Summary
Questo protocollo descrive lo sviluppo di un sistema modulare di micro-dispositivi controllabili che può essere applicato per la coltura e il monitoraggio a lungo termine dei coralli marini.
Abstract
I coralli sono organismi fondamentali negli ecosistemi marini e costieri. Con il progresso della ricerca sulla protezione dei coralli negli ultimi anni, il controllo preciso dell'ambiente di coltura dei coralli è molto richiesto per la conservazione e lo studio dei coralli. Qui, abbiamo sviluppato un sistema di micro-dispositivi di coltura di corallo semi-chiuso come piattaforma multifunzionale, in grado di fornire un controllo della temperatura accurato e programmabile, un ambiente iniziale sterile, una qualità dell'acqua stabile a lungo termine, una concentrazione di ossigeno disciolto regolabile e uno spettro di luce personalizzato per i coralli. Grazie al design modulare, il sistema di coltura del corallo può essere aggiornato o modificato installando nuovi moduli desiderabili o rimuovendo quelli esistenti. Attualmente, in condizioni appropriate e con un'adeguata manutenzione del sistema, i coralli campione possono sopravvivere per almeno 30 giorni in uno stato sano. Inoltre, grazie all'ambiente iniziale controllabile e sterile, questo sistema di coltura dei coralli può supportare la ricerca sulla relazione simbiotica tra i coralli e i microrganismi associati. Pertanto, questo sistema di micro-dispositivi può essere applicato per monitorare e studiare i coralli marini in modo relativamente quantitativo.
Introduction
Il deterioramento degli ecosistemi delle barriere coralline si è verificato in tutto il mondo negli ultimi 70 anni. Considerando tutte le principali aree coralline dell'America Centrale1, del Sud-Est asiatico 2,3,4,5,6, dell'Australia 7,8 e dell'Africa orientale9, la copertura globale delle barriere coralline si è dimezzata dagli anni '5010. Questa perdita di massa delle barriere coralline ha provocato problemi ecologici ed economici. Ad esempio, tracciando la presenza/assenza e l'abbondanza di tutti i tipi di pesci dipendenti dai coralli per 8 anni, i ricercatori hanno concluso che il declino dei coralli ha causato direttamente una sostanziale diminuzione della biodiversità e dell'abbondanza di pesci in Papua Nuova Guinea11. Questo risultato ha dimostrato che il declino dei coralli può non solo minare i sistemi biologici basati sulla barriera corallina, ma anche ridurre i redditi della pesca.
Nel corso di decenni di indagini sul campo, tra cui il monitoraggio diretto, il telerilevamento e il confronto dei dati, la comunità scientifica ha identificato diversi fattori che causano il declino di massa dei coralli. Una delle ragioni principali del declino di massa dei coralli è lo sbiancamento dei coralli causato dalle alte temperature dell'acqua di mare12,13. Combinando lo sbiancamento e le registrazioni meteorologiche, gli scienziati hanno concluso che lo sbiancamento dei coralli si sta verificando più frequentemente nelle fasi14 di El Niño-Southern Oscillation. Un'altra ragione del declino dei coralli è l'acidificazione degli oceani. A causa dell'aumento della concentrazione di CO2 sia nell'atmosfera che nell'acqua di mare, il carbonato di calcio si dissolve più velocemente di prima, causando la calcificazione della barriera corallina15. Infatti, si è concluso che quando la concentrazione di CO2 nell'atmosfera supera le 500 ppm, decine di milioni di persone soffriranno e le barriere coralline saranno a rischio di deterioramento significativo e distacco di simbiodinio16,17. Ci sono anche altri fattori che possono influenzare la sopravvivenza dei coralli, come gli inquinanti costieri che causano o accelerano il declino dei coralli. I ricercatori delle Hawaii hanno misurato gli isotopi di carbonio, ossigeno e azoto nei coralli, insieme al carbonato inorganico disciolto e ai relativi nutrienti (NH4+, PO4 3-, NO2 e NO3 −), e hanno concluso che l'inquinamento terrestre ha amplificato l'acidificazione costiera e la bioerosione deicoralli. Oltre all'inquinamento, l'urbanizzazione mette in pericolo anche la sopravvivenza dei coralli e causa una complessità architettonica relativamente bassa nei coralli, come rivelato da uno studio sullo stato di sopravvivenza dei coralli a Singapore, Giacarta, Hong Kong e Okinawa. Pertanto, l'impatto dei fattori di stress antropogenici e gli effetti sovrapposti del cambiamento climatico stanno portando a una diffusa riduzione della biodiversità sulle barriere coralline e a un conseguente declino della funzione ecologica e della resilienza dei coralli19.
Va anche notato che un gran numero di microrganismi partecipa alle funzioni fisiologiche dei coralli, tra cui la fissazione dell'azoto, la decomposizione della chitina, la sintesi di composti organici e l'immunità20, e questi microrganismi dovrebbero, quindi, essere inclusi quando si considera il deterioramento della barriera corallina. Negli ambienti naturali, come le barriere coralline, molti fattori causano condizioni ipossiche o anossiche, tra cui l'insufficiente circolazione dell'acqua, l'essudato algale e la crescita eccessiva di alghe. Questo fenomeno influisce negativamente sulla distribuzione della popolazione di coralli e dei microrganismi ad essi correlati. Ad esempio, gli scienziati vietnamiti hanno scoperto che a Nha Trang, Phu Quoc e Ujung Gelam, la composizione batterica del corallo Acropora Formosa potrebbe essere influenzata dall'ossigeno disciolto in diverse località21. I ricercatori negli Stati Uniti hanno esplorato le condizioni di ipossia o anossia nei coralli e hanno scoperto che gli essudati algali possono mediare l'attività microbica, portando a condizioni ipossiche localizzate, che possono causare la mortalità dei coralli nelle immediate vicinanze. Hanno anche scoperto che i coralli potevano tollerare concentrazioni di ossigeno ridotte, ma solo al di sopra di una determinata soglia determinata da una combinazione del tempo di esposizione e della concentrazione di ossigeno22. I ricercatori in India hanno scoperto che quando l'alga Noctiluca scintillans fioriva, l'ossigeno disciolto diminuiva a 2 mg/L. Al di sotto di questa concentrazione, circa il 70% di Acropora montiporacan moriva a causa di condizioni ipossiche23.
Tutti i fatti e i fattori sopra menzionati suggeriscono che il cambiamento ambientale porta al deterioramento delle barriere coralline. Per coltivare e studiare i coralli di barriera in determinate condizioni, è importante costruire in modo accurato e completo un ambiente microscopico controllabile per i coralli di barriera. Normalmente, gli scienziati si concentrano sulla temperatura, la luce, il flusso d'acqua e le sostanze nutritive. Tuttavia, altre caratteristiche, come la concentrazione di ossigeno disciolto, l'abbondanza di microrganismi e la diversità dei microrganismi nell'acqua di mare, sono comunemente ignorate. A tal fine, il nostro gruppo ha esplorato la possibilità di applicare piccole attrezzature per la coltura di polipi di corallo in un ambiente relativamente controllato24,25. In questo lavoro, abbiamo progettato e costruito un sistema modulare di micro-dispositivi per la coltura dei coralli. Questo sistema modulare di micro-dispositivi può fornire un micro-ambiente controllabile in termini di temperatura, spettro luminoso, concentrazione di ossigeno disciolto, sostanze nutritive e microrganismi, ecc. e ha la capacità di espansione e aggiornamento.
Moduli e funzioni del dispositivo
Il sistema di micro-dispositivi è stato ispirato dal sistemadi Berlino 26, ma nel sistema attuale non vengono utilizzate rocce vive. Come mostrato nella Figura 1, l'attuale sistema comprende sei moduli principali, due motopompe brushless, una pompa del gas, una lampada UV a flusso continuo, un alimentatore, alcuni componenti elettronici di controllo e i relativi cavi e viti. I sei moduli principali includono un modulo di stoccaggio dell'acqua di mare (con una pompa d'aria e un sensore di temperatura), un modulo di controllo della temperatura, un modulo di purificazione delle alghe, un modulo di purificazione microbica, un modulo di purificazione del carbone attivo e un modulo di coltura dei coralli.
Architettura del dispositivo
Come mostrato nella Figura 2 e nella Figura 3, l'intero sistema di microdispositivi può essere diviso orizzontalmente in due scomparti con un modulo di controllo della temperatura in mezzo. Per motivi di sicurezza, tutti i moduli e le parti contenenti acqua di mare sono collocati nello scomparto sinistro, denominato scomparto di coltura. Le altre parti elettroniche sono collocate nello scomparto destro, denominato scomparto elettronico. Entrambi gli scomparti sono sigillati o confezionati all'interno di gusci. Il modulo di controllo della temperatura è fissato in una piastra divisoria intermedia. Il guscio dello scomparto per colture comprende un battiscopa e tre piastre di fissaggio a vite. Questo design garantisce la tenuta del vano e facilita il funzionamento del sistema. Inoltre, la tenuta favorisce un controllo accurato della temperatura. La scocca del vano elettronico comprende un battiscopa, due piastre di fissaggio a vite e un pannello di controllo frontale.
Circolazione dell'acqua
Un circuito di circolazione dell'acqua di mare interno ed esterno collegato al modulo di accumulo dell'acqua di mare è stato pre-progettato. Il circuito di circolazione interno collega con successo il modulo di accumulo dell'acqua di mare, il modulo di controllo della temperatura, la lampada UV a flusso continuo, il modulo di purificazione delle alghe e il modulo di purificazione microbica. Questo circuito di circolazione ha lo scopo di fornire condizioni fisiochimiche e fisiologiche adeguate per l'acqua di mare per i coralli e non è necessaria alcuna manutenzione frequente. Il modulo di purificazione delle alghe contiene alghe Chaetomorpha , che assorbono i nutrienti extra (nitrati e fosfati) presenti nell'acqua. Il modulo di purificazione microbica contiene il substrato di coltura batterica, che coltiva il microbioma per trasferire nitriti e ammonio in nitrato per la purificazione dell'acqua. Tutti questi moduli devono essere sostituiti solo in circostanze critiche.
Il circuito di circolazione esterno collega successivamente il modulo di stoccaggio dell'acqua di mare, il modulo di coltura del corallo e il modulo del carbone attivo. Questo circuito di circolazione mira a fornire luce, tenuta, corrente d'acqua e alta qualità dell'acqua di mare ai coralli. L'acqua di mare può essere rinfrescata attraverso un ingresso e un'uscita dell'acqua. Gli additivi vengono aggiunti attraverso una valvola a tre vie e il campione di acqua di mare può anche essere estratto da questa valvola per l'ispezione. L'aria può essere pompata attraverso una presa d'aria e scaricata da un'uscita dell'aria.
Progettazione elettronica
Per l'intero sistema viene utilizzato un alimentatore a 220 V CA con un interruttore e un fusibile. La potenza in ingresso è suddivisa in quattro rami. Il primo ramo va a un alimentatore a 12 V CC, che alimenta direttamente il pannello riscaldante, il pannello di raffreddamento e la ventola di raffreddamento. Questo ramo alimenta anche indirettamente due pompe e due pannelli di illuminazione attraverso un trasformatore CC a quattro canali. Il secondo ramo va a un regolatore di temperatura PID. Il terzo ramo va all'alimentazione di una pompa ad aria. L'ultimo ramo si collega a un alimentatore per lampade UV. Un relè a stato solido collega il regolatore di temperatura PID e il pannello di raffreddamento nel modulo di controllo della temperatura. Un normale relè viene utilizzato per collegare il regolatore di temperatura PID e il pannello riscaldante. Il trasformatore CC a quattro canali converte la tensione in quella richiesta.
Ci sono due pannelli di controllo nella parte destra del sistema. Ci sono quattro interruttori e un controller per la lampada UV sul pannello superiore, inclusi un interruttore di alimentazione principale, un interruttore di alimentazione della lampada UV, un interruttore della pompa dell'aria e un interruttore di controllo della temperatura. L'interruttore di alimentazione principale controlla l'alimentazione a 12 V del sistema.
Sul pannello frontale sono presenti un regolatore di temperatura PID, un timer di ciclo, un trasformatore CC a quattro canali e un timer a tre canali. Il regolatore di temperatura PID regola la temperatura dell'acqua controllando i pannelli di riscaldamento e raffreddamento nel modulo di controllo della temperatura. Il modulo di controllo della temperatura funziona solo quando la pompa di circolazione interna è in funzione e l'acqua scorre oltre il modulo di controllo della temperatura. Il timer del ciclo è collegato alla linea di alimentazione della pompa dell'aria. Il suo scopo è quello di assegnare il periodo di tempo di lavoro alla pompa dell'aria. C'è anche un timer a tre canali distribuito nel vano elettronico. Questo timer controlla il periodo di lavoro per la pompa dell'aria, la luce dei coralli e la luce delle alghe.
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Protocol
I coralli utilizzati per il presente studio sono stati Seriatopora caliendrum, che vengono coltivati nel nostro laboratorio. Tutti i coralli sono stati gentilmente forniti dall'Istituto di Oceanologia del Mar Cinese Meridionale, Università dell'Accademia Cinese delle Scienze.
1. Ispezione e messa in funzione
NOTA: Ogni modulo deve essere testato per verificarne la tenuta e il funzionamento individualmente prima di assemblare il sistema. L'acqua deionizzata deve essere utilizzata per testare la tenuta del modulo. I dettagli commerciali di tutti i componenti del modulo sono forniti nella Tabella dei materiali.
- Prova di tenuta del collegamento tra moduli
- Collegare tutti i moduli e le pompe (Figura 1) e assicurarsi che l'acqua scorra circolarmente sul sistema per almeno 30 minuti.
- Controllare tutte le cuciture per possibili problemi di perdite. Se si verificano perdite in una qualsiasi delle cuciture di incollaggio, applicare la colla di incollaggio dall'esterno. Se si verificano perdite in una qualsiasi delle cuciture di connessione, serrare nuovamente la connessione e controllare se è necessario sostituire la guarnizione di tenuta.
- Caricamento
- Dopo la prova di tenuta, evacuare e asciugare l'acqua all'interno.
- Caricare il contenuto appropriato.
NOTA: Ad esempio, il substrato di coltura batterica viene caricato nel modulo di purificazione microbica e le alghe Chaetomorpha vengono caricate nel modulo di purificazione delle alghe.
- Assemblaggio e collaudo dell'intero sistema
- Dopo il caricamento, fissare i moduli sul battiscopa utilizzando le viti.
- Collegare i moduli di circolazione interna con quelli di circolazione esterna (senza il modulo di coltura del corallo).
- Per la perfusione dell'acqua di mare, iniettare l'acqua di mare attraverso l'ingresso dell'acqua nel modulo di accumulo dell'acqua di mare. Quando il livello dell'acqua è di 3 cm superiore agli ingressi dell'acqua delle pompe, accendere le pompe e continuare l'iniezione dell'acqua di mare fino a quando i moduli di circolazione interna sono pieni di acqua di mare, con spazio per l'aria (3 cm di altezza) nel modulo di accumulo dell'acqua di mare.
NOTA: L'acqua di mare viene preparata utilizzando acqua pura e sale marino (vedere la tabella dei materiali).
- Test di sistema
- Accendere tutti gli interruttori e impostare entrambe le tensioni della pompa dell'acqua di mare a 9 V. Impostare la temperatura dell'acqua a 25 °C.
- Impostare il timer del ciclo su "1 minuto acceso e 1 minuto spento". Impostare tutti e tre i canali del timer a tre canali su "9:00 am on" e "5:00 pm off".
- Monitorare il sistema per almeno 24 ore per eventuali malfunzionamenti. Se non viene rilevato alcun problema, il sistema è pronto per la fase successiva dell'operazione.
NOTA: È importante eliminare tutte le bolle in tutti i moduli ad eccezione del modulo di accumulo dell'acqua di mare. L'intero sistema può essere leggermente sollevato e agitato per spostare le bolle dall'ingresso del modulo all'uscita.
2. Creazione dell'ambiente microbico
NOTA: La creazione di un ambiente microbico favorevole ai coralli è necessaria prima del trapianto di corallo. Per coltivare i microrganismi nel sistema, in particolare nel modulo di purificazione microbica, è necessario aggiungere la soluzione probiotica diluita come fonte microbica per il sistema di nitrificazione.
- Aggiunta della fonte del microbioma
- Aggiungere 1 mL della soluzione di origine del microbioma commerciale (vedere la tabella dei materiali) in 500 mL di acqua di mare agitando.
- Iniettare 50 mL della soluzione diluita di cui sopra e 10 μL della soluzione commerciale per la nutrizione dei coralli (vedere la Tabella dei materiali) nel sistema di circolazione.
- Coltura del microbioma
- Accendi la pompa di circolazione interna e una pompa ad aria per coltivare il microbioma per 21 giorni. I requisiti del contenuto di ossigeno del microbioma determinano le proporzioni di accensione e spegnimento della pompa dell'aria.
NOTA: Questa fase mira a coltivare il microbioma di purificazione dell'acqua di mare e promuovere la crescita del microbioma benefico per i coralli nel sistema. In questo processo, l'acqua di mare inizia a diventare fangosa dal secondo al quarto giorno dopo l'iniezione del microbioma. Dopo questo processo di coltura del microbioma, è necessario stabilire la capacità di degradazione dei nutrienti nel sistema. Va notato che per soddisfare diversi requisiti sperimentali, è possibile utilizzare diverse fonti di microbioma per stabilire l'ambiente del microbioma.
- Accendi la pompa di circolazione interna e una pompa ad aria per coltivare il microbioma per 21 giorni. I requisiti del contenuto di ossigeno del microbioma determinano le proporzioni di accensione e spegnimento della pompa dell'aria.
3. Trapianto e crescita dei coralli
- Trapianto di corallo
- Tagliare i rami di corallo grezzo con squame di lunghezza di 3-5 cm, quindi far aderire questi rami di corallo su basi di supporto di corallo stampate in 3D (Supplementary Coding File 1).
- Rimetti questi campioni di rami di corallo nel serbatoio originale dell'acqua di mare per almeno 7 giorni per il recupero.
- Fissare la base di supporto in corallo sull'unità di rotazione con la colla. Assemblare il modulo di coltura del corallo e collegarlo al circuito di circolazione esterno.
- Imaging della crescita dei coralli
NOTA: Le immagini dei coralli nel tempo devono essere acquisite per valutare la crescita dei coralli. L'utilizzo di una connessione smontabile rende conveniente rimuovere il modulo di coltura del corallo dall'intero sistema per l'imaging. A tal fine, viene costruito un mini-studio fotografico con condizioni di illuminazione adeguate. Una macchina fotografica con un obiettivo macro (vedi la Tabella dei Materiali) viene utilizzata per catturare le morfologie della superficie corallina in diversi periodi. L'unità di rotazione del corallo nel modulo di coltura può essere azionata all'esterno del modulo utilizzando la modalità senza contatto. Ruotando la maniglia magnetica adiacente al modulo, è possibile acquisire immagini di corallo ad angolo intero.- Posiziona la fotocamera sulla parte superiore dello studio e cattura le immagini da una vista verticale.
- Posiziona il modulo di coltura del corallo nel mini-studio fotografico con il corallo posizionato al centro e in basso.
- Cattura le immagini del corallo ruotando la maniglia esterna.
NOTA: Per motivi di sopravvivenza dei coralli, il periodo di tempo per l'imaging deve essere limitato a 15 minuti.
4. Manutenzione ordinaria del sistema
NOTA: La manutenzione ordinaria include l'ispezione delle perdite, l'ispezione dei malfunzionamenti, l'aggiunta di additivi e la sostituzione dell'acqua di mare.
- Ispezione delle perdite
- Ispezionare il battiscopa per macchie d'acqua o goccioline. Poiché il guscio di copertura del sistema è trasparente, l'ispezione visiva della perdita d'acqua è facile e conveniente. Questa ispezione deve essere eseguita ogni giorno.
- Ispezione dei malfunzionamenti
- Assicurarsi che questo passaggio includa l'ispezione della temperatura dell'acqua, delle pompe, delle tensioni luminose, dello stato della pompa dell'aria e dello stato del timer, incluso il controllo visivo e la registrazione della temperatura dell'acqua impostata, della temperatura in tempo reale, delle tensioni di uscita del trasformatore, delle impostazioni della lampada UV e dello stato di funzionamento del timer. Questa ispezione deve essere eseguita ogni giorno.
NOTA: Alcuni malfunzionamenti del sistema possono essere diagnosticati in base a suoni anomali o temperature insolite.
- Assicurarsi che questo passaggio includa l'ispezione della temperatura dell'acqua, delle pompe, delle tensioni luminose, dello stato della pompa dell'aria e dello stato del timer, incluso il controllo visivo e la registrazione della temperatura dell'acqua impostata, della temperatura in tempo reale, delle tensioni di uscita del trasformatore, delle impostazioni della lampada UV e dello stato di funzionamento del timer. Questa ispezione deve essere eseguita ogni giorno.
- Aggiunta di additivi
NOTA: L'aggiunta di additivi è il processo di aggiunta di nutrienti e altri reagenti nel sistema.- Ad esempio, estrarre 10 ml di acqua di mare utilizzando una siringa dalla valvola a tre vie tra il modulo a carbone attivo e il modulo acqua di mare.
- Sciogliere gli additivi nell'acqua di mare estratta.
- Iniettare nuovamente la soluzione nel sistema attraverso la valvola a tre vie. Nei casi reali, i tipi, le quantità e le frequenze di aggiunta degli additivi sono decisi dalla qualità dell'acqua di mare del sistema, considerando i requisiti sperimentali.
- Ricambio d'acqua
NOTA: Lo scambio d'acqua di routine può ridurre la concentrazione tossica e l'eutrofizzazione nel sistema di coltura. Se le condizioni sperimentali lo consentono, lo scambio dell'acqua di mare può essere un'operazione di routine.- Spegnere l'alimentazione dell'intero sistema e scollegare il cavo di alimentazione per motivi di sicurezza.
- Rimuovere il modulo di coltura del corallo.
- Collegare la tubazione esterna delle acque reflue all'uscita nel modulo di accumulo dell'acqua di mare.
- Ruotare il sistema e posizionarlo con il lato anteriore rivolto verso il basso.
- Accendere la presa. Lasciare che l'acqua di mare interna fuoriesca dal sistema.
NOTA: Non utilizzare alcuna pompa per aspirare l'acqua poiché la pressione negativa interna potrebbe danneggiare il sistema. - Scaricare una quantità adeguata di acqua di mare e chiudere l'uscita. La quantità di acqua di mare scaricata è decisa dallo stato fisiologico dei coralli.
- Ripristinare il sistema e iniettare l'acqua di mare appena preparata nel sistema attraverso l'ingresso dell'acqua.
- Reinstallare il modulo di coltura del corallo nel sistema.
- Accendere il sistema e attendere che l'intero sistema torni alla normalità.
5. Sostituzione del modulo
NOTA: Se un modulo deve essere sostituito a causa di un malfunzionamento o secondo la disposizione sperimentale, è importante cambiare il modulo senza sospendere o influire negativamente sull'esperimento di coltura.
- Per il modulo di accumulo dell'acqua di mare, il modulo di purificazione delle alghe, il modulo di purificazione microbica o il modulo di purificazione a carbone attivo, spegnere la pompa di circolazione interna e allentare le viti di fissaggio del modulo.
- Scollegare le tubazioni tra i due moduli uniti e smontare il modulo da sostituire dal sistema. Il passaggio finale consiste nell'assemblare il nuovo modulo nel sistema collegando le tubazioni e serrando nuovamente le viti di fissaggio.
NOTA: La sostituzione del modulo di controllo della temperatura è in qualche modo diversa. Innanzitutto, tutti i cavi devono essere scollegati dal modulo. I bulloni di fissaggio vengono quindi svitati e le tubazioni vengono scollegate. Successivamente, il pannello riscaldante viene smontato e il modulo viene smontato dal sistema. Il processo di installazione del modulo di controllo della temperatura è il processo inverso.
6. Arresto del sistema e ripristino del sistema allo stato iniziale
NOTA: Il sistema verrà eventualmente spento dopo il necessario esperimento di coltura del corallo. Il sistema deve essere ripristinato al suo stato originale.
- Arresto del sistema
- Spegnere il sistema e scollegare il cavo di alimentazione.
- Evacuare l'acqua di mare all'interno del sistema.
- Smontare i moduli nel seguente ordine: il modulo di coltura del corallo, il modulo di purificazione del carbone attivo, il modulo di stoccaggio dell'acqua di mare, il modulo di purificazione delle alghe, il modulo di purificazione microbica, la lampada UV, le due pompe di circolazione e il modulo di controllo della temperatura.
- Ripristino del sistema
- Pulire tutti i moduli con acqua pura e tensioattivi (vedere la Tabella dei materiali).
- Sterilizzare i moduli con una soluzione di perossido di idrogeno al 3%.
NOTA: Non utilizzare solventi organici per lavare i moduli. - Asciugare i moduli a 40 °C per 12 ore. Assicurarsi che tutta l'acqua all'interno del sistema sia evaporata.
- Pulire tutte le tubazioni e le valvole utilizzando gli stessi tensioattivi.
7. Modifica per l'ambiente controllato del microrganismo
NOTA: A parte l'esperimento di coltura del corallo, per alcuni esperimenti speciali, come l'acquisizione di un ambiente di microrganismi controllati nel sistema, le specie e l'abbondanza del microbioma devono essere rigorosamente controllate. La caratteristica più innovativa del nostro sistema di coltura del corallo è che l'attività fisiologica del corallo può essere esplorata in uno specifico ambiente microbico in un microecosistema relativamente chiuso. L'esecuzione di questa funzione richiede una procedura operativa diversa.
- Pre-sterilizzazione
- Sterilizzare tutti i moduli, le tubazioni e le valvole utilizzando una soluzione di perossido di idrogeno al 3% prima di assemblare il sistema.
- Sterilizzare il substrato di coltura batterica in autoclave.
- Sterilizzare le alghe Chaetomorpha con una soluzione di etanolo al 75% e asciugarle con carta sterile.
- Modifica e sterilizzazione del sistema
- Durante l'assemblaggio del sistema, aggiungere un filtro di sterilizzazione dell'aria (vedere la tabella dei materiali) tra la pompa dell'aria e il modulo di accumulo dell'acqua di mare.
- Aggiungere un filtro sterilizzante per l'acqua tra l'ingresso e la valvola a tre vie. Questo passaggio garantisce la sterilizzazione dell'aria e dell'acqua iniettate nel sistema.
- Introdurre l'ozono nel sistema per eliminare il microbioma rimanente.
- Lavare via gli agenti disinfettanti rimanenti con acqua di mare sterile tre volte e iniettare l'acqua di mare sterile nel sistema.
- Solo per la creazione dell'ambiente microbico, iniettare la soluzione di origine del microbioma attraverso l'uscita dell'acqua.
NOTA: Non utilizzare l'ingresso dell'acqua per iniettare la fonte del microbioma. Altri reagenti e acqua di mare vengono ancora iniettati attraverso l'ingresso dell'acqua.
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Representative Results
Precisione del controllo della temperatura
La temperatura del sistema è normalmente impostata a 23-28 °C a seconda della specie di corallo. Tuttavia, essendo uno dei fattori più importanti, la fluttuazione della temperatura può influenzare fortemente la sopravvivenza dei coralli. Quindi, l'accuratezza del controllo della temperatura è un fattore decisivo per il sistema di coltura del corallo. Un sensore di temperatura e un raccoglitore di dati indipendente con un intervallo di temperatura da 9 °C a 32 °C possono essere utilizzati per testare l'accuratezza del controllo della temperatura nel modulo di coltura del corallo. Abbiamo impostato la temperatura dell'acqua di mare del sistema a 24 °C e misurato contemporaneamente la temperatura dell'acqua di mare e della stanza. Come mostrato nella Figura 4, la curva rossa rappresenta la fluttuazione della temperatura ambiente misurata e la curva nera rappresenta la fluttuazione della temperatura dell'acqua di mare misurata nel modulo di coltura del corallo. Nell'arco di 14 ore, la temperatura media misurata è stata di 23,8 °C e la deviazione standard è stata di 0,1 °C. Il controllo della temperatura dell'acqua di mare del sistema è stato relativamente accurato.
Risultato della coltura del corallo
Normalmente, il corallo sano estende liberamente i suoi tentacoli quando le condizioni ambientali soddisfano i requisiti di sopravvivenza del corallo, come mostrato nella Figura 5. Questo criterio generalmente verifica lo stato del corallo e può essere utilizzato per verificare la presenza di fattori di stress ambientale. Come mostrato nella Figura 5B, i tentacoli del corallo campione si sono estesi per oltre 1 mese senza essere disturbati. Ciò indica che il sistema ha fornito un ambiente di sopravvivenza adatto per il corallo per lungo tempo. Questo periodo di tempo di coltura dovrebbe essere abbastanza lungo per la maggior parte degli esperimenti e dei saggi sui coralli in laboratorio. Dalla Figura 5 si evince anche che è possibile eseguire l'analisi morfologica mediante l'imaging del processo di crescita dei coralli.
Figura 1: Collegamento schematico del modulo per il sistema di microdispositivi. I rettangoli arrotondati rappresentano moduli o pompe; Le linee della freccia rappresentano le condutture dell'acqua o dell'aria. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Vista frontale del sistema di microdispositivi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Vista dall'alto del sistema di microdispositivi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati sperimentali del controllo della temperatura dell'acqua di mare. Curva rossa: fluttuazione della temperatura ambiente; Curva nera: fluttuazione della temperatura dell'acqua di mare misurata dal sistema. La temperatura impostata del sistema era di 24 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Modulo di coltura del corallo con un'immagine ingrandita del corallo. (A) Per fare un confronto, quattro coralli sono stati localizzati sulle basi di supporto corrispondenti con uno vuoto nel modulo di coltura del corallo. (B) Un'immagine ingrandita del corallo Seriatopora caliendrum. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File di codifica supplementare 1: Progettazione per la stampa 3D di basi di supporto in corallo. Fare clic qui per scaricare il file.
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Discussion
Questo sistema di coltura dei coralli è progettato per simulare e fornire un microambiente relativamente naturale o personalizzato in cui i coralli possono essere trapiantati e sopravvivere. Nel frattempo, essendo un'apparecchiatura sviluppata internamente, questo sistema deve essere affidabile, facile da usare e sicuro. Ad esempio, in termini di controllo della temperatura, la temperatura dell'acqua di mare dovrebbe essere controllata in modo appropriato in base alle circostanze ambientali quotidiane. Il sistema è stato testato coltivando il corallo per 1 mese, confermando l'affidabilità del sistema.
Rispetto alle normali vasche marine o acquari26, sulla base del nostro esperimento di coltura del corallo, dopo aver impostato i parametri/condizioni di coltura, inclusa la formula dell'agente additivo, il piano di scambio dell'acqua, la velocità di circolazione (potenza o tensione della pompa), l'intensità dell'illuminazione, le proporzioni del tempo di accensione e spegnimento della pompa dell'aria e il tempo di illuminazione, il periodo di tempo per il servizio e il funzionamento quotidiani è inferiore a 10 minuti. Inoltre, durante questo periodo non si sono verificate perdite elettriche, cortocircuiti, sovraccarichi o altri incidenti, a dimostrazione della facilità d'uso e della sicurezza del sistema.
Tuttavia, va notato che l'ispezione del sistema, l'avvio, il trapianto/imaging dei coralli e la manutenzione ordinaria sono i passaggi essenziali e critici del protocollo. La perdita di acqua all'interno del dispositivo e l'invecchiamento delle parti del dispositivo potrebbero essere due problemi che possono verificarsi in un periodo di tempo relativamente lungo. I destinatari che desiderano replicare questo sistema devono occuparsi di questi problemi.
Dal punto di vista del micro-ecosistema artificiale, questa piattaforma modulare può essere dotata della capacità di studiare il microbioma associato ai coralli in un ambiente controllabile in laboratorio piuttosto che sul campo, dimostrando così la sua scalabilità ed economicità. Pertanto, si prevede che questo sistema di coltura del corallo aiuterà e accelererà gli studi relativi al corallo.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dai programmi di sviluppo chiave statali per la ricerca di base della Cina (2021YFC3100502).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12V DC power supply | Delixi Electric Co., Ltd. | CDKU-S150W | 12V12.5A |
| 3% hydrogen peroxide solution | Shandong ANNJET High tech Disinfection Technology Co., Ltd | NULL | NULL |
| 75% ethanol solution | Shandong ANNJET High tech Disinfection Technology Co., Ltd | NULL | NULL |
| Air pump | Chongyoujia Supply Chain Management Co., Ltd. | NHY-001 | NULL |
| Air sterilizing filter | Beijing Capsid Filter Equipment Co., Ltd | S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-A | NULL |
| Camera | SONY | Α7r4-ILCE-76M4A | NULL |
| Coral nutrition solution | Red Sea Aquatics Co., Ltd. | 22101 | Coral nutrition |
| Coral pro salt (sea salt) | Red Sea Aquatics Co., Ltd. | R11231 | NULL |
| Cycle timer | Leqing Shangjin Instrument Equipment Co., Ltd. | CN102A | 220V version |
| Double closed quick connector | JOSOT Co., Ltd | NL4-2103T | NULL |
| Flow-through UV lamp | Zhongshan Xinsheng Electronic technology Co., Ltd. | 211 | NULL |
| Four-channel transformer | Dongguan Shanggushidai Electronic Technology Co., Ltd | LM2596 | NULL |
| Macro lens | SONY | FE 90mm F2.8 Macro G OSS | NULL |
| Microbiome source solution | Guangzhou BIOZYM Microbial Technology Co., Ltd. | 303 | NULL |
| Mini-photo studio | Shaoxing Shangyu Photography Equipment Factory | CM-45 | NULL |
| PID temperature controller | Guangdong Dongqi Electric Co., Ltd. | TE9-SC18W | SSR version |
| Pump (for water) | Zhongxiang Pump Co., Ltd. | ZX43D | Seaswater version |
| Pure water machine | Kemflo (Nanjing) environmental technology Co, ltd | kemflo A600 | NULL |
| Solid-state relay | Delixi Electric Co., Ltd. | DD25A | NULL |
| Surface active agents | Guangzhou Liby Group Co., Ltd. | Libai detergent | NULL |
| Three-channel timer | Leqing Changhong Intelligent Technology Co., Ltd. | CHE325-3 | 220V version |
| Water sterilizing filter | Beijing Capsid Filter Equipment Co., Ltd | S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-L | NULL |
References
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