Summary
פגיעה לא פולשנית ב-ACL היא שיטה אמינה ורלוונטית קלינית להתחלת דלקת מפרקים ניוונית פוסט-טראומטית (PTOA) בעכברים. שיטת פציעה זו מאפשרת גם כימות in vivo של פעילות פרוטאז במפרק בנקודות זמן מוקדמות לאחר הפציעה באמצעות פרוטאז-מופעל ליד בדיקות אינפרא אדום והדמיית החזרת פלואורסצנטיות.
Abstract
פציעות מפרקים טראומטיות כגון קרע ברצועה הצולבת הקדמית (ACL) או קרעים במיניסקוס מובילות בדרך כלל לדלקת מפרקים ניוונית פוסט-טראומטית (PTOA) תוך 10-20 שנה לאחר הפציעה. הבנת התהליכים הביולוגיים המוקדמים המופעלים על ידי פציעות מפרקים (למשל, דלקת, מטאלופרוטאזות מטריקס (MMPs), פרוטאזות קתפסין, ספיגת עצם) חיונית להבנת האטיולוגיה של PTOA. עם זאת, ישנן מעט אפשרויות למדידת in vivo של תהליכים ביולוגיים אלה, והתגובות הביולוגיות המוקדמות עשויות להיות מבולבלות אם נעשה שימוש בטכניקות כירורגיות פולשניות או זריקות כדי ליזום OA. במחקרים שלנו על PTOA, השתמשנו בבדיקות הניתנות להפעלת פרוטאז קרוב לאינפרא-אדום הזמינות באופן מסחרי בשילוב עם דימות החזרת פלואורסצנטיות (FRI) כדי לכמת את פעילות הפרוטאז in vivo לאחר פגיעת ACL לא פולשנית הנגרמת על ידי דחיסה בעכברים. שיטת פציעה ACL לא פולשנית זו מזכירה היטב מצבי פציעה רלוונטיים מבחינה קלינית והיא אספטית לחלוטין מכיוון שהיא אינה כרוכה בהפרעה לעור או לכמוסת המפרק. השילוב של פציעות אלה ושיטות הדמיה מאפשר לנו לחקור את מהלך הזמן של פעילות פרוטאז במספר נקודות זמן לאחר פגיעה טראומטית במפרקים.
Introduction
דלקת מפרקים ניוונית היא בעיה בריאותית נפוצה המשפיעה על מיליוני אנשים בארצות הברית1. דלקת מפרקים ניוונית פוסט-טראומטית (PTOA) היא תת-קבוצה של OA הנגרמת על ידי פגיעה במפרק כגון קרע ברצועה הצולבת הקדמית (ACL), פגיעה במיניסקוס או שבר תוך מפרקי2. שיעור חולי OA סימפטומטיים שניתן לסווגם כ- PTOA הוא לפחות 12%3, ואטיולוגיה זו משפיעה בדרך כלל על אוכלוסייה צעירה יותר מאשר OA4 אידיופתי. מודלים עכבריים של OA הם כלים חיוניים לחקר אטיולוגיה של מחלות וטיפולים פוטנציאליים ב- OA על ציר זמן קצר בהרבה (4-12 שבועות במודלים של עכברים בהשוואה ל- 10-20 שנים בבני אדם). עם זאת, השיטות ליזום OA בעכברים כוללות בדרך כלל טכניקות כירורגיות פולשניות כגון ACL transsection 5,6, הסרה או ערעור של המניסקוס המדיאלי 5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, או שילוב של השניים 17,18,19, שאינם משחזרים מצבי פציעה רלוונטיים מבחינה קלינית. מודלים כירורגיים גם להחמיר דלקת במפרק עקב הפרעה של קפסולת המפרק, אשר יכול להאיץ את התקדמות OA.
מודלים לא פולשניים של עכברי פציעה ברך מספקים הזדמנות לחקור שינויים ביולוגיים וביומכניים בנקודות זמן מוקדמות לאחר הפציעה ועשויים להניב תוצאות רלוונטיות יותר מבחינה קלינית20. המעבדה שלנו הקימה מודל פציעה לא פולשני המשתמש בעומס דחיסה טיביאלי חיצוני יחיד כדי לגרום לקרע ברצועה הצולבת הקדמית (ACL) בעכברים 21,22,23,24. שיטת פציעה לא פולשנית זו מסוגלת לייצר פגיעה במפרק אספטי מבלי להפריע לעור או לכמוסת המפרק.
דימות החזרת פלואורסצנטי (FRI) היא שיטת הדמיה אופטית הכוללת ריגוש מטרה עם אור אינפרא אדום באורך גל מסוים וכימות האור המוחזר באורך גל אחר. ניתן להזריק בדיקות ספציפיות לפרוטאז הזמינות באופן מסחרי למודלים של בעלי חיים, ולאחר מכן ניתן להשתמש ב-FRI כדי לכמת את פעילות הפרוטאז באתרים ספציפיים כגון מפרק הברך. שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב לזיהוי in vivo של פעילויות ביולוגיות כגון דלקת. הגשושיות המשמשות ליישום זה מרוות באופן פלואורסצנטי עד שהן נתקלות בפרוטאזות רלוונטיות. פרוטאזות אלה ישברו אתר מחשוף אנזימי על הגשושיות, ולאחר מכן הן יפיקו אות פלואורסצנטי כמעט אינפרא אדום. בדיקות אלה ושיטת הדמיה זו אומתו באופן נרחב ושימשו במחקרים על סרטן 25,26,27,28 וטרשת עורקים 29,30,31,32, והקבוצה שלנו השתמשה בהם למחקרים על מערכת השלד והשרירים כדי למדוד סמנים של דלקת ופירוק מטריקס 23,24,33.
יחד, פגיעה לא פולשנית במפרקים בשילוב עם in vivo FRI ובדיקות הניתנות להפעלה של פרוטאז מספקים יכולת ייחודית לעקוב אחר דלקת ופעילות פרוטאז לאחר פגיעה טראומטית במפרקים. ניתוח זה יכול להיעשות כבר בשעות או אפילו דקות לאחר הפציעה, וניתן להעריך את אותו בעל חיים מספר פעמים כדי ללמוד את מהלך הזמן של פעילות פרוטאז במפרק. חשוב לציין, שיטת הדמיה זו עשויה שלא להיות ישימה בשילוב עם מודלים כירורגיים של OA, שכן הפרעה בעור ובקפסולה המשותפת גורמת לאות פלואורסצנטי שיבלבל את האות מתוך המפרק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים המתוארים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קליפורניה דייוויס. עכברי C57BL/6J זכרים בני 3 חודשים שימשו במחקר הנוכחי.
1. פגיעה לא פולשנית ב-ACL
הערה: פציעת ACL הנוצרת על-ידי עומס דחיסה חיצוני היא שיטה פשוטה וניתנת לשחזור העוקבת מקרוב אחר תנאי פגיעה ב-ACL בבני אדם. פרוטוקול זה נכתב עבור מכשיר מסגרת עומס זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים), אך ניתן להתאים אותו למערכות דומות.
- פתח את התוכנה התואמת למכשיר מסגרת הטעינה (ראה טבלת חומרים) ובחר קובץ בקרה קיים או צור קובץ חדש.
- הפעל את כוחו של המפעיל.
- בתפריט הכיול, בצע את קריאת הכוח של תא העומס והגדר את התזוזה של המפעיל ל- 0.
- השתמשו באיזופלורן בשאיפה של 1%-4% בחמצן כדי להרדים את העכברים ולהבטיח שבעלי החיים מורדמים באופן מלא על ידי צביטת בוהן ו/או צביטת זנב.
- מקם את העכבר במצב נוטה על הרציף. מקמו את הרגל התחתונה במאונך בין שני גופי העמסה (איור 1) (ראו טבלת חומרים). התאימו את כף הרגל למגזרת המתקן העליון ואת הברך בכוס של המקבע התחתון.
- כוונן ידנית את גובה גוף התאורה התחתון כדי להחיל טעינה מראש של 1-2 N (מנוטר בזמן אמת על מסך המחשב) והידק את בורג הסט כדי להחזיק את העמדה. העומס המוקדם נחוץ כדי להחזיק את הרגל בתנוחה הנכונה לפני הפעלת עומס הפציעה.
- החל עומס דחיסה יחיד על כוח מטרה (~ 12-15 N) או תזוזת מטרה (~ 1.5-2.0 מ"מ).
הערה: החלת העומס בקצב העמסה איטי יותר (~ 1 מ"מ לשנייה) תספק רמה גבוהה יותר של ניטור ובקרה בזמן אמת, אך סביר להניח שתביא לכשל ביוץ של ACL. החלת קצב העמסה מהיר יותר (~ 200 מ"מ לשנייה) תהיה בעלת סיכוי גבוה יותר לגרום לפציעה ACL בחומר בינוני22. אם נקבע שבר טיביאלי או פגיעה מוגזמת אחרת התרחשו, יש להרדים את בעל החיים בשיטה שאושרה על ידי IACUC לפני שבעל החיים מתאושש מההרדמה.- הגדר את קצב הטעינה בקובץ בקרת התוכנה ואשר באמצעות נתוני עקירה בכוח.
הערה: שבר בעצם במהלך עומס דחיסה טיביאלי בדרך כלל אינו מהווה דאגה מכיוון שכוח השבר (~ 20 N) גבוה משמעותית מכוח הפציעה של ACL. עם זאת, זה צריך להיות מנוטר עם מישוש, הדמיה (כלומר, רנטגן) ניתן להשתמש כדי לאשר כי לא התרחשו שברים tibial.
- הגדר את קצב הטעינה בקובץ בקרת התוכנה ואשר באמצעות נתוני עקירה בכוח.
- פציעה מסומנת בדרך כלל באמצעות צליל ("קליק" או "מחנק") ושחרור כוח שניתן לזהות בחלקות עקירה בכוח (איור 1C). אם נעשה שימוש בקצב העמסה איטי יותר, יש להפסיק את עומס הדחיסה מיד לאחר הפציעה כדי למנוע העמסה נוספת ונזק אפשרי לרקמות מפרקים אחרות.
הערה: פציעת ACL מתרחשת בדרך כלל ב 8-15 N בהתאם למסת הגוף34. חשוב להגדיר כוח מטרה גדול יותר מכוח הפגיעה הצפוי ב-ACL. - יש לאשר את פגיעת ה-ACL באמצעות בדיקת מגירה קדמית-אחורית35,36 או הערכה דומה של חוסר יציבות במפרק.
- מתן מינון תלוי משקל בעל חיים (למשל, 0.05-0.1 מ"ג/ק"ג SC או IP של buprenorphine, ראה טבלת חומרים) לעכברים לאחר פציעה, עם משך ומינון כפי שהומלץ ואושר על ידי מוסד הבית IACUC.
הערה: NSAIDs עשויים לשנות את ההתקדמות של PTOA לאחר פציעה, ולכן לא מומלץ כי NSAIDs משמשים לניהול כאב במודל פציעה זה, אלא אם כן זו מטרה ספציפית של המחקר.
2. הכנת בעלי חיים להדמיית FRI
הערה: לצורך הדמיה אופטית, פרוות בעלי חיים (במיוחד פרווה כהה) יעילה מאוד בחסימה, ספיגה ופיזור של אור, ולכן יש להסיר את הפרווה ככל האפשר מהאזור סביב מפרקי הברכיים לפני ההדמיה. קרם אפילציה הוא בדרך כלל יעיל יותר להסרת פרווה מאשר קוצץ. עכברים עירומים או חסרי שיער אינם דורשים הסרת פרווה. עם זאת, הסרת פרווה נחוצה עבור רוב זני העכבר הנפוצים (למשל, C57BL/6). במידת האפשר, האכילו עכברים במזון מטוהר בעל פלואורסצנטיות נמוכה לפני ההדמיה. צ'או עכבר סטנדרטי מכיל כלורופיל, אשר מפליא אוטומטית באורך גל של כ-700 ננומטר ועשוי להשפיע על איסוף נתונים ממערכת FRI התת-אדומה הקרובה.
- מרדימים עכברים עם איזופלורן בשאיפה של 1%-4% בחמצן. יש לשמור עכברים על כרית חימום ככל האפשר ולמרוח משחת עיניים כדי למנוע גירוי של העיניים.
- השתמשו במקלון צמר גפן כדי למרוח קרם דפילטורי (ראו טבלת חומרים) על האספקט הקדמי (גולגולתי) של רגלי העכברים סביב מפרק הברך.
- תן לקרם לעמוד במשך ~ 1 דקות, ולאחר מכן להשתמש במגבונים כדי להסיר את הקרם והפרווה מן הרגל. חזור על הפעולה במידת הצורך.
- לאחר שמפרקי הברכיים חשופים במלואם ללא פרווה המכסה את האזור, נקו את הרגליים עם מגבוני אלכוהול כדי להסיר את שאריות קרם ההצבעה.
הערה: ניתן להשתמש בקרם Depilatory על אותם עכברים מספר פעמים במהלך המחקר, אך יישומים אלה צריכים להיות בהפרש של שבוע לפחות כדי למנוע גירוי מיותר של העור.
3. הכנת פתרון הבדיקה
- במידת הצורך, יש לדלל את הבדיקה הניתנת להפעלה פלואורסצנטית בהתאם להוראות היצרן במי מלח סטריליים חוצצים 1x פוספט (PBS). בקבוקון אחד של הגשושית הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) מכיל בדרך כלל 20 nmol ב 0.15 מ"ל של 1x PBS. כדי לדלל את התמיסה בבקבוקון, הוסף 1.35 מ"ל של 1x PBS כדי ליצור 20 nmol ב 1.5 מ"ל של 1x PBS.
הערה: לאחר דילול, בקבוקון אחד יכול לשמש כדי לצלם עשרה עכברים בעת הזרקת 0.15 מ"ל לעכבר. - מערבל את התמיסה במהירות מינימלית (~ 2000 סל"ד) במשך 30 שניות כדי להבטיח שהגשושית מומסת בתמיסה, ולאחר מכן צנטריפוגה לזמן קצר כדי להבטיח שכל הנוזלים יצאו מהמכסה.
הערה: ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 2-8°C במיקום המוגן מפני אור למשך עד 12 חודשים.
4. הזרקת רטרו-אורביטל
הערה: עיין אצל ירדני ואח' בנוגע לפרטי נוהל זה37.
- השתמשו באיזופלורן בשאיפה של 1%-4% בחמצן כדי להרדים עכברים והניחו את העכבר על צידו עם החוטם בחרוט באף.
- השתמש ~ מזרקי אינסולין 29 גרם להזרקת תמיסת בדיקה (מוכן בשלב 3).
- יש לשמור את המזרק מכוסה לפני השימוש כדי למנוע חשיפה לאור.
- בעת מתן הזריקה:
- יש להזריק בחלק הפנימי של העין (דמעות קרונקולה), ולוודא כי שיפוע המזרק הוא בזווית לכיוון העין. עבור אנשים ימניים, מומלץ להזריק לעין ימין של העכבר כאשר החיה פונה ימינה.
- עם היד שאינה מזריקה, משכו בעדינות את העור סביב העין כדי לייצב את הראש ולגרום לעין לבלוט.
- זווית המזרק במקביל לגוף העכבר.
- מקדמים בעדינות את המזרק מעבר לעין עד שהוא פוגש התנגדות נוקשה; אל תנסו לעבור את הנקודה הזו.
- הזריקו באיטיות את תמיסת הבדיקה לסינוס הרטרו-אורביטלי, ואז משכו באיטיות את המחט מארובות העין. אם לא יוצא פתרון עם המחט, ההזרקה מצליחה.
- יש למרוח מי מלח או משחת עיניים על העין המוזרקת.
הערה: בהתבסס על התיעוד המצורף לבדיקות ההדמיה, זמן ההדמיה האופטימלי הוא בדרך כלל בין יום ליומיים לאחר הזרקת תמיסת הבדיקה. במידת האפשר, מומלץ לבצע בדיקת זמן ראשונית כדי לקבוע את זמן ההדמיה האופטימלי עבור כל יישום ספציפי. עכברים יבצעו מטבוליזם של הגשושית המוזרקת תוך כ-7 ימים, ולאחר מכן יהיה צורך להזריק מנה חדשה של תמיסת בדיקה אם יש צורך בנקודות זמן נוספות.
5. הדמיית החזרה פלואורסצנטית
הערה: ההליכים בסעיף זה הם ספציפיים למערכת הדמיה אופטית הזמינה באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים). הדמיה דומה ניתן לבצע עם מערכות דומות.
- מרדימים עכברים עם איזופלורן בשאיפה של 1%-4% בחמצן ומניחים את בעל החיים בשכיבה במערכת ההדמיה עם החוטם בחרוט אף.
- מקם את העכבר עם הרגליים התחתונות מורחבות, כך הברכיים מחודדות מעט באוויר (ייתכן שיהיה צורך סרט למטה את הרגליים). זה קריטי כי מיקום עקבי משמש עבור כל בעלי החיים.
- פתח את התוכנה התואמת (ראה טבלת חומרים) במחשב מערכת ההדמיה; יופיע "לוח הבקרה של הרכישה".
- כדי לחמם את המערכת, לחץ על אתחול והמתן עד שנורית הטמפרטורה תהפוך לירוקה.
- לחץ על אשף ההדמיה, וודא שהחלון "אשף ההדמיה" יופיע.
- לחץ על Filter Pair, וודא שההגדרה היא על 'Epi-Illumination', ולאחר מכן לחץ על הבא.
- כדי לבחור את הגדרות העירור/הפליטה הנכונות, מצא את הבדיקה המעניינת מהרשימה הנפתחת. אם אינך מוצא את הבדיקה הנכונה, מצא את השם 'Input Ex/Em' והקלד ידנית את הערך של Excitation Peak ו- Emission Peak בהתבסס על התכונה של הגשושית שבה יש להשתמש (לדוגמה, עבור Excitation Peak, הזן 675, ועבור Emission Peak, הזן 720). לחץ על הבא.
- בחר עכבר עבור "נושא הדמיה". ב"פרמטרי חשיפה", ודא שההגדרות האוטומטיות מסומנות, והאפשרויות פלורסנט ותצלום נבחרו. בחר D-22.6 ס"מ ברשימת הבדיקה של "שדה ראייה". לחץ על הבא.
- ניתן לראות ולשנות את הגדרת ההדמיה בלוח הימני של "לוח הבקרה לרכישה". ודא שכל ההגדרות נכונות ולחץ על הלחצן Purchase Sequence . לאחר הופעת התמונה, ודא שלתמונה הייתה חשיפה מספקת. אם לא, שנו את הגדרת זמן החשיפה ולחצו שוב על Purchase Sequence .
- כדי לנתח את התמונה, מקם עיגול אזור עניין (ROI) עם גודל עקבי מעל כל מפרק ברך בתמונה בשחור-לבן (פעולה זו מונעת מיקום מוטה בהתבסס על אזורים של אות פלואורסצנטי).
- חישוב יעילות הקרינה הכוללת ו/או יעילות הקרינה הממוצעת עבור כל מפרק ברך. אם יעילות הקורן מחושבת גם על הרגליים הנגדיות, נרמלו את הנתונים על ידי חלוקת מדידת יעילות הקרינה עבור הרגל הפגועה במדידת יעילות הקורן של הרגל הנגדית.
הערה: אם משתמשים באזור עניין עם שטח עקבי לכל הברכיים, הן יעילות הקרינה הכוללת והן יעילות הקרינה הממוצעת יניבו תוצאות דומות. מומלץ להשתמש ביעילות קורנת ממוצעת אם נעשה שימוש באזורי עניין בגדלים שונים. נרמול נתוני יעילות הקרינה מהמפרק הפגוע עם הנתונים מהברך הנגדית שלא נפגעה יספק בקרה פנימית כדי להסביר את כל ההבדלים בכמות הבדיקה המוזרקת וביעילות המסירה בין בעלי חיים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר הפעלת כוח דחיסה יחיד (1 מ"מ לשנייה עד לפציעה) על רגליהם התחתונות של עכברי C57BL/6J זכרים בני 3 חודשים, פגיעה ACL נגרמה באופן עקבי בכל העכברים. כוח הדחיסה הממוצע בפציעת ברך היה בערך 10 N (איור 1).
ניתוח FRI הראה פעילות פרוטאז גדולה יותר באופן משמעותי במפרקים הפגועים של עכברים שנחשפו לפגיעה לא פולשנית ב-ACL לאחר 7 ימים לאחר הפציעה (איור 2). ניתוח FRI של מפרקי הברך בוצע גם בעכברים שעברו ייצוב כירורגי מחדש של מפרק הברך מיד לאחר פגיעה לא פולשנית ב- ACL, בדומה למה שתואר בעבר בחולדות 35,36,38. ניתוח זה הראה אות פלואורסצנטי גדול יותר באופן משמעותי בעכברים שעברו ניתוח ייצוב מחדש מאשר עכברים שלא עברו ניתוח הן שבועיים והן ארבעה שבועות לאחר הפציעה. נתונים אלה מצביעים על כך שהליכים כירורגיים פולשניים יכולים לבלבל את ניתוח פעילות הפרוטאז במפרק.
איור 1: מערך פציעות ACL לא פולשני ומגרש זמן כוח במהלך פציעה. (א,ב) רגלו התחתונה של העכבר ממוקמת אנכית במערכת, כאשר הקרסול ממוקם בחריץ של המקבע העליון ומפרק הברך ממוקם בכוס רדודה על המקבע התחתון. גוף התאורה התחתון ננעל במקומו באמצעות בורג קבוע לאחר הפעלה ידנית של מטען מקדים של 1-2 N. (C) Force-displacement plot, המציג פגיעת ACL בערך 9 N. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הדמיית החזרת פלואורסצנטיות המזהה פעילות פרוטאז במפרקי ברכיים של עכברים. (A,B) תמונות מייצגות של עכברים לא פצועים (A) ופצועים (B) לאחר פציעה. (C) יעילות קרינה ממוצעת של שני מפרקי הברך עבור עכברים לא פצועים ופצועים שבוע לאחר פגיעת ACL לא פולשנית. מפרקים פגועים הראו יעילות קרינה ממוצעת גבוהה ב-43% בהשוואה למפרקים ומפרקים נגדיים מעכברים שלא נפגעו. (D) יעילות קרינה כוללת מנורמלת (R/L) עבור עכברים לא פולשניים ועכברים פצועים שגם הם עברו ניתוח לייצוב מחדש של המפרקים. יעילות קרינה גבוהה יותר ~30%-80% נצפתה במפרקים פגועים בהשוואה למפרקים קונטרלטרליים לאחר 1-4 שבועות לאחר הפציעה. לעומת זאת, מפרקים שנותחו בניתוח הפגינו ~300% יעילות קורנת גבוהה יותר בשבוע 4 בהשוואה למפרקים נגדיים, מה שמרמז על השפעה מבלבלת בולטת של הניתוח. **P < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה ביסס ותיאר בקפדנות שיטה לא פולשנית הניתנת לשחזור לגרימת פגיעה ב-ACL בעכברים 20,21,24,33. שיטת פציעה פשוטה ויעילה זו יכולה להתבצע תוך דקות ספורות, מה שמאפשר מחקרים בעלי תפוקה גבוהה של PTOA. שיטת פציעה זו גם משחזרת מקרוב את מצבי הפציעה הרלוונטיים לפציעת ACL אנושית. שיטות כירורגיות המשמשות להשראת OA בעכברים עשויות למנוע את השימוש בשיטות הדמיה in vivo למדידת הזמן, מהלך ועוצמת פעילות הפרוטאז במפרק לאחר פציעה. לעומת זאת, מודלים לא פולשניים של עכברי OA (שנסקרוב-20) בשילוב עם FRI מספקים יכולת ייחודית להדמיית in vivo של פעילות פרוטאז במפרקי ברכיים של עכבר לאחר פציעה.
התגובה הדלקתית לאחר פציעה היא בעלת חשיבות קריטית בהתקדמות OA. עם זאת, השיטות המשמשות לניתוח דלקת במפרק הן בדרך כלל יקרות, גוזלות זמן והרסניות. לדוגמה, ניתן להשתמש בטכניקות כגון תגובת שרשרת פולימראז שעתוק לאחור (RT-PCR) או RNAseq כדי לכמת מגוון רחב של גנים במפרקים שלמים, רקמות בודדות או תאים בודדים. עם זאת, שיטה זו דורשת עכברים לעבור המתת חסד כדי לרכוש מפרקי ברכיים פצועים ולא פצועים. עכברים אלה אינם ניתנים לניתוח במספר נקודות זמן, כגון נקודת זמן מוקדמת במהלך תגובת שיא הפרוטאז (כלומר, 3-14 ימים לאחר הפציעה) ונקודת זמן מאוחרת יותר כאשר OA חמור יותר (כלומר, 4-6 שבועות לאחר הפציעה). לעומת זאת, FRI בשילוב עם פגיעה לא פולשנית במפרקים מספק את היכולת לנתח את פעילות הפרוטאז במספר נקודות זמן במפרקי הברכיים של עכברים in vivo39. זה מאפשר ניתוח אורך של אותם עכברים והופך את FRI לתוצאה זולה יחסית מאשר RT-PCR או RNAseq. בנוסף, ניתן לצלם גשושיות או מטרות מרובות בו זמנית באורכי גל שונים, מה שיכול לספק תוצאות מרובות למטרות שונות. מדידת פעילות פרוטאז במפרק באמצעות FRI אינה מספקת כימות קפדני של כל התהליכים הדלקתיים המתרחשים במהלך התקדמות OA, אך נתוני in vivo ואורך המסופקים על ידי שיטה זו עשויים עדיין להיות שימושיים למעקב אחר הגודל ומהלך הזמן של פעילות פרוטאז דלקתית לאחר פגיעה במפרקים.
תמיסת הבדיקה הניתנת להפעלה פלואורסצנטית המשמשת להדמיית FRI של פעילות פרוטאז חייבת להיות מועברת תוך ורידי (IV). הדרכים הנפוצות ביותר לביצוע הזרקת IV בעכברים הן הזרקת ורידים בזנב והזרקת רטרו-אורביטל. הזרקת רטרו-אורביטל לרוב קלה יותר לביצוע ומקלה על נפח ההזרקה הדרוש בקלות רבה יותר מאשר הזרקת וריד זנב. הספרות גם מצביעה על כך שהעברה רטרו-מסלולית עשויה לגרום פחות לחץ לעכברים ללא הבדל במתן תרופות או ביעילות בהשוואה להזרקת וריד זנב40. ממצאים אלה מצביעים על כך שהזרקה רטרו-אורביטלית מתאימה להזרקת תמיסת הבדיקה הניתנת להפעלה פלואורסצנטית להדמיית FRI.
הרזולוציה של FRI נמוכה יחסית לכמה טכניקות הדמיה אחרות, אך התוצאות הכמותיות יכולות לספק מידע מספיק על מהלך הזמן והעוצמה של תגובת הפרוטאז הדלקתית במהלך התקדמות OA. מגבלה של טכניקה זו היא כי autofluorescence רקמות יכול להשפיע על התוצאות, אבל בעיה זו יכולה להיפתר עם תוכנית יסודית לפני הניסוי (סוג הבדיקה, זן של עכברים, מיקום בעלי חיים, וכו '). בניגוד לשיטות הדמיה פרה-קליניות אחרות (כגון microPET, microSPECT, microCT, MRI), FRI אינו יכול להיות מתורגם ישירות לשיטת הדמיה קלינית בשל ההבדלים הדרסטיים בגודל בין עכברים לבני אדם מכיוון שעומק חדירת האור מוגבל. עם זאת, במחקרים פרה-קליניים המשתמשים במודלים של מכרסמים, מפרק הברך קרוב לעור עם כיסוי מינימלי של רקמות רכות. כתוצאה מכך, FRI הוא כלי יעיל לאיתור פעילות פרוטאז במפרק הברך של עכברים.
לסיכום, פגיעת ACL לא פולשנית מספקת שיטה פשוטה וניתנת לשחזור ליזום PTOA בעכברים. שיטת פציעה זו גם מקלה על השימוש בבדיקות הניתנות להפעלה של פרוטאז והדמיית החזרה פלואורסצנטית למדידת in vivo של מהלך הזמן והעוצמה של פעילות פרוטאז דלקתית במפרקי עכברים במהלך התקדמות OA. מחקרים עתידיים יוכלו להשתמש בטכניקות אלה ובבדיקות פלואורסצנטיות פלואורסצנטיות מרובות הזמינות באופן מסחרי כדי לחקור מנגנוני התקדמות OA בעכברים בגילאים, מינים ורקע גנטי שונים או להעריך טיפולים פוטנציאליים להאטה או מניעה של התקדמות OA לאחר פגיעה במפרקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שרירים ושלד ועור, חלק מהמכונים הלאומיים לבריאות, תחת פרס מספר R01 AR075013.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate-Buffered Saline | Tissue Protech | PBS01-32R | or equivalent |
| Air Anesthetia System | Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone | ||
| Buprenorphine | Analgesic post-injury | ||
| Depilatory Cream | Veet | B001KYPZ4G | or equivalent |
| Fixtures | Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform | ||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Can also use comparable optical imaging system |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 06-666 | or equivalent |
| Living Image software | Perkin Elmer | ||
| Materials testing systems | TA Instruments | Electroforce 3200 or equivalent | |
| ProSense680 | Perkin Elmer | NEV10003 | Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc. |
| Sterile Syringe with Needle | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | 550-82231-CS | Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent |
| Uniaxial load cell | TA Instruments | 20 N capacity | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | SI-0236 | or equivalent |
| WinTest software | TA Instruments | compatible with Electroforce 3200 |
References
- Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research (Hoboken. 68 (12), 1743-1750 (2016).
- Carbone, A., Rodeo, S. Review of current understanding of post-traumatic osteoarthritis resulting from sports injuries. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 397-405 (2017).
- Thomas, A. C., Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Palmieri-Smith, R. M.
- Wang, L. J., Zeng, N., Yan, Z. P., Li, J. T., Ni, G. X. Post-traumatic osteoarthritis following ACL injury. Arthritis Research & Therapy. 22 (1), 57 (2020).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Kamekura, S. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Ma, H. L., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Malfait, A. M., et al. ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 18 (4), 572-580 (2010).
- Yang, S., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction. Nature Medicine. 16 (6), 687-693 (2010).
- Moodie, J. P., Stok, K. S., Muller, R., Vincent, T. L., Shefelbine, S. J. Multimodal imaging demonstrates concomitant changes in bone and cartilage after destabilisation of the medial meniscus and increased joint laxity. Osteoarthritis Cartilage. 19 (2), 163-170 (2011).
- Li, J., et al. Knockout of ADAMTS5 does not eliminate cartilage aggrecanase activity but abrogates joint fibrosis and promotes cartilage aggrecan deposition in murine osteoarthritis models. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 516-522 (2011).
- Shapiro, F., Glimcher, M. J. Induction of osteoarthrosis in the rabbit knee joint. Clinical Orthopaedics and Related Research. 147, 287-295 (1980).
- Meacock, S. C., Bodmer, J. L., Billingham, M. E.
- Armstrong, S. J., Read, R. A., Ghosh, P., Wilson, D. M. Moderate exercise exacerbates the osteoarthritic lesions produced in cartilage by meniscectomy: a morphological study. Osteoarthritis Cartilage. 1 (2), 89-96 (1993).
- Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
- Wancket, L. M., et al. Anatomical localization of cartilage degradation markers in a surgically induced rat osteoarthritis model. Toxicologic Pathology. 33 (4), 484-489 (2005).
- Karahan, S., Kincaid, S. A., Kammermann, J. R., Wright, J. C. Evaluation of the rat stifle joint after transection of the cranial cruciate ligament and partial medial meniscectomy. Comparative Medicine. 51 (6), 504-512 (2001).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 13 (7), 632-641 (2005).
- Jones, M. D., et al. In vivo microfocal computed tomography and micro-magnetic resonance imaging evaluation of antiresorptive and antiinflammatory drugs as preventive treatments of osteoarthritis in the rat. Arthritis & Rheumatology. 62 (9), 2726-2735 (2010).
- Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
- Christiansen, B. A., et al. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 20 (7), 773-782 (2012).
- Lockwood, K. A., Chu, B. T., Anderson, M. J., Haudenschild, D. R., Christiansen, B. A. Comparison of loading rate-dependent injury modes in a murine model of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 32 (1), 79-88 (2014).
- Satkunananthan, P. B., et al. In vivo fluorescence reflectance imaging of protease activity in a mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 22 (10), 1461-1469 (2014).
- Hsia, A. W., et al. Post-traumatic osteoarthritis progression is diminished by early mechanical unloading and anti-inflammatory treatment in mice. Osteoarthritis Cartilage. 29 (12), 1709-1719 (2021).
- Zhang, H., et al. Biochromoendoscopy: molecular imaging with capsule endoscopy for detection of adenomas of the GI tract. Gastrointestinal Endoscopy. 68 (3), 520-527 (2008).
- Gounaris, E., et al. Live imaging of cysteine-cathepsin activity reveals dynamics of focal inflammation, angiogenesis, and polyp growth. PLoS One. 3 (8), e2916 (2008).
- Sheth, R. A., Mahmood, U. Optical molecular imaging and its emerging role in colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (4), G807-G820 (2010).
- Clapper, M. L., et al. Detection of colorectal adenomas using a bioactivatable probe specific for matrix metalloproteinase activity. Neoplasia. 13 (8), 685-691 (2011).
- Nahrendorf, M., et al. Dual channel optical tomographic imaging of leukocyte recruitment and protease activity in the healing myocardial infarct. Circulation Research. 100 (8), 1218-1225 (2007).
- Jaffer, F. A., et al. Optical visualization of cathepsin K activity in atherosclerosis with a novel, protease-activatable fluorescence sensor. Circulation. 115 (17), 2292-2298 (2007).
- Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (7), 1017-1024 (2009).
- Razansky, D., et al. Multispectral optoacoustic tomography of matrix metalloproteinase activity in vulnerable human carotid plaques. Molecular Imaging and Biology. 14 (3), 277-285 (2012).
- Hsia, A. W., et al. Osteophytes and fracture calluses share developmental milestones and are diminished by unloading. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 699-710 (2018).
- Blaker, C. L., Little, C. B., Clarke, E. C. Joint loads resulting in ACL rupture: Effects of age, sex, and body mass on injury load and mode of failure in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 35 (8), 1754-1763 (2017).
- Murata, K., et al. Controlling joint instability delays the degeneration of articular cartilage in a rat model. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 297-308 (2017).
- Murata, K., et al. Controlling Abnormal joint movement inhibits response of osteophyte formation. Cartilage. 9 (4), 391-401 (2018).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Kokubun, T., et al. Effect of changing the joint kinematics of knees with a ruptured anterior cruciate ligament on the molecular biological responses and spontaneous healing in a rat model. The American Journal of Sports Medicine. 44 (11), 2900-2910 (2016).
- Bhatti, F. U., et al. Characterization of non-invasively induced post-traumatic osteoarthritis in mice. Antioxidants (Basel). 11 (9), 1783 (2022).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Laboratory Animals (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
