Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Bruk av barrierevevsplattformen MicroSiM (μSiM) for modellering av blod-hjernebarrieren

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65258
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 1, 3, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Theodor Kocher Institute, University of Bern, 3Department of Biomedical Engineering, Rochester Institute of Technology

Summary

Denne rapporten gir protokoller for montering, cellekultur og analyser på μSiM-plattformen for konstruksjon av blod-hjernebarrieremodeller.

Abstract

MicroSiM (μSiM) er en membranbasert dyrkningsplattform for modellering av blod-hjernebarrieren (BBB). I motsetning til konvensjonelle membranbaserte plattformer gir μSiM eksperimentalister nye muligheter, inkludert levende celleavbildning, uhindret parakrin signalering mellom "blod" og "hjerne" -kamre, og evnen til direkte å avbilde immunfluorescens uten behov for ekstraksjon / montering av membraner. Her demonstrerer vi grunnleggende bruk av plattformen for å etablere monokultur (endotelceller) og samkultur (endotelceller og pericytter) modeller av BBB ved hjelp av ultratynne nanoporøse silisiumnitridmembraner. Vi demonstrerer kompatibilitet med både primære cellekulturer og humane induserte pluripotente stamcellekulturer (hiPSC). Vi tilbyr metoder for kvalitativ analyse av BBB-modeller via immunfluorescensfarging og demonstrerer bruken av μSiM for kvantitativ vurdering av barrierefunksjon i en liten molekylpermeabilitetsanalyse. Metodene som tilbys, skal gjøre det mulig for brukere å etablere sine barrieremodeller på plattformen, og fremme bruken av vevsbrikketeknologi for å studere menneskelig vev.

Introduction

Levende vev er compartmentalized av spesialiserte celler som skaper og vedlikeholder barrierer og regulerer hvilke celler og molekyler som transporteres fra ett rom til et annet. Feil regulering av barrierefunksjoner kan være kilde til både akutte sykdommer og kronisk sykdom. Blod-hjernebarrieren (BBB) er den mest restriktive vevsbarrieren i menneskekroppen1. Dysfunksjon av BBB ligger til grunn for et bredt spekter av sykdommer i sentralnervesystemet (CNS), inkludert Alzheimers sykdom2, Parkinsons sykdom 3,4 og multippel sklerose 5,6. Skader på BBB er også knyttet til langvarig kognitiv svekkelse som følge av akutte lidelser, som sepsis7, COVID-198 og postoperativt delirium9. Utviklingen av medisiner med potensial til å behandle hjernesykdommer har vært frustrerende vanskelig på grunn av utfordringen med forsettlig å bryte BBB for å levere bioaktive molekyler til mål i hjernen10. Av disse grunner er metoder for å studere BBB-funksjon in vitro av avgjørende betydning for forståelsen og behandlingen av sykdommer i CNS.

De grunnleggende metodene for å måle barrierefunksjon in vitro innebærer etablering av et monolag eller en samkultur på en semi-permeabel membran og måling av motstanden som overføres av celler til enten liten molekyldiffusjon eller små elektriske strømmer11,12,13,14. Mens fremveksten av mikrofysiologiske systemer (MPS) har produsert en overflod av valg for modellering av BBB i 3D15,16, gjør mangfoldet av systemgeometrier det vanskelig å sammenligne permeabilitetsmålinger mellom MPS eller til etablerte litteraturverdier. Etablering av pålitelige grunnlinjeverdier er spesielt viktig i BBB-forskning der, på grunn av den omfattende barrierereguleringen av hjernens vaskulære endotelceller, in vitro permeabilitetsverdier er sterkt undersøkt12,17,18. Av disse grunner vil permeabilitetsmålinger på tvers av monolag etablert på 2D-membraner forbli en stift i BBB-studier i årene som kommer. Dette gjelder for andre vevsbarrierer, inkludert epitelbarrierer, der absolutte verdier av baseline permeabilitet brukes til å validere og sammenligne in vitro-modeller 19,20,21.

Med mål om å etablere et verdifullt nytt verktøy for BBB-forskningsmiljøet, har vi introdusert22 og avansert23,24,25,26 mikroenhetenmed en silicon membrane (μSiM) plattform for bruk i barrierevevsmodellering de siste 5 årene. Den muliggjørende funksjonen til plattformen er en ultratynn (<100 nm tykk) membran med hundrevis av millioner nanoporer 27,28 eller en blanding av nanoporer og mikroporer29. De frittstående membranbrikkene er produsert på en 300 μm silisiumbrikke som stabiliserer de ultratynne strukturene30 og gjør at de kan håndteres med pinsett for montering av enheter. På grunn av deres ultratynne natur har membranene en permeabilitet som er to størrelsesordener høyere enn for konvensjonelle sporetsede membraner som brukes i kommersielle membrankulturinnretninger31,32. I praksis betyr dette at membranens hindring for diffusjon av molekyler mindre enn nanoporene (<60 nm) er ubetydelig33. For cellulære barrierer er det således bare cellene og matrisene de deponerer som bestemmer hastigheten på transport av små molekyler fra de apikale til basale rommene som er adskilt av membranen34. Enhetens design og membranens ultratynne natur gir også mange fordeler for optisk mikroskopi. Disse inkluderer 1) evnen til å følge levende kulturer ved hjelp av fasekontrast eller lysfeltavbildning, 2) evnen til fluorescerende flekker og bilde in situ uten behov for å trekke ut og overføre membranen til et dekselglass, og 3) det faktum at membranene er tynnere enn konfokale "skiver" slik at direkte samkulturer har en mer naturlig avstand mellom celletyper enn det som kan oppnås med 6-10 μm tykke sporetsede membraner.

Senest avanserte vi plattformen til et modulært format for å lette rask montering34 og tilpasning35,36. Vi utnyttet det modulære formatet for å distribuere enhetskomponenter mellom våre bioteknologiske og samarbeidende hjernebarrierelaboratorier. Vi utviklet deretter i fellesskap protokoller for enhetsmontering, monokultur og samkultur, immunfluorescerende farging og permeabilitet for små molekyler og viste at disse metodene var reproduserbare mellom laboratorier. Ved hjelp av disse protokollene viste vi også at den modulære plattformen støtter en validert BBB utviklet ved hjelp av den utvidede endotelkulturmetoden (EECM) for å lage hjernemikrovaskulære endotelceller (BMEC) fra humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs)37. Formålet med denne rapporten er å gjennomgå disse metodene mer detaljert og, ved hjelp av den medfølgende videoen, legge til rette for bredere adopsjon av plattformen i BBB-samfunnet.

Protocol

1. μSiM-enhet montering

MERK: Denne metoden beskriver monteringen av enhetene. Membranbrikken har en grøftside og flatside, som kan monteres grøft opp eller grøft-ned. Grøft-ned enheter er mest brukt for cellekultur.

  1. I et sterilt miljø (dvs. en biosikkerhetshette), klargjør alle materialene for montering, inkludert monteringsarmaturer, komponenter, membranflis og pinsett.
  2. Plasser membranbrikken på midten av armatur A1 ved hjelp av sponpinsett. Den flate overflaten på brikken vender ned og grøfteområdet vender opp for grøft-ned enheter, og omvendt for grøft-up enheter.
    MERK: Følgende monteringstrinn illustreres ved å bruke grøfteinnretningen som et eksempel, noe som gir et flatt vekstområde i toppkammeret.
  3. Bind komponent 1 til brikken. Riv først av de blå beskyttelseslagene på begge sider av komponent 1 med rett pinsett og legg den i armatur A1, toppkammeret ned. Trykk komponent 1 forsiktig ned til det trykkfølsomme limet (PSA) berører brikken.
  4. Sett armatur A2 på armatur A1 og bruk fast trykk i forskjellige hjørner for å sikre en tett passform av brikken og komponenten.
    MERK: Pass på at du ikke fjerner PSA-laget. Det er et gjennomsiktig og stivere lag sammenlignet med de blå beskyttende lagene.
  5. Bond komponent 2 til komponent 1 med brikken. Forbered først komponent 2 ved å ta tak i det ene hjørnet av komponent 2 med rett pinsett og skrelle den av fra arket. Ta deretter tak i ikke-PSA-trekantområdet i komponent 2 og fjern sammen det tykke, gjennomsiktige beskyttelseslaget og det blå laget av komponent 2, og utsett PSA-overflaten. Plasser komponent 2 i armatur B1, med PSA-siden opp.
  6. Plasser komponent 1 med membranbrikken i armatur B1, toppkammeret vendt oppover.
  7. Sett armatur B2 på komponent 1 og påfør fast trykk i forskjellige hjørner av armatur B2.
  8. Ta den monterte enheten ut av armaturen og bruk rett pinsett for å presse ut eventuelle luftbobler på undersiden av enheten og forsegle kantene på channelx', unngå kontakt med membranområdet. Før bruk for cellekultur, ultrafiolett (UV)-sterilisere nymonterte enheter i 20 minutter.

2. Cellekultur

MERK: Denne metoden beskriver protokoller for primære og hiPSC-avledede kulturer på plattformen. Metodene beskriver endotelcellemonokultur i enhetens øverste kammer og pericytt- og endotelcelle-samkultur med pericytter i bunnkammeret og endotelceller i det øverste kammeret av grøft-ned monterte enheter. For kammerdimensjoner og -volum, se tabell 1. Dette er de vanligste formatene; Imidlertid kan andre cellekulturoppsett brukes avhengig av brukerens behov.

  1. Fremstilling av cellekulturkammer
    1. Monter enhetene i henhold til protokollen beskrevet i avsnitt 1.
    2. Plasser enhetene i sterile slangeklemmer. Før cellekultur, steriliser klemmene ved å suge dem i etanol i ≥20 minutter. Resteriliser etter hvert eksperiment for gjenbruk.
    3. Dyrk enhetene i en stor steril petriskål. For ekstra fuktighet, tilsett en liten petriskål eller 50 ml konisk rørlokk fylt med sterilt vann.
    4. Vask enhetens øverste kammer to ganger med 100 μL sterilt vann. For bunnkammercellekultur, vask bunnkammeret med 20 μL sterilt vann.
  2. hCMEC/D3 cellelinje (BBB) monokultur
    1. Forbered cellekulturkammeret i henhold til pkt. 2.1.
    2. Belegg de øverste kamrene med 25 μg/cm2 kollagen I og 5 μg/cm2 humant fibronektin blandet i fosfatbufret saltvann (PBS). La den stå i 1–2 timer ved 37 °C eller over natten ved 4 °C.
    3. Fjern beleggløsningen og tilsett 100 μL forvarmet vekstfaktor-utarmet endotelmedium (analysemedium) til toppkammeret og 20 μL til underkammeret. For å forberede analysemediet, bland 100 ml endotelbasalmedium + 400 μL human fibroblastisk vekstfaktor + 40 μL hydrokortison + 100 μL gentamicinsulfat + 2 ml føtal bovint serum.
    4. Passasje hCMEC / D3-celler i henhold til produsentens protokoll; trypsinisere cellene i en 37 ° C inkubator i 3-5 minutter og deretter stoppe trypsinisering ved tilsetning av forvarmet endotelmedium. Overfør cellesuspensjonen til et sentrifugerør og sentrifuge ved 200 × g i 5 minutter ved romtemperatur. Resuspender cellepelleten i analysemedier og frø cellene i de øverste kamrene med en tetthet på 40.000-60.000 celler / cm2. Inkuber enhetene ved 37 ° C med 5% karbondioksid (CO 2) i2-4 timer for å lette celleadhesjon. For eksempel, for å oppnå 40 000 celler / cm 2 på 0, 37 cm2-brikken, tilsett 100 μL av en celleoppløsning med en konsentrasjon på 150 000 celler / ml til toppkammeret.
      MERK: Vi dyrker og passerer hCMEC/D3 i henhold til Hudecz et al.38, ved bruk av en modifisert formulering av endotelvekstmedier-2 (EGM-2) for cellevedlikehold og et vekstfaktorredusert "analysemedium" etter subkultur for analyser. Andre medieformuleringer bør være kompatible med enhetene, selv om vi anbefaler medieformuleringene fra Hudecz et al.38 hvis brukerne opplever problemer med hCMEC / D3-overlevelse.
    5. Etter 2-4 timer for celleadhesjon, bytt med friskt analysemedium i begge kamre for å fjerne døde eller ikke-tilknyttede celler.
    6. Vedlikehold enhetene ved 37 ° C med 5% CO 2, bytt analysemediet i begge kamre hver2-3 dager til eksperimentering. Analyser utføres vanligvis etter 2 ukers kultur.
  3. hiPSC-avledet EECM-BMEC-lignende cellemonokultur
    1. Forbered cellekulturkammeret i henhold til pkt. 2.1.
    2. Lag kollagen IV fra human placentaoppløsning ved å tilsette 5 ml 0,5 mg / ml eddiksyre til 5 mg kollagen IV for å lage en 1 mg / ml løsning. La oppløsningen stå i ≥4 timer ved 4 °C for fullstendig rekonstituering. Oppløsningen er stabil ved 4 °C i 2 uker.
    3. Belegg de øverste kamrene med 100 μL av et 4: 1: 5-forhold mellom kollagen IV, bovint fibronektin og sterilt vann. Belegg ved 37 °C i 2–4 timer.
    4. Fjern beleggløsningen og tilsett 100 μL romtemperatur hECSR til toppkammeret og 20 μL til underkammeret.
    5. Passasje EECM-BMEC-lignende celler ifølge Nishihara et al.37; tilsett en celledetachment enzymblanding til cellene og overfør til en 37 ° C inkubator i 5-8 minutter. Pipet celleløsningen for å singularisere og legge til 4x volumet av endotelmedium i et sentrifugerør. Sentrifuge ved 200 × g i 5 minutter ved romtemperatur; resuspendere cellene i hECSR og frø i de øverste kamrene med en tetthet på 40 000 celler/cm2. Inkuber enhetene ved 37 ° C med 5% CO 2 i2-4 timer for å lette celleadhesjon. For eksempel, for å oppnå 40 000 celler / cm2, tilsett 100 μL av en celleoppløsning ved 150 000 celler / ml.
    6. Etter 2-4 timer for celleadhesjon, bytt ut med fersk hECSR i begge kamre for å fjerne døde eller ikke-tilknyttede celler.
    7. Vedlikehold apparatene ved 37 °C med 5 % CO 2, og bytt ut hECSR i begge kamre hver1-2 dag inntil eksperimentering. Analyser utføres vanligvis på dag 6 av kulturen.
  4. hCMEC/D3 og primær human hjerne vaskulær pericytt (HBVP) samkultur
    1. Før enheten monteres, belegg membranflisene med 2 μg / cm2 poly-L-lysin (PLL) blandet i PBS. Påfør 50-80 μL PLL i en dråpe bare til siden som vender ned i den endelige enhetsenheten. Fullfør belegningsprosessen enten på 1–2 timer ved 37 °C eller over natten ved 4 °C.
    2. Fjern beleggløsningen. Vask membranflisene med sterilt ultrarent vann og la dem tørke.
    3. Monter enhetene i henhold til protokollen beskrevet i avsnitt 1 ovenfor, med den PLL-belagte siden vendt ned, og klargjør cellekulturkammeret i henhold til avsnitt 2.1.
    4. Belegg de øverste kamrene i henhold til pkt. 2.2.2.
    5. Tilsett 50 μL forvarmet pericytmedium til toppkamrene og tilsett 20 μL til de nedre kanalene.
    6. Passasje HBVP i henhold til produsentens protokoll; trypsinisere cellene i en 37 ° C inkubator i 3-5 minutter, deretter stoppe trypsinisering ved tilsetning av forvarmet pericytt medium. Overfør cellesuspensjonen til et sentrifugerør og sentrifuge ved 200 × g i 5 minutter ved romtemperatur. Resuspender cellepelleten i pericyttmedium og frø cellene i bunnkamrene med en tetthet på 14.000-25.000 celler/cm2. Inverter enhetene, men oppretthold et luftgrensesnitt med toppkamrene for å lette gassutvekslingen.
      MERK: Luftgrensesnittet som kreves under inversjon, kan oppnås ved å snu enhetene etter å ha plassert dem inne i slangeklemmer og skyve ned på alle hjørner før de vendes, eller ved å plassere enhetene opp ned på parallelle strimler av akryl eller silikon fordelt langt nok fra hverandre for å holde de øverste kamrene uhindret. Såtetthet må kanskje optimaliseres for hver bruker. For å oppnå 14 000 celler/cm2, tilsett 20 μL av en cellesuspensjon ved ~590 000 celler/ml. Merk at 20 μL pipetteres inn i bunnkammeret for å unngå bobler, men tettheten beregnes ved hjelp av bunnkammervolumet på 10 μL.
    7. Inkuber cellene ved 37 ° C med 5% CO 2 i2-4 timer i omvendt stilling for å lette celleadhesjon.
    8. Etter 2-4 timer for celleadhesjon, vend enhetene oppreist og bytt dem med friskt pericyttmedium i begge kamre for å fjerne døde eller ikke-festede celler.
    9. Etter pericyttsåing, frø hCMEC/D3s i toppkammeret, etter trinn 2.2.4-2.2.5. Bytt begge kamrene til analysemediet.
    10. Vedlikehold enhetene ved 37 ° C med 5% CO 2, bytt analysemedium i begge kamre hver1-2 dag til eksperimentering. Primærcelle samkultur opprettholdes vanligvis i 6-8 dager før analysene.
      MERK: Hvis HBVP-monokulturene vil bli sammenlignet med hCMEC / D3 monokulturer eller hCMEC / D3 og HBVP-kokulturer, bytter du pericytmedium med analysemedium 2-3 dager etter sådd av HBVPene.
  5. hiPSC-avledet EECM-BMEC-lignende celle og hjerne pericyttlignende celle (BPLC) samkultur
    1. Forbered cellekulturkammeret i henhold til pkt. 2.1 og belegg de øverste kamrene i henhold til trinn 2.3.2-2.3.3.
    2. Fjern beleggløsningen og tilsett 50 μL romtemperatur Essential 6 Medium + 10% Fetal Bovine Serum (E6 + 10% FBS) til toppkammeret.
    3. Passasje BPLCene i henhold til Gastfriend et al.39; tilsett en celledetachment enzymblanding til cellene og overfør til en 37 ° C inkubator i 5-15 minutter, til ~ 90% av cellene er avrundet. Pipett celleløsningen for å singularisere og tilsett 4x volumet av DMEM / F12 i et 50 ml sentrifugerør, ved hjelp av en 40 μm cellesil for å filtrere og fullt singularisere cellene. Overfør til et 15 ml sentrifugerør, sentrifuge ved 200 × g i 5 minutter ved romtemperatur, resuspender cellepelleten i E6 + 10% FBS, og frø cellene i bunnkamrene med en tetthet på 14.000-25.000 celler / cm2. Inverter enhetene, men oppretthold et luftgrensesnitt med toppkammeret for å lette gassutvekslingen.
      MERK: Luftgrensesnittet som kreves under inversjon, kan oppnås ved å snu enhetene etter å ha plassert dem inne i slangeklemmer og skyve ned på alle hjørner før du snur, eller ved å plassere enhetene opp ned på parallelle strimler av akryl eller silikon fordelt langt nok fra hverandre for å holde toppkamrene uhindret. Såtetthet må kanskje optimaliseres for hver bruker. For å oppnå 14 000 celler/cm2, tilsett 20 μL av en cellesuspensjon ved ~590 000 celler/ml. Merk at 20 μL pipetteres inn i bunnkammeret for å unngå bobler, men tettheten beregnes ved hjelp av bunnkammervolumet på 10 μL.
    4. Inkuber cellene ved 37 ° C med 5% CO 2 i2-4 timer i omvendt stilling for å lette celleadhesjon.
    5. Etter 2-4 timer for celleadhesjon, vend enhetene oppreist og bytt med frisk E6 + 10% FBS i begge kamre for å fjerne døde eller ikke-festede celler.
    6. En dag etter pericyttsåing frø EECM-BMEC-lignende celler i toppkammeret, etter trinn 2.3.5-2.3.6. Bytt begge kamrene til hECSR.
    7. Vedlikehold enhetene ved 37 ° C med 5% CO 2, bytt analysemediet i begge kamre hver1-2 dag til eksperimentering. hiPSC-avledet samkultur opprettholdes vanligvis i 7 dager for BPLC og 6 dager for EECM-BMEC-lignende celler før analyser.
      MERK: Hvis BPLC-monokulturene vil bli sammenlignet med EECM-BMEC-monokulturer eller EECM-BMEC- og BPLC-kokulturer, bytter du E6 + 10% FBS med hECSR 1 dag etter sådd av BPLC-ene.

3. Immunocytokjemi

MERK: Denne metoden beskriver en protokoll for immuncytokjemisk farging og avbildning av celler dyrket i øvre og / eller nedre side av membranen. Målet med dette eksperimentet er å bestemme tilstedeværelsen og plasseringen av nøkkelproteiner som skal finnes i BBB, for eksempel adherens og stramme kryssproteiner og celleidentitetsproteiner. Alternative og levende fargemetoder er også kompatible med plattformen.

  1. Fiksering og farging på enhetene
    1. Legg de primære antistoffene på is for å tine.
    2. Forbered en 4% paraformaldehyd (PFA) løsning ved romtemperatur (f.eks. fortynn 16% PFA i 3x volumet av PBS) eller avkjøl 100% metanol ved -20 ° C.
    3. Opprett en passende blokkeringsløsning i henhold til tabell 2. Oppbevares på is.
      MERK: Vortexing av oppløsningen kan være nødvendig for å fullstendig oppløse Triton X-100.
    4. Fest cellene ved å pipetere 20 μL fikseringsmiddel (f.eks. PFA eller metanol) inn i bunnkammeret og 50 μL inn i toppkammeret. Inkuber enhetene i 10 min (PFA) eller 2 min (metanol) ved romtemperatur.
    5. Vask i 3 x 5 minutter ved å pipetere 20 μL PBS gjennom bunnkammeret og 100 μL inn i toppkammeret.
    6. Blokker i 30 minutter ved romtemperatur ved å tilsette 20 μL av blokkeringsløsningen til bunnkammeret og 50 μL blokkeringsoppløsning i toppkammeret. Se etter bobler i bunnkammeret.
    7. Klargjør den primære antistoffoppløsningen ved å fortynne antistoffet/antistoffene i blokkeringsoppløsningen i henhold til tabell 2. Oppbevares på is.
    8. Flekk med de primære antistoffene ved å tilsette 20 μL av den primære antistoffoppløsningen til bunnkammeret og erstatte volumet av toppkammeret med 50 μL av den primære antistoffoppløsningen. Se etter bobler i bunnkammeret. Inkuber i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.
    9. Vask i 3 x 5 minutter ved å pipetere 20 μL PBS gjennom bunnkammeret og 100 μL inn i toppkammeret.
    10. Klargjør den sekundære antistoffoppløsningen ved å fortynne antistoffet/antistoffene i blokkeringsoppløsningen i henhold til tabell 2. Oppbevares på is beskyttet mot lys.
    11. Flekk med sekundære antistoffer ved å tilsette 20 μL sekundær antistoffoppløsning til bunnkammeret og erstatte volumet av toppkammeret med 50 μL av den sekundære antistoffoppløsningen. Se etter bobler i bunnkammeret. Inkuber i 1 time ved romtemperatur beskyttet mot lys.
    12. Vask i 3 x 5 minutter ved å pipetere 20 μL PBS gjennom bunnkammeret og 100 μL inn i toppkammeret.
    13. Lag en kjernefysisk flekkløsning. Fortynn Hoechst 1:10,000 i PBS. Tilsett 20 μL av atomflekkløsningen til bunnkammeret og erstatt volumet på toppkammeret med 50 μL av atomflekkløsningen. Se etter bobler i bunnkammeret. Inkuber i 3 minutter ved romtemperatur beskyttet mot lys.
    14. Fjern flekken ved å tilsette 20 μL PBS i bunnkammeret og erstatte volumet på toppkammeret med 100 μL PBS. Ta bilde av enhetene umiddelbart eller oppbevar dem ved 4 °C med petriskålen innpakket i parafilm og beskyttet mot lys til de er klare for avbildning.
  2. Konfokal avbildning
    MERK: Denne delen beskriver avbildning av enhetene ved hjelp av et invertert konfokalmikroskop med roterende skive med lang arbeidsavstand (LWD) 40x objektiv (vann, WD 590-610, numerisk blenderåpning 1.15) som et eksempel. For arbeidsavstander og objektivkompatibilitet, se tilleggsmateriale i McCloskey et al.34. Bilder av hele membranområdet er også tatt med et 10x mål for å sikre at de 40x bildene er representative for hele feltet. Disse er vanligvis tatt i widefield.
    1. Slå på mikroskopet og åpne bildebehandlingsprogramvaren.
    2. Sett kanalene i henhold til egenskapene til det sekundære antistoffet og atomflekken, ved hjelp av Confocal Imaging Mode. Optimaliser lasereffekten og eksponeringstiden for å sikre at signalet er over bakgrunnen og reduserer bildeartefakter.
      1. For Hoechst kjernefysisk farging, bruk eksitasjon 405, utslipp 450/50 Bandpass (BP), 500 ms eksponeringstid, 50% lasereffekt. For etiketter som bruker et sekundært antistoff konjugert til Alexa Fluor (AF) 488, bruk eksitasjon 488, utslipp 525/50BP, 500 ms eksponeringstid og 50% lasereffekt. For etiketter som bruker et sekundært antistoff konjugert til AF568, bruk eksitasjon 561, utslipp 600/50BP, 500 ms eksponeringstid og 100 % lasereffekt.
    3. Plasser enheten i mikroskopets glideanordningsholder, toppkammeret vendt opp og sett i mikroskopet ved hjelp av en lysbildeholder for mikroskop. Slå på Live og velg kanalen for atomflekken. Finn membranen ved hjelp av et lavt mål, og sørg for at det gjennomsiktige silisiumnitridmembranområdet er sentrert, da lys ikke vil passere gjennom det blå, faste silikonområdet. Når enheten er riktig sentrert og cellelaget er funnet, bytt til 40x-objektivet, våt målet og fokuser på membranområdet ved å bruke atomflekken som en guide.
    4. Slå på z-stack imaging og sett skannemodus til start/slutt. Angi trinnstørrelse eller antall. Bruk grovjusteringsknappen på mikroskopet, sett skannestarten til toppen av endotelcellelaget, bruk atomflekken som en guide, og skann enden på bunnen av pericytlaget, ved å bruke atomflekken som en guide. Kontroller alle kanaler for å sikre at alt blir fanget opp i bildefeltet.
      MERK: Vi bruker vanligvis auto step, som er ~ 0,2 μm skiver.
    5. Angi bildenavnet og trykk på Skaff for å starte bildebehandling. Gjenta på forskjellige regioner etter behov.
    6. Behandle de konfokale bildene ved hjelp av ImageJ40 eller Imaris.
      1. For å behandle i Imaris, dra bildefilen inn i programmet for å åpne. Velg Seksjon på den øverste menylinjen for å se et 2D-bilde av x-y-planet med tilsvarende visninger av x-z- og y-z-planene. Velg 3D-visning på den øverste menylinjen for å se et 3D-bilde . Klikk på bildet og dra det for å rotere. Velg Øyeblikksbilde på den øverste menylinjen for å ta et bilde.

4. Prøvetakingsanalyse av permeabilitet for små molekyler

MERK: Denne delen beskriver en metodikk for kvantitative målinger av barriereegenskapene til cellekulturene. Målet med dette eksperimentet er å oppdage konsentrasjonen av et fluorescerende lite molekyl som passerer gjennom cellelagene og kommer inn i bunnkammeret på plattformen. Disse dataene brukes deretter til å beregne cellulær permeabilitet.

  1. Prøvetaking teknikk
    1. Monter enhetene i henhold til protokollen beskrevet i avsnitt 1 og dyrk de ønskede cellelinjene som beskrevet i avsnitt 2. Inkluder en ekstra enhet som fungerer som en cellefri, belagt kontrollenhet for å måle systemets permeabilitet.
      MERK: Minimum tre tekniske replikater per betingelse anbefales; Imidlertid er det bare nødvendig med én replikering av den belagte kontrollen.
    2. Før prøvetakingsanalysen starter, må du bytte ut mediet i bunnkammeret med ferskt medium. Kontroller sammenløpet av endotelmonolaget i hver enhet under mikroskopet. Legg merke til eventuelle hull i cellemonolag, da dette vil påvirke diffusjonen av fargestoff i bunnkammeret.
      MERK: En sunn endotelkultur bør være 100% sammenflytende.
    3. Forbered den fluorescerende småmolekylære løsningen (f.eks. 150 μg / ml Lucifer Yellow, 457 Da) i cellekulturmedium. Forbered overflødig volum av den fluorescerende småmolekylløsningen som skal brukes til fremstilling av standardløsninger som tjener som referanser for å beregne konsentrasjonen av det fluorescerende lille molekylet samplet fra bunnkanalen.
      MERK: Vi anbefaler fremstilling av 400 μL overflødig løsning som skal brukes som standardløsning med høyeste konsentrasjon av det fluorescerende lille molekylet.
    4. Bytt ut mediet i toppbrønnen med 100 μL av den fluorescerende småmolekylløsningen.
      MERK: Vi anbefaler å bruke en hydrofob penn til å tegne sirkler rundt prøvetakingsportene og vente til det hydrofobe blekket tørker helt før tilsetning av fluorescerende fargestoffløsning. Dette forhindrer spredning av mediet fra bunnkanalen rundt prøvetakingsporten i trinn 4.1.7. Vi anbefaler å forskyve tilsetningen av den fluorescerende småmolekylløsningen i toppbrønnen, vent 2 minutter før du legger til fluorescerende løsning til neste enhet, eller arbeid i grupper på 3 (legg løsningen til tre enheter samtidig og vent 5 minutter for å legge til de neste tre enhetene).
    5. Inkuber enhetene ved 37 ° C, 5% CO2 i 1 time.
    6. Under 1 h-lang inkubasjon ved forrige trinn, klargjør standardløsninger ved å utføre 2 ganger serielle fortynninger fra den fluorescerende småmolekylære løsningen fremstilt i trinn 4.1.3. Pipet 50 μL av hver oppløsning inn i den flatbunnede svarte 96-brønnsplaten i triplikater. Bruk tomt cellekulturmedium som grunnleggende standardløsning.
      MERK: For å forberede standardløsninger anbefaler vi 11 serielle fortynninger ved et endelig volum på 200 μL og bruk av cellekulturmedium som blankt for å måle baseline fluorescerende intensitet.
      1. Overfør 200 μL 400 μL av den overskytende fluorescerende småmolekylære oppløsningen fremstilt i trinn 4.1.3 til et rør inneholdende 200 μL medium, bland godt og overfør 200 μL av denne løsningen til neste rør inneholdende 200 μL medium. Gjenta 1:2 fortynninger til det er totalt 10 tuber. Pipet 50 μL av den mest konsentrerte standardløsningen i kolonne 1 i triplikater i 96-brønnplaten (B1, C1, D1), den 2. mest konsentrerte løsningen i kolonne 2 (B2, C2, D2), og så videre. For den 12. kolonnen i platen, pipet 50 μL tomme medier i triplikater (B12, C12, D12).
    7. Utfør følgende trinn for å prøve den fluorescerende småmolekylløsningen fra bunnkanalen.
      1. Fjern den fluorescerende småmolekylløsningen fra brønnen for å stoppe diffusjonsprosessen.
      2. Plasser en spiss som inneholder 50 μL medium i den øvre porten for å tjene som et reservoar ved å sette spissen med 50 μL inn i porten, løfte enheten og forsiktig kaste ut spissen mens du holder på toppen for stabilisering. Sett ned enheten. Forsikre deg om at det ikke er bobler i pipettuppen eller luft i pipetspissen for å unngå å tilsette bobler i bunnkammeret under prøvetaking.
      3. Tilsett 50 μL medium i toppbrønnen for å forhindre forstyrrelse av cellemonolaget under prøvetaking.
      4. For prøvetaking av løsningen fra bunnkanalen, skyv en pipepipetter med en tom pipetspiss til første motstand, sett spissen inn i prøvetakingsporten og vend ut 50 μL av løsningen fra bunnkanalen. Overfør direkte til den flatbunnede svarte 96-brønnplaten som inneholder standardløsningene.
        MERK: Vi anbefaler at du sjekker cellemonolaget under mikroskopet umiddelbart etter prøvetaking. Tegning av medier fra bunnkanalen kan av og til føre til forstyrrelse av cellelaget i toppbrønnen, noe som kan føre til inkonsekvente permeabilitetsmålinger. Å arbeide raskt gjennom trinnene i 4.1.7 vil bidra til å forhindre dette.
    8. Mål fluorescensintensiteten i en mikroplateleser ved hjelp av de riktige eksitasjons- og utslippsbølgelengdeparametrene for det fluorescerende lille molekylet som brukes. For Lucifer Yellow, bruk 428 nm eksitasjon og 536 nm utslipp, med optimal forsterkning. Fluorescens måles fra toppen av platen. Legg platen inn i plateleseren, brønnene med prøve (inkludert standardkurven) og velg Start for å lese platen.
  2. Beregning av permeabilitetsverdien (se tilleggsfil 1 for mal)
    1. Trekk den gjennomsnittlige fluorescensintensitetsverdien til det tomme mediet fra alle fluorescensintensitetsverdier som er målt.
    2. Bruk ligning (1) for å beregne systemets permeabilitet Ps:
      Equation 1(1)
      Hvor [A] A er konsentrasjonen av det fluorescerende lille molekylet samlet fra bunnkanalen, V er volumet samplet og tilsatt platen (0,050 ml), [A] L er konsentrasjonen av det fluorescerende lille molekylet tilsatt i toppbrønnen (f.eks. 0,15 mg / ml), t er tidspunktet for inkubasjon (i s eller min avhengig av de ønskede enhetene), og S er membranoverflaten (0, 014 cm2).
      1. Beregn [A] A ved hjelp av ligningen oppnådd ved å plotte en standardkurve fra fluorescensintensitetsutgangene og de kjente konsentrasjonene av standardløsningene. Beregn konsentrasjoner (x) av eksperimentelle prøver ved å sette inn fluorescensintensitetsverdiene (y) i ligningen.
        MERK: Bruk den delen av standardkurven som er lineær. Vi anbefaler å måle membranoverflaten fra et bilde av membranen tatt under mikroskopet, da membranområdet kan variere avhengig av partinummeret og kan påvirke de beregnede permeabilitetsverdiene betydelig hvis de avviker fra den belagte kontrollen.
    3. Bruk ligning (2) for å beregne permeabiliteten til cellemonolaget Pe:
      Equation 2(2)
      der PS er systemets permeabilitet som beregnet i trinn 4.2.2 og PC er systemets permeabilitetsverdi for den cellefrie, belagte kontrollenheten.

Representative Results

Montering av en grøft-ned enhet er vist i figur 1. Armaturene styrer monteringen av komponentene og membranbrikken. Komponent 1 er primært akryl med en PSA-overflate for liming til sponet og en åpning til bunnkammeret og porter for pipettilgang til bunnkammeret. Komponent 2 er kanallaget og inneholder en ikke-klebende, PSA-fri "trekant" øverst til høyre for griping. Grøft-ned enheter gir en flat cellekultur vekstområde i det øverste kammeret, mens grøft opp enheter har en flat overflate for cellekultur i bunnkammeret.

Vi utførte endotelmonokulturer og kokulturer av hCMEC/D3 og HBVP og av hiPSC IMR90-4-deriverte EECM-BMEC-lignende celler og BPLC-er og tok fasebilder ved hjelp av et Nikon Eclipse Ts2 fasekontrastmikroskop og 10x objektiv (figur 2). Optimal såtetthet for primær cellekultur er vist (bilder tatt 1 dag etter såing), samt undersådde HBVPs (figur 2A). Endelige kokultur og monokulturfasebilder (6 dagers endotelcellekultur) kan være vanskelig å skille (figur 2C), og bekreftelse av vellykket primærcelle-kokultur kan kreve immunfluorescensfarging (se protokollavsnitt 3). Lav, høy og optimal hiPSC-avledet BPLC-såtetthet er også illustrert (figur 2B). hiPSC-avledet samkultur er tydeligere å skille i fasekontrastavbildning sammenlignet med primære kokulturer (figur 2D). Lav BPLC-såing resulterer i dårlig pericyttdekning og pericyttklumping, mens oversåing resulterer i at pericytlaget skreller av membranen. Videre kan utveksling av mediet i bunnkammeret for raskt føre til pericytttap, da disse cellene er svært følsomme for skjær. Optimal dekning av pericytter er ~ 90% for en BBB-modell, uten hull i endotellaget.

Representative bilder av immunfarget hiPSC-derivert samkultur er illustrert i figur 3 (6 dagers endotelcellekultur). IMR90-4-deriverte BPLC ble farget for pericyttmarkøren PDGFRβ, og IMR90-4-deriverte EECM-BMEC-lignende celler ble farget for adherens kryssmarkør VE-cadherin. Hoechst ble brukt til å flekke kjernene. Bildene ble tatt på et spinneskive konfokalmikroskop ved hjelp av et 40x LWD-objektiv med 0,2 μm skiver og behandlet med Imaris. Begge cellelagene kan visualiseres selv om den tynne nanomembranen ikke sees.

Vi utførte den prøvetakingsbaserte permeabilitetsanalysen for små molekyler ved bruk av de samme eksperimentelle forholdene i to fysisk fjerne laboratorier ved Universitetet i Bern, Sveits og University of Rochester, NY, USA for å demonstrere reproduserbarhet av resultater mellom laboratorier (figur 4) 34. hiPSC IMR90-4-avledede EECM-BMEC-lignende celler ble dyrket i μSiM-enheten i 2, 4 eller 6 dager og på transbrønnfiltre i 6 dager. Analysen ble utført med 150 μg/ml Lucifer Yellow (457 Da) i begge laboratoriene. Høy variasjon i permeabiliteten til endotelcellene dyrket i 2 dager i enheten indikerer at 2 dager med kultur var utilstrekkelig for barrieremodning. Det var ingen signifikante forskjeller i permeabilitet mellom laboratoriene ved barrieremodning - fra 4 dager på. Vi viste også at permeabiliteten til endotelcellene dyrket i μSiM og transbrønnfiltre i 6 dager samsvarte med de tidligere publiserte40.

Figure 1
Figur 1: Trinn for μSiM-montering . (A) Forbered brikken ved å plassere den på armatur A1. Plasser chipgrøften opp for en siste grøft-ned enhet. Plasser spongrøften ned for en siste grøft-up enhet. (B) Bind komponent 1 til brikken ved å fjerne beskyttelsesmaskene fra komponent 1 og plassere den med forsiden ned i FA1. Bind ved å påføre trykk med armatur A2. (C) Bind komponent 2 og komponent 1 ved å fjerne komponent 2 fra arket og skrelle av de øverste beskyttende lagene. Plasser kanalen opp i armatur B1 og plasser komponent 1 på toppen av komponent 2 med forsiden opp. Bond ved å påføre trykk med armatur B2. Forkortelser: FAn = inventar An; FBn = kamp Bn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk fremstilling av kokultur og representative fasekontrastbilder av cellekultur i enheter. (A) Plassering av pericytt- og endotelcellesåing. (B) Sidevisningsskjema over celleplasseringer over grøften til membranbrikken. (C) Representative bilder av lav og optimal såtetthet for primær HBVP og hCMEC / D3 hjerneendotelcellelinje. Bildene ble tatt 1 dag etter såing (HBVP) og 2 timer etter såing (hCMEC/D3). (D) Representative bilder av lav, høy og optimal såtetthet for hiPSC-avledede hjernepericyttlignende celler. Bilder ble anskaffet 1 dag etter sådd. (E) Representative bilder av endelig HBVP og hCMEC/D3 samkultur og hCMEC/D3 monokultur. Bilder ble tatt 8 dager etter HBVP-såing og 7 dager etter hCMEC/D3-såing. (F) Representative bilder av mislykkede og vellykkede BPLC og EECM-BMEC-lignende celle samkultur og EECM-BMEC-lignende cellemonokultur. Bilder ble tatt 7 dager etter BPLC-såing og 6 dager etter EECM-BMEC-såing. Underseedede BPLC-kulturer har ikke tilstrekkelig dekning, mens overseeding av BPLC-kulturer vil bli overstrømmende og begynne å klumpe seg / vike. Skalastenger = 100 μm (C-F). Forkortelser: HBVPs = menneskelige hjerne vaskulære pericytter; hiPSC = humanindusert pluripotent stamcelle; BPLC = hiPSC-avledede hjernepericyttlignende celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative bilder av immunfarget hiPSC-derivert celle-samkultur i enheter. Celler ble farget for endotelcellemarkør VE-cadherin (grønn), pericyttmarkør PDGFRβ (rød) og nukleær flekk (blå). To lag med celler kan sees i umiddelbar nærhet, kun adskilt av en tynn silisiumnitrid nanomembran (hvit pil markerer membranplassering på venstre bilde). Skala bar = 50 μm. Forkortelser: hiPSC = humanindusert pluripotent stamcelle; PDGFRβ = blodplatederivert vekstfaktorreseptor beta. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Prøvetakingsbasert permeabilitetsanalyse for små molekyler. (A) Skjematisk fremstilling av den eksperimentelle arbeidsflyten. (B) Demonstrasjon av reproduserbarheten mellom to fysisk fjerne laboratorier ved Universitetet i Bern (UniBe), Sveits, og University of Rochester (UR), NY, USA: hiPSC-deriverte endotelceller ble dyrket i μSiM-enheten i 2, 4 eller 6 dager og i transbrønnfiltre i 6 dager. Permeabilitetsanalyse ble utført med 150 μg/ml Lucifer Yellow (457 Da). Den røde linjen indikerer tidligere publiserte natriumfluorescein (376 Da) permeabilitetsdata for de samme hiPSC-avledede endotelceller dyrket i 6 dager i transbrønnfiltre40. N = 4-16 per gruppe. Toveis ANOVA med Tukeys post hoc-test ble brukt, og sammenligninger ble kun vist for relevante p < 0,05. (C) Demonstrasjon av cytokinrespons ved bruk av hiPSC-deriverte EECM-BMEC-lignende celler dyrket i μSiM i 2 dager; 0,1 ng/ml TNFα + 2 IE/ml IFNγ) eller mediekontroll (ikke-stimulert, NS) ble tilsatt toppkammeret i 20 timer før permeabilitetsanalysen ved bruk av 150 μg/ml Lucifer Yellow. N = 3 per gruppe. Student t-test, p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Toppkammer såingsareal Topp brønnvolum Bunnkammer såing overflate Nedre kanalvolum
~37 mm2 100 μL (kan holde ≥115 μL) ~42 mm2 10 μL (pipet 20 μL for å unngå bobler)

Tabell 1: Kritisk μSiM overflateareal og volum.

Mål Bindemiddel Blokkering av løsning Fortynning
VE-cadherin 4% PFA eller 100% MeOH 5% GS + 0,4% Tx-100 eller 10% GS + 0,3% Triton X-100 1:50
CD31 4% PFA eller 100% MeOH 5% GS + 0,3-0,4% Triton X-100 1:100
Claudin-5 100% MeOH 5-10% GS + 0,3% Triton X-100 1:200
ZO-1 100% MeOH 5-10% GS + 0,3% Triton X-100 1:200
Okkludering 100% MeOH 5-10% GS + 0,3% Triton X-100 1:50
PDGFRβ 4% PFA 5% GS + 0,4% Triton X-100 1:100
NG2 4% PFA 5% GS + 0,4% Triton X-100 1:100
Geit α-mus IgG Alexa Fluor 488 1:200
Geit α-mus IgG Alexa Fluor 568 1:200

Tabell 2: Antistoffer og fargemetoder validert for kokultur immunocytokjemi i μSiM-enheter. Forkortelser: PFA = paraformaldehyd; MeOH = metanol; GS = geiteserum.

Tilleggsfil 1: Mal for beregning av permeabilitetsverdi. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Mens membranbrikker er designet for stabilitet, kan de sprekke eller gå i stykker hvis de håndteres feil under montering. Derfor er det viktig å gripe brikken i chippinsetthakkene og plassere den forsiktig i armaturen. Når du håndterer enhetene generelt, må du ta ekstra forholdsregler for ikke å støte eller slippe enhetene. Under limingen av membranbrikken til armatur A1, må brikken legges flatt og sentreres på søylen til armatur A1 for å unngå membransprekker under bindingen til komponent 1. Videre må enhver kontakt med de eksponerte PSA-lagene unngås etter fjerning av beskyttelsesmasker. Ved håndtering av komponent 2 etter fjerning av beskyttelsesmaskene, anbefales det å holde den langs komponentens kant og bruke pinsett for å ta tak i det PSA-frie trekanthjørnet.

Mens cellekulturprotokoller ble beskrevet for mulige BBB-modeller, kan BMEC / pericyte co-culture modell av BBB beskrevet her være tilstrekkelig eller utilstrekkelig, avhengig av fysiologisk kontekst og spørsmål av interesse. For eksempel forekommer immuncellehandel i stor grad i hjernens postkapillære venuler41,42. I disse regionene skiller et perivaskulært rom BMEC/pericyttbarrieren fra gliagrensene etablert av astrocytter. I postkapillære venuler består således den nevrovaskulære enheten (NVU) av to fysisk separerte barrierer i serie, og astrocytiske endeføtter kommer ikke direkte i kontakt med BMEC/pericyttblodbarrieren, som er godt representert ved dagens modell. Hvis målet er en NVU-modell som står for virkningen av astrocyttutskilte faktorer på blodbarrieren, kan et astrocyttrom legges til enheten som tillater løselig faktorutveksling gjennom det perivaskulære rommet. Dette eksemplet ble illustrert tidligere34 og kan utvides til å inkludere andre celler som mikroglia og nevroner i et 3D 'hjerne' rom. Den modulære arkitekturen til plattformen gjør det mulig å bruke enkle monteringsstrategier for å oppnå disse rekonfigurasjonene, slik at plattformen er så enkel eller kompleks som nødvendig for å adressere hypotesene. Hvert cellekulturoppsett; Må imidlertid optimaliseres for nye cellelinjer og multikulturer. For eksempel, på grunn av egenskapene til silisiumnitridmembranene, kan det hende at beleggløsninger må justeres sammenlignet med vevskulturplater. Inkluderingen av fibronektin vanligvis hjelpemidler i celle vedlegg og overlevelse. Videre kan brukerne dyrke endotelceller og pericytter i motsatte retninger. I dette tilfellet kan det være nødvendig å for eksempel endre måten permeabilitetsmålingene gjøres og tolkes på. Å gi skritt for denne typen kultur er imidlertid utenfor omfanget av dette papiret.

En annen utfordring man kan støte på under cellekultur er rask fordampning av media siden enhetene kan være mer følsomme for endringer i miljøet sammenlignet med standard vevskulturplater og kolber. Hvis overflødig fordampning ses eller celleveksten reduseres, må alle kritiske inkubatorparametere måles for å sikre nøyaktige innstillinger. Mer vann kan tilsettes vevshetten eller den lille petriskålen som plasseres inne i cellekulturkammeret, eller media må byttes oftere. Videre kan bobler komme inn i bunnkanalen og sette seg fast i grøften for grøft-ned-enheter. Selv om de kan fjernes, er det enklest å unngå å legge til bobler i utgangspunktet. For å gjøre dette er det viktig å kontrollere at det ikke er bobler i pipettespissen eller luft på enden av pipettespissen før pipetteringsmedier kommer inn i bunnkammeret. Videre kan mediefordampning i kanalen føre til et gap mellom medieoverflaten og porttoppen. Et lite volum media kan pipetteres inn i én port til mediet når overflaten til motsatt port, hvoretter mediet kan utveksles i den motsatte porten. Mens hECSR og E6 + 10% FBS-medier ikke skal varmes opp i vannbadet, kan andre medier forvarmes for å redusere bobledannelse. Hvis en boble kommer inn i bunnkammeret, kan den fjernes ved raskt å pipettere 100 μL gjennom kanalen. Denne metoden kan imidlertid føre til forurensning mellom kamre eller medier som søles over enhetens overflate. Det kan også forstyrre cellelag. Alternativt kan mediet fjernes fra kanalen først og deretter gjeninnføres med et volum på 50 μL. Å fjerne mediet først kan imidlertid føre til mer bobledannelse i kanalen. Hvis en boble ikke er direkte under membranområdet, kan den stå i kanalen uten effekter på cellekultur.

Pericytttilknytning og -vekst kan, som vist i figur 2, være utfordrende. Bruk av en optimalisert såtetthet er avgjørende for dannelsen av et lag med et fysiologisk relevant pericyt-til-endotelcelleforhold. Videre, da pericyttene er følsomme for skjær, bør alle medieutvekslinger i kanalen gjøres veldig sakte for å beskytte cellene. For BPLC-kultur kan forbedret feste oppnås ved å belegge bunnkammeret med 800 μg / ml kollagen type IV eller 100 μg / ml fibronektin.

Immunocytokjemi i enheter beskrevet her muliggjør kvalitativ analyse av cellehelse og funksjon. Metoder for farging i vevskulturplater eller andre plattformer skal kunne oversettes direkte til plattformen. For cellekultur i bare det øverste kammeret, etter fiksering, kan PBS legges inn i bunnkammeret og overlates til de resterende trinnene, med blokkering og farging kun i toppkammeret. Dette minimerer risikoen for å bryte membranene eller få bobler inn i bunnkammeret. For samkulturfarging anbefaler vi å bruke begge kamrene i alle trinn. Det er viktig å merke seg at viskositeten til fikseringsmiddelet og PBS er forskjellig fra media. Dermed kan det være lettere å tilføre bobler i bunnkammeret, og det bør utvises ekstra forsiktighet for å sjekke pipettespissene for luft på enden av spissen før pipettering i bunnkammeret.

Protokollen beskrevet for permeabilitetsanalysen for små molekyler tillater funksjonell og kvantitativ vurdering av barrierefunksjonen til endotelcellene dyrket i μSiM-enheten. Et problem som kan oppstå under denne analysen, er å trekke luftbobler inn i pipetten under prøveinnsamling fra bunnkanalen i protokolltrinn 4.1.7.4. For å unngå dette problemet er det viktig å sørge for at spissen er forseglet i porten før du starter prøveinnsamlingen, og at prøven ikke skal trekkes for fort. Hvis det ikke løser problemet, kan størrelsen på spissene som brukes være for liten eller for stor til å passe inn i portene. bruk tipsene som er oppført i materialfortegnelsen. Hvis uventet høye permeabilitetsverdier måles til tross for et konfluent monolag med et sunt utseende, må monolagets integritet kontrolleres for forstyrrelser under prøveinnsamling. Vi anbefaler alltid å sjekke monolaget under mikroskopet umiddelbart etter prøvetaking. Hvis monolaget fortsatt virker intakt og sunt, kan prøven fikseres og biologiske markører for barrierefunksjon kan vurderes, for eksempel via immunfarging av kryssproteinene. Omvendt, hvis uventet lave permeabilitetsverdier måles, er det viktig å sikre at 50 μL medier prøves fra bunnkanalen uten luftbobler. Hvis medium kommer ut fra prøvetakingsporten så snart reservoarspissen er plassert, må dette mediet samles inn før pipetten monteres i prøvetakingsporten, ettersom det meste av det fluorescerende lille molekylet vil være til stede i det første volumet på 10 μL samplet fra bunnkanalen. Å tegne sirkler rundt portene ved hjelp av en hydrofob penn eller plassere et hydrofobt tape med et hull rundt porten forhindrer passivt pumpede medier i å spre seg. Dersom det trekkes opp bobler under prøvetaking eller hele 50 μL-prøven ikke fjernes, skal prøven ikke brukes. Alternativt kan det nøyaktige volumet bestemmes og brukes i permeabilitetsberegningen; Dette bør imidlertid bare gjøres hvis det fjernede volumet er ≥40 μL, noe som tilsvarer ~ 98-99% fargestoffgjenvinning34.

Disclosures

J.L.M. er medstifter av SiMPore og har en eierandel i selskapet. SiMPore kommersialiserer ultratynne silisiumbaserte teknologier, inkludert membranene som brukes i denne studien.

Acknowledgments

J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. og L.W. ble finansiert av NIH grant R33 HL154249. J.L.M. ble finansiert av R44 GM137651. M.M. ble finansiert av Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience, University of Rochester. M.T. ble finansiert av RF1 AG079138. K.C. ble finansiert av International Foundation for Ethical Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
CD31 Polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific PA5-32321
Claudin-5 mouse IgG antibody, 4C3C2 Thermo Fisher Scientific 35-2500
Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11001
Goat α-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A11011
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
NG2, mouse IgG2a, 9.2.27 Millipore  MAB2029
Occludin mouse IgG antibody, OC-3F10 Thermo Fisher Scientific 33-1500
PDGFRβ, rabbit IgG antibody, 28E1 Cell Signaling Technology 3169
VE-cadherin mouse IgG2B Clone # 123413 R&D Systems MAB9381
ZO-1 rabbit IgG antibody, polyclonal Thermo Fisher Scientific 40-2200
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
100% Methanol VWR 101443-718 Can be substituted with similar products
16% Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908 Can be substituted with similar products
Accutase Thermo Fisher Scientific A1110501
Acetic acid Sigma-Aldrich 695092
B27 supplement Thermo Fischer Scientific 17504044
bFGF R&D Systems 233-FB-025
Collagen IV from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagen, Type I solution from rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL Can be substituted with similar products
DMEM/Ham’s F12 Thermo Fisher Scientific 11320033
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit Lonza CC-3162
Essential 6 medium Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal bovine serum (FBS) Peak Serum PS-FB1
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141
Fibronectin human protein, plasma ThermoFisher Scientific 33016015 Can be substituted with similar products
hESFM Thermo Fisher Scientific 11111044
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma-Aldrich 861502
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific 500627 Can be substituted with similar products
PBS without calcium, magnesium Cytiva SH30256.01 Can be substituted with similar products
Pericyte Medium ScienCell 1201 Use complete kit (includes supplements)
Poly-L-Lysine, 10 mg/mL ScienCell 0413
Triton X-100 JT Baker X198-05 Can be substituted with similar products
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen™ 10977015 Can be substituted with similar products
Experimental models: Cell lines
Blood-brain barrier hCMEC/D3 cell line Sigma-Aldrich SCC066
Human brain vascular pericytes ScienCell 1200
iPS(IMR90)-4 human induced pluripotent stem cells WiCell RRID:CVCL_C437
Glassware and Plasticware
150 mm TC-treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid Falcon 353025
Clamps VWR MFLX06832-10
Corning tissue culture plates (6-well) Corning 3506
Flat 96-well non-binding microplates Greiner Bio-One 655900
Microscope Slide Device Holder  SiMPore USIM-SB Dimensions compatible with micropscope slide holders
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fischer Scientific 339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fischer Scientific 339653 Tube caps can be filled with water for cell culture
P20-200 pipette tips VWR 76322-516 Alternate brands may not seal as effectively into ports
Transwell filters (12 well, 12 mm, 0.4 μm pore size, PC) CoStar 3401
Instruments
10X Objective (For Andor) Nikon Instruments Inc. MRD00105 Air; WD: 4 mm; NA 0.45
10X Objective (For Nikon) Nikon Instruments Inc. MRP40102 Air; WD: 6.2 mm; NA 0.25
40X Objective (LWD) (For Andor) Nikon Instruments Inc. MRD77410 Water immersion; WD: 590-610 mm; NA 1.15
Andor Spinning Disc Confocal microscope Oxford Instruments, Andor
Nikon Eclipse Ts2 Phase Contrast Microscope Nikon Instruments Inc. Can be substituted with similar products
TECAN Infinite M200 TECAN Can be substituted with similar products
Other
Advanced PAP Pen Millipore Sigma Z672548 2 mm tip is recommended
Assembly kit with fixtures SiMPore USIM-JIGSET Including fixure A1, A2, B1, and B2
Camera Adapter for Microscopes AmScope CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR Φ23.2 - Φ30 adapter fits Nikon Eclipse Ts2
Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera Canon EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001 Can be substituted with similar products
Cell strainer, 40 µm Millipore Sigma (Corning) CLS431750
Component 1 SiMPore USIM-C1
Component 2 SiMPore USIM-C2
Membrane chips SiMPore NPSN100-1L Other chips formats are available
SMD handling tweezer double angle Techni-Tool 758TW003 "Chip Tweezers"
Stainless steel precision type GG tweezer Techni-Tool 758TW534 "Straight Tweezers"
Software
Fiji ImageJ For image processing
Fusion Oxford Instruments, Andor Instructions for version 2.3.0.44
i-control TECAN Instructions for version 2.0
Imaris Oxford Instruments For image processing. Instructions for version 9.9.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Villabona-Rueda, A., Erice, C., Pardo, C. A., Stins, M. F. The evolving concept of the blood brain barrier (BBB): from a single static barrier to a heterogeneous and dynamic relay center. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 405 (2019).
  2. Nation, D. A., et al. Blood-brain barrier breakdown is an early biomarker of human cognitive dysfunction. Nature Medicine. 25 (2), 270-276 (2019).
  3. Ferrari, C. C., Tarelli, R. Parkinson's disease and systemic inflammation. Parkinsons Disease. 116 (3), 436813 (2011).
  4. Koch, E. V., Ledwig, V., Bendas, S., Reichl, S., Dietzel, A. Tissue barrier-on-chip: a technology for reproducible practice in drug testing. Pharmaceutics. 14 (7), 1451 (2022).
  5. Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).
  6. Ortiz, G. G., et al. Role of the blood-brain barrier in multiple sclerosis. Archives of Medical Research. 45 (8), 687-697 (2014).
  7. Orhun, G., et al. Association between inflammatory markers and cognitive outcome in patients with acute brain dysfunction due to sepsis. Archives of Neuropsychiatry. 56 (1), 63-70 (2019).
  8. Chen, Y., Yang, W., Chen, F., Cui, L. COVID-19 and cognitive impairment: neuroinvasive and blood-brain barrier dysfunction. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 222 (2022).
  9. Hughes, C. G., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier injury as risk factors for delirium in critically ill patients. Critical Care Medicine. 44 (9), e809-e817 (2016).
  10. Saraiva, C., et al. Nanoparticle-mediated brain drug delivery: Overcoming blood-brain barrier to treat neurodegenerative diseases. Journal of Control Release. 235 (10), 34-47 (2016).
  11. Jolliet-Riant, P., Tillement, J. P. Drug transfer across the blood-brain barrier and improvement of brain delivery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 13 (1), 16-26 (1999).
  12. Abbott, N. J., et al. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2009).
  13. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  14. Bischoff, I., et al. Pitfalls in assessing microvascular endothelial barrier function: impedance-based devices versus the classic macromolecular tracer assay. Scientific Reports. 6, 23671 (2016).
  15. van der Helm, M. W., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue Barriers. 4 (1), e1142493 (2016).
  16. Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In vitro microfluidic models for neurodegenerative disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
  17. Girard, S. D., et al. High and low permeability of human pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models depend on epithelial or endothelial features. FASEB Journal. 37 (2), e22770 (2023).
  18. Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines. 12 (6), 685 (2021).
  19. Lea, T., et al. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Cham (CH): Springer. (2015).
  20. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  21. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  22. Mossu, A., et al. A silicon nanomembrane platform for the visualization of immune cell trafficking across the human blood-brain barrier under flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (3), 395-410 (2019).
  23. Castro Dias, M., et al. Brain endothelial tricellular junctions as novel sites for T-cell diapedesis across the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 134 (8), jcs253880 (2021).
  24. Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
  25. Khire, T. S., et al. Microvascular mimetics for the study of lukocyte-endothelial interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (2), 125-139 (2020).
  26. Salminen, A. T., et al. Endothelial cell apicobasal polarity coordinates distinct responses to luminally versus abluminally delivered TNF-alpha in a microvascular mimetic. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 12 (11), 275-289 (2020).
  27. DesOrmeaux, J. P. S., et al. Nanoporous silicon nitride membranes fabricated from porous nanocrystalline silicon templates. Nanoscale. 6 (18), 10798-10805 (2014).
  28. Hill, K., et al. Second generation nanoporous silicon nitride membranes for high toxin clearance and small format hemodialysis. Advanced Healthcare Materials. 9 (4), e1900750 (2020).
  29. Salminen, A. T., et al. Ultrathin dual-scale nano- and microporous membranes for vascular transmigration models. Small. 15 (6), e1804111 (2019).
  30. Gillmer, S. R., et al. Predicting the failure of ultrathin porous membranes in bulge tests. Thin Solid Films. 631, 152-160 (2017).
  31. Ishimatsu, R., et al. Ion-selective permeability of ultrathin nanopore silicon membrane as studied using nanofabricated micropipet probes. Analytical Chemistry. 82 (17), 7127-7134 (2010).
  32. Kim, E., et al. A structure-permeability relationship of ultrathin nanoporous silicon membrane: a comparison with the nuclear envelope. Journal of American Chemical Society. 130 (13), 4230-4231 (2008).
  33. Snyder, J. L., et al. An experimental and theoretical analysis of molecular separations by diffusion through ultrathin nanoporous membranes. Journal of Membrane Science. 369 (1-2), 119-129 (2011).
  34. McCloskey, M. C., et al. The modular µSiM: a mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), e2200804 (2022).
  35. Mansouri, M., et al. The modular microSiM reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), e2200802 (2022).
  36. Su, S. -H., et al. A tissue chip with integrated digital immunosensors: In situ brain endothelial barrier cytokine secretion monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115030 (2023).
  37. Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563 (2021).
  38. Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
  39. Gastfriend, B. D., Stebbins, M. J., Du, F., Shusta, E. V., Palecek, S. P. Differentiation of brain pericyte-like cells from human pluripotent stem cell-derived neural crest. Current Protocols. 1 (1), e21 (2021).
  40. Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
  41. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  42. Bechmann, I., Galea, I., Perry, V. H. What is the blood-brain barrier (not). Trends in Immunology. 28 (1), 5-11 (2007).

Tags

Bioteknologi utgave 203
Bruk av barrierevevsplattformen MicroSiM (μSiM) for modellering av blod-hjernebarrieren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCloskey, M. C., Kasap, P.,… More

McCloskey, M. C., Kasap, P., Trempel, M., Widom, L. P., Kuebel, J., Chen, K., Gaborski, T. R., Engelhardt, B., McGrath, J. L. Use of the MicroSiM (µSiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier. J. Vis. Exp. (203), e65258, doi:10.3791/65258 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter