألق الذاتي للأنسجة يمكن أن يؤثر على النتائج ، ولكن يمكن حل هذه المشكلة بخطة شاملة قبل التجربة (نوع المسبار ، سلالة الفئران ، وضع ، إلخ). على عكس طرق التصوير قبل السريرية الأخرى (على سبيل المثال ، microPET ، microSPECT ، microCT ، التصوير بالرنين المغناطيسي) ، لا يمكن ترجمة FRI مباشرة إلى طريقة التصوير السريري بسبب الاختلافات الجذرية في الحجم بين الفئران والبشر لأن عمق اختراق الضوء محدود. ومع ذلك ، في الدراسات قبل السريرية باستخدام نماذج القوارض ، يكون مفصل الركبة قريبا من الجلد مع الحد الأدنى من تغطية الأنسجة الرخوة. وبالتالي ، FRI هو أداة فعالة للكشف عن نشاط الأنزيم البروتيني في مفصل الركبة من الفئران.

في الختام ، توفر إصابة الرباط الصليبي الأمامي غير الغازية طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لبدء PTOA في الفئران. تسهل طريقة الإصابة هذه أيضا استخدام المجسات القابلة للتنشيط بالبروتياز وتصوير انعكاس التألق لقياس المسار الزمني في الجسم الحي وحجم نشاط البروتياز الالتهابي في مفاصل الفئران أثناء تقدم الزراعة العضوية. يمكن أن تستخدم الدراسات المستقبلية هذه التقنيات والمجسات المتعددة القابلة للتنشيط الفلورية القريبة من الأشعة تحت الحمراء المتاحة تجاريا للتحقيق في آليات تطور الزراعة العضوية في الفئران من مختلف الأعمار والأجناس والخلفيات الوراثية أو لتقييم العلاجات المحتملة لإبطاء أو منع تطور هشاشة العظام بعد إصابة المفاصل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم البحث الوارد في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض الجهاز العضلي الهيكلي والجلد ، وهو جزء من المعاهد الوطنية للصحة ، تحت رقم الجائزة R01 AR075013.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate-Buffered Saline Tissue Protech PBS01-32R or equivalent
Air Anesthetia System Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone
Buprenorphine Analgesic post-injury 
Depilatory Cream Veet B001KYPZ4G or equivalent
Fixtures Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262 Can also use comparable optical imaging system
Kimwipes Kimberly-Clark Corporation 06-666 or equivalent
Living Image software  Perkin Elmer
Materials testing systems  TA Instruments Electroforce 3200 or equivalent
ProSense680 Perkin Elmer NEV10003 Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc.
Sterile Syringe with Needle Spectrum Chemical Mfg. Corp. 550-82231-CS Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent
Uniaxial load cell TA Instruments 20 N capacity
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc. SI-0236 or equivalent
WinTest software  TA Instruments compatible with Electroforce 3200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research (Hoboken. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  2. Carbone, A., Rodeo, S. Review of current understanding of post-traumatic osteoarthritis resulting from sports injuries. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 397-405 (2017).
  3. Thomas, A. C., Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Palmieri-Smith, R. M. Epidemiology of posttraumatic osteoarthritis. Journal of Athletic Training. 52 (6), 491-496 (2017).
  4. Wang, L. J., Zeng, N., Yan, Z. P., Li, J. T., Ni, G. X. Post-traumatic osteoarthritis following ACL injury. Arthritis Research & Therapy. 22 (1), 57 (2020).
  5. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  6. Kamekura, S. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
  7. Ma, H. L., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
  8. Malfait, A. M., et al. ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 18 (4), 572-580 (2010).
  9. Yang, S., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction. Nature Medicine. 16 (6), 687-693 (2010).
  10. Moodie, J. P., Stok, K. S., Muller, R., Vincent, T. L., Shefelbine, S. J. Multimodal imaging demonstrates concomitant changes in bone and cartilage after destabilisation of the medial meniscus and increased joint laxity. Osteoarthritis Cartilage. 19 (2), 163-170 (2011).
  11. Li, J., et al. Knockout of ADAMTS5 does not eliminate cartilage aggrecanase activity but abrogates joint fibrosis and promotes cartilage aggrecan deposition in murine osteoarthritis models. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 516-522 (2011).
  12. Shapiro, F., Glimcher, M. J. Induction of osteoarthrosis in the rabbit knee joint. Clinical Orthopaedics and Related Research. 147, 287-295 (1980).
  13. Meacock, S. C., Bodmer, J. L., Billingham, M. E. Experimental osteoarthritis in guinea-pigs. Journal of Experimental Pathology (Oxford). 71 (2), 279-293 (1990).
  14. Armstrong, S. J., Read, R. A., Ghosh, P., Wilson, D. M. Moderate exercise exacerbates the osteoarthritic lesions produced in cartilage by meniscectomy: a morphological study. Osteoarthritis Cartilage. 1 (2), 89-96 (1993).
  15. Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
  16. Wancket, L. M., et al. Anatomical localization of cartilage degradation markers in a surgically induced rat osteoarthritis model. Toxicologic Pathology. 33 (4), 484-489 (2005).
  17. Karahan, S., Kincaid, S. A., Kammermann, J. R., Wright, J. C. Evaluation of the rat stifle joint after transection of the cranial cruciate ligament and partial medial meniscectomy. Comparative Medicine. 51 (6), 504-512 (2001).
  18. Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 13 (7), 632-641 (2005).
  19. Jones, M. D., et al. In vivo microfocal computed tomography and micro-magnetic resonance imaging evaluation of antiresorptive and antiinflammatory drugs as preventive treatments of osteoarthritis in the rat. Arthritis & Rheumatology. 62 (9), 2726-2735 (2010).
  20. Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
  21. Christiansen, B. A., et al. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 20 (7), 773-782 (2012).
  22. Lockwood, K. A., Chu, B. T., Anderson, M. J., Haudenschild, D. R., Christiansen, B. A. Comparison of loading rate-dependent injury modes in a murine model of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 32 (1), 79-88 (2014).
  23. Satkunananthan, P. B., et al. In vivo fluorescence reflectance imaging of protease activity in a mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 22 (10), 1461-1469 (2014).
  24. Hsia, A. W., et al. Post-traumatic osteoarthritis progression is diminished by early mechanical unloading and anti-inflammatory treatment in mice. Osteoarthritis Cartilage. 29 (12), 1709-1719 (2021).
  25. Zhang, H., et al. Biochromoendoscopy: molecular imaging with capsule endoscopy for detection of adenomas of the GI tract. Gastrointestinal Endoscopy. 68 (3), 520-527 (2008).
  26. Gounaris, E., et al. Live imaging of cysteine-cathepsin activity reveals dynamics of focal inflammation, angiogenesis, and polyp growth. PLoS One. 3 (8), e2916 (2008).
  27. Sheth, R. A., Mahmood, U. Optical molecular imaging and its emerging role in colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (4), G807-G820 (2010).
  28. Clapper, M. L., et al. Detection of colorectal adenomas using a bioactivatable probe specific for matrix metalloproteinase activity. Neoplasia. 13 (8), 685-691 (2011).
  29. Nahrendorf, M., et al. Dual channel optical tomographic imaging of leukocyte recruitment and protease activity in the healing myocardial infarct. Circulation Research. 100 (8), 1218-1225 (2007).
  30. Jaffer, F. A., et al. Optical visualization of cathepsin K activity in atherosclerosis with a novel, protease-activatable fluorescence sensor. Circulation. 115 (17), 2292-2298 (2007).
  31. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (7), 1017-1024 (2009).
  32. Razansky, D., et al. Multispectral optoacoustic tomography of matrix metalloproteinase activity in vulnerable human carotid plaques. Molecular Imaging and Biology. 14 (3), 277-285 (2012).
  33. Hsia, A. W., et al. Osteophytes and fracture calluses share developmental milestones and are diminished by unloading. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 699-710 (2018).
  34. Blaker, C. L., Little, C. B., Clarke, E. C. Joint loads resulting in ACL rupture: Effects of age, sex, and body mass on injury load and mode of failure in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 35 (8), 1754-1763 (2017).
  35. Murata, K., et al. Controlling joint instability delays the degeneration of articular cartilage in a rat model. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 297-308 (2017).
  36. Murata, K., et al. Controlling Abnormal joint movement inhibits response of osteophyte formation. Cartilage. 9 (4), 391-401 (2018).
  37. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Laboratory Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  38. Kokubun, T., et al. Effect of changing the joint kinematics of knees with a ruptured anterior cruciate ligament on the molecular biological responses and spontaneous healing in a rat model. The American Journal of Sports Medicine. 44 (11), 2900-2910 (2016).
  39. Bhatti, F. U., et al. Characterization of non-invasively induced post-traumatic osteoarthritis in mice. Antioxidants (Basel). 11 (9), 1783 (2022).
  40. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Laboratory Animals (NY). 37 (1), 26-32 (2008).

Tags

إصابة الرباط الصليبي الأمامي (ACL) غير الغازية ، الناتجة عن الضغط ، التصوير في الجسم الحي ، نشاط الأنزيم البروتيني ، الفئران ، إصابات المفاصل الرضحية ، هشاشة العظام بعد الصدمة (PTOA) ، العمليات البيولوجية ، الالتهاب ، مصفوفة البروتينات المعدنية (MMPs) ، بروتياز الكاثيبسين ، ارتشاف العظام ، مسببات PTOA، القياس في الجسم الحي ، التقنيات الجراحية ، الحقن ، مجسات تنشيط الأنزيم البروتيني بالأشعة تحت الحمراء القريبة ، تصوير انعكاس التألق (FRI) ، قياس نشاط الأنزيم البروتيني ، إصابة الرباط الصليبي الأمامي غير الغازية الطريقة ، ظروف الإصابة ذات الصلة سريريا ، العقيم ، اضطراب الجلد ، كبسولة المفاصل
إصابة الرباط الصليبي الأمامي الناجم عن الانضغاط (ACL) غير الغازية والتصوير <em>في الجسم الحي</em> لنشاط الأنزيم البروتيني في الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, Y. Y., Christiansen, B. A.… More

Lin, Y. Y., Christiansen, B. A. Non-Invasive Compression-Induced Anterior Cruciate Ligament (ACL) Injury and In Vivo Imaging of Protease Activity in Mice. J. Vis. Exp. (199), e65249, doi:10.3791/65249 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter