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गैर-इनवेसिव संपीड़न-प्रेरित पूर्वकाल क्रूसिएट लिगामेंट (एसीएल) चोट और चूहों में प्रोटीज गतिविधि की वीवो इमेजिंग में

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65249
Automatic Translation
1, 1
1Lawrence J. Ellison Musculoskeletal Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of California Davis Health

Summary

गैर-इनवेसिव एसीएल चोट चूहों में पोस्ट-ट्रॉमैटिक ऑस्टियोआर्थराइटिस (पीटीओए) शुरू करने के लिए एक विश्वसनीय और नैदानिक रूप से प्रासंगिक तरीका है। यह चोट विधि भी प्रारंभिक समय बिंदुओं पर संयुक्त में प्रोटीज गतिविधि की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है, अवरक्त जांच और प्रतिदीप्ति परावर्तन इमेजिंग के पास प्रोटीज़-सक्रियण का उपयोग करके चोट के बाद।

Abstract

दर्दनाक संयुक्त चोटें जैसे पूर्वकाल क्रूसिएट लिगामेंट (एसीएल) टूटना या मेनिस्कस आँसू आमतौर पर चोट के बाद 10-20 वर्षों के भीतर पोस्ट-ट्रॉमैटिक ऑस्टियोआर्थराइटिस (पीटीओए) का कारण बनते हैं। पीटीओए के एटियलजि को समझने के लिए संयुक्त चोटों (जैसे, सूजन, मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनिस (एमएमपी), कैथेप्सिन प्रोटीज, हड्डी पुनरुत्थान) द्वारा शुरू की गई प्रारंभिक जैविक प्रक्रियाओं को समझना महत्वपूर्ण है। हालांकि, इन जैविक प्रक्रियाओं के विवो माप के लिए कुछ विकल्प हैं, और प्रारंभिक जैविक प्रतिक्रियाओं को भ्रमित किया जा सकता है यदि ओए शुरू करने के लिए आक्रामक सर्जिकल तकनीकों या इंजेक्शन का उपयोग किया जाता है। पीटीओए के हमारे अध्ययन में, हमने चूहों में गैर-इनवेसिव संपीड़न-प्रेरित एसीएल चोट के बाद विवो में प्रोटीज गतिविधि को निर्धारित करने के लिए प्रतिदीप्ति परावर्तन इमेजिंग (एफआरआई) के साथ संयुक्त व्यावसायिक रूप से उपलब्ध निकट-अवरक्त प्रोटीज सक्रिय जांच का उपयोग किया है। यह गैर-इनवेसिव एसीएल चोट विधि नैदानिक रूप से प्रासंगिक चोट की स्थिति को बारीकी से दोहराती है और पूरी तरह से सड़न रोकनेवाला है क्योंकि इसमें त्वचा या संयुक्त कैप्सूल को बाधित करना शामिल नहीं है। इन चोट और इमेजिंग विधियों का संयोजन हमें एक दर्दनाक संयुक्त चोट के बाद कई समय बिंदुओं पर प्रोटीज गतिविधि के समय पाठ्यक्रम का अध्ययन करने की अनुमति देता है।

Introduction

ऑस्टियोआर्थराइटिस एक व्यापक स्वास्थ्य समस्या है जोसंयुक्त राज्य अमेरिका में लाखों लोगों को प्रभावित करती है। पोस्ट-ट्रॉमैटिक ऑस्टियोआर्थराइटिस (पीटीओए) ओए का एक सबसेट है जो संयुक्त चोट जैसे पूर्वकाल क्रूसिएट लिगामेंट (एसीएल) टूटना, मेनिस्कस चोट, या इंट्रा-आर्टिकुलर फ्रैक्चर2 द्वारा शुरू किया जाता है। रोगसूचक ओए रोगियों का अनुपात जिन्हें पीटीओए के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है, कम से कम 12% 3 है, और यह एटियलजि आमतौर पर इडियोपैथिक ओए4 की तुलना में युवा आबादी को प्रभावित करता है। OA के माउस मॉडल रोग एटियलजि और संभावित OA उपचार की जांच के लिए बहुत कम समयरेखा (मनुष्यों में 10-20 वर्षों की तुलना में माउस मॉडल में 4-12 सप्ताह) के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। हालांकि, चूहों में ओए शुरू करने के तरीकों में आमतौर पर आक्रामक सर्जिकल तकनीक शामिल होती है जैसे एसीएल ट्रांससेक्शन5,6, औसत दर्जे का मेनिस्कस 5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 या दोनों का संयोजन 17,18,19, जो नैदानिक रूप से प्रासंगिक चोट की स्थिति को पुन: पेश नहीं करते हैं। सर्जिकल मॉडल संयुक्त कैप्सूल के विघटन के कारण संयुक्त में सूजन को भी बढ़ाते हैं, जो ओए प्रगति को तेज कर सकता है।

गैर-इनवेसिव घुटने की चोट माउस मॉडल चोट के बाद शुरुआती समय बिंदुओं पर जैविक और बायोमेकेनिकल परिवर्तनों का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करते हैं और अधिक नैदानिक रूप से प्रासंगिक परिणाम20 प्राप्त कर सकते हैं। हमारी प्रयोगशाला ने एक गैर-इनवेसिव चोट मॉडल स्थापित किया है जो चूहों21,22,23,24में पूर्वकाल क्रूसिएट लिगामेंट (एसीएल) टूटने को प्रेरित करने के लिए एक एकल बाहरी रूप से लागू टिबियल संपीड़न अधिभार का उपयोग करता है। यह गैर-इनवेसिव चोट विधि त्वचा या संयुक्त कैप्सूल को बाधित किए बिना एक सड़न रोकनेवाला संयुक्त चोट पैदा करने में सक्षम है।

प्रतिदीप्ति परावर्तन इमेजिंग (एफआरआई) एक ऑप्टिकल इमेजिंग विधि है जिसमें एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य पर अवरक्त प्रकाश के साथ एक लक्ष्य को रोमांचक बनाना और किसी अन्य तरंग दैर्ध्य पर उत्सर्जित परावर्तित प्रकाश की मात्रा निर्धारित करना शामिल है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीज़-विशिष्ट जांच को पशु मॉडल में इंजेक्ट किया जा सकता है और फिर एफआरआई का उपयोग घुटने के जोड़ जैसे विशिष्ट साइटों पर प्रोटीज गतिविधि को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इस पद्धति का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है विवो सूजन जैसी जैविक गतिविधियों का पता लगाने। इस एप्लिकेशन के लिए उपयोग की जाने वाली जांच फ्लोरोसेंटली को तब तक बुझाई जाती है जब तक कि वे प्रासंगिक प्रोटीज का सामना नहीं करते। वे प्रोटीज तब जांच पर एक एंजाइम दरार साइट को तोड़ देंगे, जिसके बाद वे एक निकट-अवरक्त फ्लोरोसेंट सिग्नल का उत्पादन करेंगे। इन जांच और इस इमेजिंग विधि को बड़े पैमाने पर मान्य किया गया है और कैंसर 25,26,27,28 और एथेरोस्क्लेरोसिस 29,30,31,32के अध्ययन में उपयोग किया गया है, और हमारे समूह ने उन्हें सूजन और मैट्रिक्स गिरावट 23,24,33के मार्करों को मापने के लिए मस्कुलोस्केलेटल सिस्टम के अध्ययन के लिए उपयोग किया है।

साथ में, गैर-इनवेसिव संयुक्त चोट इन विवो एफआरआई और प्रोटीज एक्टिवेबल प्रोब के साथ मिलकर एक दर्दनाक संयुक्त चोट के बाद सूजन और प्रोटीज गतिविधि को ट्रैक करने की एक अनूठी क्षमता प्रदान करती है। यह विश्लेषण चोट लगने के बाद घंटों या मिनटों के रूप में भी किया जा सकता है, और संयुक्त में प्रोटीज गतिविधि के समय पाठ्यक्रम का अध्ययन करने के लिए एक ही जानवर का कई बार मूल्यांकन किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि ओए के सर्जिकल मॉडल के साथ संयुक्त होने पर यह इमेजिंग विधि संभव नहीं हो सकती है, क्योंकि त्वचा और संयुक्त कैप्सूल के विघटन के परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति संकेत होता है जो संयुक्त के भीतर से संकेत को भ्रमित करेगा।

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Protocol

वर्णित सभी प्रक्रियाओं को कैलिफोर्निया डेविस विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है। वर्तमान अध्ययन के लिए 3 महीने के नर C57BL/6J चूहों का उपयोग किया गया था।

1. गैर-इनवेसिव एसीएल चोट

नोट: बाहरी रूप से लागू संपीड़ित भार द्वारा उत्पादित एसीएल चोट एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि है जो मनुष्यों में एसीएल चोट की स्थिति को बारीकी से पुन: प्रस्तुत करती है। यह प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लोड फ्रेम इंस्ट्रूमेंट ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए लिखा गया है, लेकिन इसे समान प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

  1. लोड फ्रेम इंस्ट्रूमेंट के साथ संगत सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें) और मौजूदा नियंत्रण फ़ाइल का चयन करें या एक नई फ़ाइल बनाएं।
  2. एक्ट्यूएटर की शक्ति चालू करें।
  3. अंशांकन मेनू में, लोड सेल के बल पढ़ने tare और 0 के लिए actuator के विस्थापन सेट.
  4. चूहों को एनेस्थेटाइज करने के लिए ऑक्सीजन में 1% -4% साँस के आइसोफ्लुरेन का उपयोग करें और सुनिश्चित करें कि जानवरों को पैर की अंगुली चुटकी और / या पूंछ चुटकी द्वारा पूरी तरह से संवेदनाहारी किया जाता है।
  5. मंच पर एक प्रवण स्थिति में माउस रखें. दो लोडिंग जुड़नार (चित्रा 1) ( सामग्री की तालिकादेखें) के बीच निचले पैर को लंबवत रखें। पैर को शीर्ष स्थिरता के कटआउट में और घुटने को नीचे की स्थिरता के कप में फिट करें।
  6. 1-2 एन (कंप्यूटर स्क्रीन पर वास्तविक समय में निगरानी) का प्रीलोड लागू करने के लिए नीचे की स्थिरता की ऊंचाई को मैन्युअल रूप से समायोजित करें और स्थिति को पकड़ने के लिए सेट स्क्रू को कस लें। चोट भार को लागू करने से पहले पैर को सही स्थिति में रखने के लिए प्रीलोड आवश्यक है।
  7. एक लक्ष्य बल (~ 12-15 एन) या लक्ष्य विस्थापन (~ 1.5-2.0 मिमी) के लिए एक एकल संपीड़न भार लागू करें।
    नोट: धीमी लोडिंग दर (~ 1 मिमी / एस) पर लोड लागू करने से वास्तविक समय की निगरानी और नियंत्रण का एक बड़ा स्तर प्रदान किया जाएगा, लेकिन संभवतः एसीएल की एवल्शन विफलता का परिणाम होगा। एक तेजी से लोड हो रहा है दर (~ 200 मिमी / एस) लागू करने के लिए एक मध्य पदार्थ एसीएल चोट22 उत्पादन करने की अधिक संभावना होगी. यदि एक टिबियल फ्रैक्चर या अन्य अत्यधिक चोट लगने का निर्धारण किया जाता है, तो संज्ञाहरण से उबरने वाले जानवर से पहले IACUC अनुमोदित विधि का उपयोग करके जानवर को इच्छामृत्यु दें।
    1. सॉफ़्टवेयर नियंत्रण फ़ाइल में लोडिंग दर सेट करें और बल-विस्थापन डेटा का उपयोग करके पुष्टि करें।
      नोट: टिबियल संपीड़न लोडिंग के दौरान अस्थि फ्रैक्चर आमतौर पर चिंता का विषय नहीं है क्योंकि फ्रैक्चर बल (~ 20 एन) एसीएल चोट बल से काफी अधिक है। हालांकि, यह पैल्पेशन के साथ निगरानी की जानी चाहिए, और इमेजिंग (यानी, एक्स-रे) का उपयोग यह पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है कि कोई टिबियल फ्रैक्चर नहीं हुआ है।
  8. चोट आम तौर पर एक ध्वनि ("क्लिक" या "क्रंच") और बल की एक रिहाई है कि बल विस्थापन भूखंडों (चित्रा 1C) पर पहचान योग्य है के साथ संकेत दिया है. यदि धीमी लोडिंग दर का उपयोग किया जाता है, तो आगे लोडिंग और अन्य संयुक्त ऊतकों को संभावित नुकसान को रोकने के लिए चोट के तुरंत बाद संपीड़ित लोड को रोकें।
    नोट: एसीएल चोट आमतौर पर शरीर द्रव्यमान34 के आधार पर 8-15 एन पर होती है। प्रत्याशित एसीएल चोट बल से अधिक लक्ष्य बल निर्धारित करना महत्वपूर्ण है।
  9. एक पूर्वकाल-पीछे दराज परीक्षण35,36 या संयुक्त अस्थिरता के तुलनीय मूल्यांकन का उपयोग कर एसीएल चोट की पुष्टि करें.
  10. एक पशु वजन-निर्भर खुराक (जैसे, 0.05-0.1 मिलीग्राम/किग्रा एससी या ब्यूप्रेनोर्फिन का आईपी, सामग्री की तालिकादेखें) को चूहों को चोट के बाद, अवधि और खुराक के साथ घर संस्थान आईएसीयूसी द्वारा अनुशंसित और अनुमोदित किया जाता है।
    नोट: एनएसएआईडी चोट के बाद पीटीओए की प्रगति को बदल सकते हैं, इसलिए यह अनुशंसित नहीं है कि एनएसएआईडी का उपयोग इस चोट मॉडल में दर्द प्रबंधन के लिए किया जाता है जब तक कि यह अध्ययन का एक विशिष्ट उद्देश्य न हो।

2. एफआरआई इमेजिंग के लिए पशु तैयारी

नोट: ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए, पशु फर (विशेष रूप से अंधेरे फर) प्रकाश को अवरुद्ध करने, अवशोषित करने और बिखरने में अत्यधिक प्रभावी है, इसलिए, इमेजिंग से पहले घुटने के जोड़ों के आसपास के क्षेत्र से जितना संभव हो उतना फर हटा दिया जाना चाहिए। एक डिपिलिटरी क्रीम आमतौर पर कतरनी की तुलना में फर हटाने के लिए अधिक प्रभावी होती है। नग्न या बाल रहित चूहों को फर हटाने की आवश्यकता नहीं होती है। हालांकि, सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले माउस उपभेदों (जैसे, C57BL/6) के लिए फर हटाना आवश्यक है। यदि संभव हो तो, इमेजिंग से पहले कम प्रतिदीप्ति शुद्ध भोजन के साथ चूहों फ़ीड. मानक माउस चाउ में क्लोरोफिल होता है, जो लगभग 700 एनएम की तरंग दैर्ध्य के साथ ऑटो-फ्लोरेसिस करता है और निकट-अवरक्त एफआरआई प्रणाली से डेटा संग्रह को प्रभावित कर सकता है।

  1. ऑक्सीजन में 1% -4% साँस isoflurane के साथ चूहों संहाहास्पद. जितना हो सके चूहों को हीटिंग पैड पर रखें और आंखों की जलन को रोकने के लिए आंखों का मरहम लगाएं।
  2. घुटने के जोड़ के आसपास चूहों के पैरों के पूर्वकाल (कपाल) पहलू पर डिपिलिटरी क्रीम ( सामग्री की तालिकादेखें) लागू करने के लिए एक कपास झाड़ू का उपयोग करें।
  3. क्रीम ~ 1 मिनट के लिए खड़े हो जाओ, तो पैर से क्रीम और फर को हटाने के लिए पोंछे का उपयोग करें. यदि आवश्यक हो तो दोहराएं।
  4. एक बार जब घुटने के जोड़ पूरी तरह से क्षेत्र को कवर किए बिना पूरी तरह से उजागर हो जाते हैं, तो किसी भी शेष डिपिलिटरी क्रीम को हटाने के लिए अल्कोहल वाइप्स के साथ पैरों को साफ करें।
    नोट: एक अध्ययन के दौरान एक ही चूहों पर कई बार डिपिलिटरी क्रीम का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन त्वचा की अनावश्यक जलन को रोकने के लिए इन अनुप्रयोगों को कम से कम एक सप्ताह अलग होना चाहिए।

3. जांच समाधान की तैयारी

  1. यदि आवश्यक हो, बाँझ 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रतिदीप्ति सक्रिय जांच पतला. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जांच की एक शीशी ( सामग्री की तालिकादेखें) में आमतौर पर 1x पीबीएस के 0.15 एमएल में 20 एनएमओएल होता है। शीशी में समाधान को पतला करने के लिए, 1x पीबीएस के 1.5 एमएल में 20 एनएमओएल बनाने के लिए 1x पीबीएस के 1.35 एमएल जोड़ें।
    नोट: कमजोर पड़ने के बाद, एक शीशी माउस प्रति 0.15 एमएल इंजेक्शन जब दस चूहों छवि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. भंवर 30 एस के लिए न्यूनतम गति (~ 2000 आरपीएम) के साथ समाधान यह सुनिश्चित करने के लिए कि जांच समाधान में भंग हो गई है, और फिर यह सुनिश्चित करने के लिए संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें कि सभी तरल ढक्कन से बाहर है।
    नोट: समाधान को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर ऐसे स्थान पर संग्रहीत किया जा सकता है जो 12 महीने तक प्रकाश से सुरक्षित रहता है।

4. रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन

नोट: इस प्रक्रिया के विवरण के बारे में यार्डेनी एट अल का संदर्भलें 37.

  1. चूहों को संवेदनाहारी करने के लिए ऑक्सीजन में 1% -4% साँस isoflurane का उपयोग करें और एक नाक शंकु में थूथन के साथ अपनी तरफ माउस जगह.
  2. जांच समाधान के इंजेक्शन के लिए ~ 29 जी इंसुलिन सीरिंज का उपयोग करें (चरण 3 में तैयार)।
  3. प्रकाश के संपर्क को रोकने के लिए उपयोग करने से पहले सिरिंज को ढक कर रखें।
  4. इंजेक्शन का प्रशासन करते समय:
    1. आंख (लैक्रिमल कारुनकुला) के अंदर इंजेक्ट करें, और सुनिश्चित करें कि सिरिंज का बेवल आंख की ओर कोण है। दाएं हाथ के लोगों के लिए, जानवर के दाईं ओर मुंह करके माउस की दाहिनी आंख में इंजेक्ट करने की सिफारिश की जाती है।
    2. गैर-इंजेक्शन वाले हाथ से, सिर को स्थिर करने और आंख को बाहर निकालने के लिए आंख के चारों ओर की त्वचा को धीरे से वापस खींचें।
    3. माउस के शरीर के समानांतर सिरिंज कोण.
    4. धीरे आंख पिछले सिरिंज अग्रिम जब तक यह कठोर प्रतिरोध को पूरा करता है; इस बिंदु से आगे बढ़ने का प्रयास न करें।
    5. धीरे-धीरे रेट्रो-ऑर्बिटल साइनस में जांच समाधान इंजेक्ट करें, फिर धीरे-धीरे सुई को आंख सॉकेट से बाहर खींचें। यदि सुई के साथ कोई समाधान नहीं निकलता है, तो इंजेक्शन सफल होता है।
    6. इंजेक्शन वाली आंख पर खारा या आंख मरहम लागू करें।
      नोट: इमेजिंग जांच के साथ प्रदान किए गए प्रलेखन के आधार पर, इष्टतम इमेजिंग समय आमतौर पर जांच समाधान के इंजेक्शन के बाद 1 और 2 दिनों के बीच होता है। यदि संभव हो तो, यह प्रत्येक विशिष्ट आवेदन के लिए इष्टतम इमेजिंग समय निर्धारित करने के लिए एक प्रारंभिक समय स्क्रीनिंग करने के लिए सिफारिश की है. चूहे लगभग 7 दिनों के भीतर इंजेक्शन जांच metabolize होगा, जिसके बाद जांच समाधान की एक नई खुराक अतिरिक्त समय अंक वांछित हैं अगर इंजेक्शन की आवश्यकता होगी.

5. प्रतिदीप्ति परावर्तन इमेजिंग

नोट: इस खंड में प्रक्रियाएं व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऑप्टिकल इमेजिंग सिस्टम ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए विशिष्ट हैं। इसी तरह की इमेजिंग तुलनीय प्रणालियों के साथ की जा सकती है।

  1. ऑक्सीजन में 1% -4% साँस isoflurane के साथ चूहों संवेदनाहारी और एक नाक शंकु में थूथन के साथ इमेजिंग प्रणाली में पशु लापरवाह जगह.
  2. नीचे पैर बढ़ाया के साथ माउस की स्थिति इतना है कि घुटनों हवा में थोड़ा इशारा कर रहे हैं (यह पैरों नीचे टेप करने के लिए आवश्यक हो सकता है). यह महत्वपूर्ण है कि सभी जानवरों के लिए एक सुसंगत स्थिति का उपयोग किया जाता है।
  3. इमेजिंग सिस्टम कंप्यूटर पर संगत सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) खोलें; "अधिग्रहण नियंत्रण कक्ष" दिखाई देगा।
  4. सिस्टम को गर्म करने के लिए, इनिशियलाइज़ करें पर क्लिक करें और तापमान की रोशनी हरी होने तक प्रतीक्षा करें।
  5. इमेजिंग विज़ार्ड पर क्लिक करें, और सुनिश्चित करें कि "इमेजिंग विज़ार्ड" विंडो दिखाई देगी।
  6. फ़िल्टर जोड़ी पर क्लिक करें, और सुनिश्चित करें कि सेटिंग 'एपि-इल्यूमिनेशन' पर है, फिर अगला दबाएं।
  7. सही उत्तेजना/उत्सर्जन सेटिंग्स का चयन करने के लिए, पुलडाउन सूची से ब्याज की जांच खोजें। यदि कोई सही जांच नहीं ढूंढ सकता है, तो 'इनपुट एक्स/एम' नाम ढूंढें और मैन्युअल रूप से उपयोग की जाने वाली जांच की संपत्ति के आधार पर उत्तेजना पीक और उत्सर्जन पीक के मूल्य में टाइप करें (उदाहरण के लिए, उत्तेजना पीक के लिए, 675 दर्ज करें, और उत्सर्जन पीक के लिए, 720 दर्ज करें)। Next पर क्लिक करें।
  8. "इमेजिंग विषय" के लिए माउस चुनें. "एक्सपोजर पैरामीटर" में, सुनिश्चित करें कि ऑटो सेटिंग्स की जाँच की गई है, और फ्लोरोसेंट और फोटोग्राफ विकल्प चुने गए हैं। "फील्ड ऑफ़ व्यू" की चेकलिस्ट में D-22.6 सेमी चुनें। अगला दबाएं।
  9. इमेजिंग सेटिंग को "अधिग्रहण नियंत्रण कक्ष" के दाहिने पैनल पर देखा और संशोधित किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि सभी सेटिंग्स सही हैं, और अनुक्रम प्राप्त करें बटन दबाएं। छवि दिखाई देने के बाद, पुष्टि करें कि छवि में पर्याप्त एक्सपोज़र था। यदि नहीं, तो एक्सपोज़र टाइम सेटिंग बदलें और फिर से एक्वायर सीक्वेंस पर क्लिक करें।
  10. छवि का विश्लेषण करने के लिए, काले और सफेद छवि पर प्रत्येक घुटने के जोड़ पर लगातार आकार के साथ ब्याज (आरओआई) सर्कल का एक क्षेत्र (आरओआई) सर्कल की स्थिति (यह फ्लोरोसेंट सिग्नल के क्षेत्रों के आधार पर पक्षपाती स्थिति को रोकता है)।
  11. प्रत्येक घुटने के जोड़ के लिए कुल उज्ज्वल दक्षता और / या औसत उज्ज्वल दक्षता की गणना करें। यदि उज्ज्वल दक्षता की गणना भी contralateral पैरों पर की जाती है, तो contralateral पैर के उज्ज्वल दक्षता माप द्वारा घायल पैर के लिए उज्ज्वल दक्षता माप को विभाजित करके डेटा को सामान्य करें।
    नोट: यदि सभी घुटनों के लिए लगातार क्षेत्र के साथ ब्याज का एक क्षेत्र उपयोग किया जाता है, तो कुल उज्ज्वल दक्षता और औसत उज्ज्वल दक्षता दोनों समान परिणाम देंगे। औसत उज्ज्वल दक्षता का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है यदि विभिन्न आकारों के साथ ब्याज के क्षेत्रों का उपयोग किया जाता है। घायल contralateral घुटने से डेटा के साथ घायल संयुक्त से उज्ज्वल दक्षता डेटा सामान्यीकरण जांच इंजेक्शन की मात्रा और विभिन्न जानवरों के बीच वितरण दक्षता में किसी भी अंतर के लिए खाते के लिए एक आंतरिक नियंत्रण प्रदान करेगा.

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Representative Results

3 महीने के पुरुष C57BL/6J चूहों के निचले पैरों पर एक एकल संपीड़ित बल (चोट तक 1 मिमी/सेकंड) लगाने के बाद, सभी चूहों में एसीएल चोट लगातार प्रेरित थी। घुटने की चोट पर औसत संपीड़न बल लगभग 10 एन (चित्रा 1) था।

एफआरआई विश्लेषण ने चोट के बाद 7 दिनों में गैर-इनवेसिव एसीएल चोट के अधीन चूहों के घायल जोड़ों में काफी अधिक प्रोटीज गतिविधि दिखाई(चित्रा 2)। घुटने के जोड़ों का एफआरआई विश्लेषण भी चूहों पर किया गया था जो गैर-इनवेसिव एसीएल चोट के तुरंत बाद घुटने के जोड़ के सर्जिकल पुनर्स्थापना से गुजरते थे, जैसा कि पहले चूहों 35,36,38में वर्णित किया गया है। इस विश्लेषण ने चूहों की तुलना में पुनर्स्थापना सर्जरी के अधीन चूहों में काफी अधिक फ्लोरोसेंट संकेत दिखाया, जिनकी चोट के बाद 2 और 4 सप्ताह दोनों में सर्जरी नहीं हुई थी। इन आंकड़ों से पता चलता है कि आक्रामक सर्जिकल प्रक्रियाएं संयुक्त में प्रोटीज गतिविधि के विश्लेषण को भ्रमित कर सकती हैं।

Figure 1
चित्रा 1: गैर-इनवेसिव एसीएल चोट सेटअप और चोट के दौरान एक बल-समय की साजिश। (ए, बी) माउस का निचला पैर सिस्टम में लंबवत स्थित होता है, जिसमें टखने को शीर्ष स्थिरता के एक पायदान में रखा जाता है और घुटने के जोड़ को नीचे की स्थिरता पर उथले कप में रखा जाता है। नीचे स्थिरता मैन्युअल रूप से 1-2 एन के एक preload लागू करने के बाद एक सेट पेंच के साथ जगह में बंद कर दिया है (सी) बल-विस्थापन साजिश, जो लगभग 9 एन पर एसीएल चोट से पता चलता है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिदीप्ति परावर्तन इमेजिंग माउस घुटने के जोड़ों में प्रोटीज गतिविधि का पता लगाने. (ए, बी) चोट के बाद घायल (ए) और घायल (बी) चूहों की प्रतिनिधि छवियों. (सी) गैर-इनवेसिव एसीएल चोट के बाद एक सप्ताह में घायल और घायल चूहों के लिए दोनों घुटने के जोड़ों की औसत उज्ज्वल दक्षता। घायल जोड़ों ने 43% अधिक औसत उज्ज्वल दक्षता दिखाई, जो कि अप्रकाशित चूहों से विपरीत जोड़ों और जोड़ों की तुलना में थी। (डी) गैर-आक्रामक रूप से घायल चूहों और घायल चूहों के लिए सामान्यीकृत कुल उज्ज्वल दक्षता (आर / एल) जो संयुक्त पुनर्स्थापना सर्जरी के अधीन भी थे। चोट के बाद 1-4 सप्ताह में contralateral जोड़ों की तुलना में घायल जोड़ों में ~ 30% -80% अधिक उज्ज्वल दक्षता देखी गई। इसके विपरीत, शल्य चिकित्सा द्वारा संचालित जोड़ों ने विपरीत जोड़ों की तुलना में सप्ताह 4 में ~ 300% अधिक उज्ज्वल दक्षता का प्रदर्शन किया, जो सर्जरी के उल्लेखनीय भ्रमित प्रभाव का सुझाव देता है। **पी < 0.01। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल ने चूहों 20,21,24,33में एसीएल चोट को प्रेरित करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, गैर-इनवेसिव विधि की स्थापना और सख्ती से वर्णन किया है। यह सरल और कुशल चोट विधि कुछ ही मिनटों में की जा सकती है, जो पीटीओए के उच्च-थ्रूपुट अध्ययन की सुविधा प्रदान करती है। यह चोट विधि मानव एसीएल चोट के लिए प्रासंगिक चोट की स्थिति को भी बारीकी से दोहराती है। चूहों में ओए को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली सर्जिकल विधियां चोट के बाद संयुक्त में प्रोटीज गतिविधि के समय पाठ्यक्रम और परिमाण को मापने के लिए विवो इमेजिंग विधियों में उपयोग को रोक सकती हैं। इसके विपरीत, एफआरआई के साथ संयुक्त गैर-इनवेसिव ओए माउस मॉडल (20 में समीक्षा) चोट के बाद माउस घुटने के जोड़ों में प्रोटीज गतिविधि के विवो इमेजिंग के लिए एक अद्वितीय क्षमता प्रदान करते हैं।

चोट के बाद भड़काऊ प्रतिक्रिया ओए प्रगति में गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। हालांकि, संयुक्त में सूजन का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीके आमतौर पर महंगे, समय लेने वाले और विनाशकारी होते हैं। उदाहरण के लिए, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) या आरएनएएसईक्यू जैसी तकनीकों का उपयोग पूरे जोड़ों, व्यक्तिगत ऊतकों या एकल कोशिकाओं में जीन की एक विस्तृत श्रृंखला को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, इस विधि के लिए चूहों को घायल और घायल घुटने के जोड़ों को प्राप्त करने के लिए इच्छामृत्यु की आवश्यकता होती है। इन चूहों का विश्लेषण कई समय बिंदुओं पर नहीं किया जा सकता है, जैसे कि चोटी प्रोटीज प्रतिक्रिया के दौरान प्रारंभिक समय बिंदु (यानी, चोट के 3-14 दिन बाद) और बाद में समय बिंदु जब ओए अधिक गंभीर होता है (यानी, चोट के 4-6 सप्ताह बाद)। इसके विपरीत, एफआरआई गैर-इनवेसिव संयुक्त चोट के साथ संयुक्त विवो39 में चूहों के घुटने के जोड़ों में कई समय बिंदुओं पर प्रोटीज गतिविधि का विश्लेषण करने की क्षमता प्रदान करता है। यह एक ही चूहों के अनुदैर्ध्य विश्लेषण के लिए अनुमति देता है और एफआरआई को आरटी-पीसीआर या आरएनएएसईक्यू की तुलना में अपेक्षाकृत कम लागत वाला परिणाम बनाता है। इसके अलावा, कई जांच या लक्ष्यों को अलग-अलग तरंग दैर्ध्य पर एक साथ चित्रित किया जा सकता है, जो विभिन्न उद्देश्यों के लिए कई परिणाम प्रदान कर सकते हैं। एफआरआई का उपयोग करके संयुक्त में प्रोटीज गतिविधि को मापना ओए प्रगति के दौरान होने वाली सभी भड़काऊ प्रक्रियाओं की कठोर मात्रा प्रदान नहीं करता है, लेकिन इस विधि द्वारा प्रदान किए गए विवो और अनुदैर्ध्य डेटा में अभी भी संयुक्त चोट के बाद भड़काऊ प्रोटीज गतिविधि के परिमाण और समय पाठ्यक्रम पर नज़र रखने के लिए उपयोगी हो सकता है।

प्रोटीज गतिविधि के एफआरआई इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रतिदीप्ति सक्रिय जांच समाधान को अंतःशिरा (चतुर्थ) वितरित किया जाना चाहिए। चूहों में IV इंजेक्शन करने के सबसे आम तरीके पूंछ नस इंजेक्शन और रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन हैं। रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन अक्सर प्रदर्शन करना आसान होता है और पूंछ नस इंजेक्शन की तुलना में आवश्यक इंजेक्शन मात्रा को अधिक आसानी से सुविधाजनक बनाता है। साहित्य यह भी इंगित करता है कि रेट्रो-कक्षीय प्रसव पूंछनस इंजेक्शन 40 की तुलना में दवा वितरण या प्रभावकारिता में कोई अंतर नहीं के साथ चूहों को कम तनाव पैदा कर सकता है। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन एफआरआई इमेजिंग के लिए प्रतिदीप्ति सक्रिय जांच समाधान को इंजेक्ट करने के लिए उपयुक्त है।

कुछ अन्य इमेजिंग तकनीकों की तुलना में एफआरआई का संकल्प अपेक्षाकृत कम है, लेकिन मात्रात्मक परिणाम ओए प्रगति के दौरान भड़काऊ प्रोटीज प्रतिक्रिया के समय पाठ्यक्रम और परिमाण पर पर्याप्त जानकारी प्रदान कर सकते हैं। इस तकनीक की एक सीमा ऊतक autofluorescence परिणाम को प्रभावित कर सकता है, लेकिन इस समस्या प्रयोग (जांच प्रकार, चूहों के तनाव, पशु स्थिति, आदि) से पहले एक पूरी तरह से योजना के साथ हल किया जा सकता है. अन्य प्रीक्लिनिकल इमेजिंग विधियों (जैसे, माइक्रोपेट, माइक्रोस्पेक्ट, माइक्रोसीटी, एमआरआई) के विपरीत, एफआरआई चूहों और मनुष्यों के बीच आकार में भारी अंतर के कारण सीधे नैदानिक इमेजिंग तौर-तरीके में अनुवाद करने में सक्षम नहीं है क्योंकि प्रकाश प्रवेश की गहराई सीमित है। हालांकि, कृंतक मॉडल का उपयोग करके प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में, घुटने का जोड़ न्यूनतम नरम ऊतक कवरेज के साथ त्वचा के करीब होता है। नतीजतन, एफआरआई चूहों के घुटने के जोड़ में प्रोटीज गतिविधि का पता लगाने के लिए एक प्रभावी उपकरण है।

अंत में, गैर इनवेसिव एसीएल चोट चूहों में पीटीओए शुरू करने के लिए एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदान करता है. यह चोट विधि ओए प्रगति के दौरान माउस जोड़ों में समय पाठ्यक्रम और भड़काऊ प्रोटीज गतिविधि के परिमाण के विवो माप के लिए प्रोटीज-एक्टिवेटेबल जांच और प्रतिदीप्ति परावर्तन इमेजिंग के उपयोग की सुविधा भी प्रदान करती है। भविष्य के अध्ययन इन तकनीकों और विभिन्न आयु, लिंगों और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के चूहों में ओए प्रगति तंत्र की जांच करने के लिए या संयुक्त चोट के बाद ओए प्रगति को धीमा करने या रोकने के लिए संभावित उपचारों का मूल्यांकन करने के लिए कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध निकट-अवरक्त प्रतिदीप्ति सक्रियण जांच का उपयोग कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ आर्थराइटिस एंड मस्कुलोस्केलेटल एंड स्किन डिजीज, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ का हिस्सा, पुरस्कार संख्या R01 AR075013 के तहत समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate-Buffered Saline Tissue Protech PBS01-32R or equivalent
Air Anesthetia System Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone
Buprenorphine Analgesic post-injury 
Depilatory Cream Veet B001KYPZ4G or equivalent
Fixtures Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262 Can also use comparable optical imaging system
Kimwipes Kimberly-Clark Corporation 06-666 or equivalent
Living Image software  Perkin Elmer
Materials testing systems  TA Instruments Electroforce 3200 or equivalent
ProSense680 Perkin Elmer NEV10003 Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc.
Sterile Syringe with Needle Spectrum Chemical Mfg. Corp. 550-82231-CS Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent
Uniaxial load cell TA Instruments 20 N capacity
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc. SI-0236 or equivalent
WinTest software  TA Instruments compatible with Electroforce 3200

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References

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गैर-इनवेसिव संपीड़न-प्रेरित पूर्वकाल क्रूसिएट लिगामेंट (एसीएल) चोट विवो इमेजिंग में प्रोटीज गतिविधि चूहों दर्दनाक संयुक्त चोटों पोस्ट-ट्रॉमैटिक ऑस्टियोआर्थराइटिस (पीटीओए) जैविक प्रक्रियाएं सूजन मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीनिस (एमएमपी) कैथेप्सिन प्रोटीज हड्डी पुनरुत्थान पीटीओए के एटियलजि विवो मापन में सर्जिकल तकनीक इंजेक्शन निकट-अवरक्त प्रोटीज सक्रिय जांच प्रतिदीप्ति परावर्तन इमेजिंग (एफआरआई) प्रोटीज गतिविधि की मात्रा निर्धारित करना गैर-इनवेसिव एसीएल चोट विधि चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक चोट की स्थिति सड़न रोकनेवाला त्वचा में व्यवधान संयुक्त कैप्सूल
गैर-इनवेसिव संपीड़न-प्रेरित पूर्वकाल क्रूसिएट लिगामेंट (एसीएल) चोट और चूहों में प्रोटीज गतिविधि की <em>वीवो इमेजिंग में</em>
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Lin, Y. Y., Christiansen, B. A. Non-Invasive Compression-Induced Anterior Cruciate Ligament (ACL) Injury and In Vivo Imaging of Protease Activity in Mice. J. Vis. Exp. (199), e65249, doi:10.3791/65249 (2023).

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