Summary
В этом исследовании описывается быстрый и эффективный метод анализа клеточных компонентов церебральных тромбов путем растворения сгустка, окрашивания клеток и рутинного исследования крови.
Abstract
Церебральный тромбоз, тромб в мозговой артерии или вене, является наиболее распространенным типом инфаркта головного мозга. Исследование клеточных компонентов церебральных тромбов важно для диагностики, лечения и прогноза. Однако современные подходы к изучению клеточных компонентов сгустков в основном основаны на окрашивании in situ , которое не подходит для комплексного изучения клеточных компонентов, так как клетки плотно завернуты в сгустки. Предыдущие исследования успешно выделили фибринолитический фермент (sFE) из Sipunculus nudus, который может разрушать сшитый фибрин напрямую, высвобождая клеточные компоненты. В данном исследовании был создан комплексный метод изучения клеточных компонентов церебрального тромба на основе sFE. Этот протокол включает в себя растворение сгустка, высвобождение клеток, окрашивание клеток и рутинный анализ крови. Согласно этому методу, компоненты клетки могут быть изучены количественно и качественно. Приведены репрезентативные результаты экспериментов с использованием данного метода.
Introduction
Цереброваскулярная болезнь является одним из трех основных заболеваний, которые могут угрожать здоровью человека, среди которых более 80% приходится на ишемическую цереброваскулярную болезнь. Церебральный тромбоз и тромбоз церебральных вен являются наиболее распространенными ишемическими цереброваскулярными заболеваниями на сегодняшний день, в основном вызываемыми церебральными тромбами 1,2. Если лечение не проводится должным образом, оно будет иметь высокие показатели инвалидности и смертности, а также высокую частоту рецидивовпосле выписки.
В последнее время все большее число исследований показало, что клеточные компоненты церебральных тромбов тесно коррелируют с диагностикой, лечением и прогнозом церебрального тромбоза 4,5,6. Поэтому наличие данных о составе тромба, особенно клеточных компонентов, имеет важное значение для клинической диагностики и лечения. К сожалению, имеющиеся в настоящее время методы не могут всесторонне проанализировать компонент тромба количественно и качественно. Например, окрашивание на основе Martius Scarlett Blue in situ позволяет исследовать только красные/белые кровяные тельца определенных срезов сгустка7. Окрашивание in situ на основе иммуногистохимии (ИГХ) позволяет изучать только ограниченные компоненты крови определенных срезов тромба с использованием их антител8. Методы, основанные на микроскопических изображениях, касаются только специфической структуры сгустка9. Более того, все эти способы трудоемки и отнимают много времени10. На сегодняшний день о процедурах количественного и качественного исследования церебральных тромбальных клеточных компонентов не сообщается. Широко признано, что сшитый фибрин плотно обволакивает клетки крови в сгустки11. Следовательно, специфическая деградация сшитого фибрина и высвобождение интактных клеток имеет решающее значение для точного анализа клеточных компонентов.
Предыдущие работы выделили фибринолитический фермент из Sipunculus nudus (sFE), который может специфически и быстро расщеплять фибрин12. В работе предложен метод анализа клеточных компонентов церебральных тромбов, основанный на уникальной активности sFE. В этом протоколе сначала использовали sFE для разрушения фибрина сгустков, а затем анализировали клеточные компоненты с помощью окрашивания по методу Райта и рутинного анализа крови13,14. Согласно этому методу, клеточные компоненты церебральных тромбов могут быть количественно и качественно изучены. Этот простой и эффективный протокол может быть применен для анализа клеточных компонентов других тромбов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование выполнено в соответствии с руководящими принципами Комитета по медицинской этике Университета Хуацяо. Тромбы головного мозга были удалены хирургическим путем и собраны в Первой больнице Цюаньчжоу, филиале Фуцзяньского медицинского университета, с информированного согласия пациентов.
1. Предварительная обработка сгустков крови
- Поместите сгустки на чистую посуду, добавьте пинцетом 5 мл физиологического раствора, аккуратно встряхните посуду и удалите физиологический раствор пипеткой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите полоскание три раза. - Разрежьте сгустки на более мелкие кусочки (размером менее 5 мм x 5 мм x 5 мм) ножницами. Добавьте 5 мл физиологического раствора, аккуратно встряхните посуду и удалите физиологический раствор пипеткой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите полоскание три раза. Следите за тем, чтобы во время полоскания не отсасывались сгустки. - Перенесите сгустки на другую чистую U-образную пластину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь (хранить пластину при температуре 2-8 °C) и возобновить позже.
2. Тромболизис
- Готовят рабочий раствор sFE, доводя концентрацию sFE до 2000 Ед/мл физиологическим раствором.
ПРИМЕЧАНИЕ: sFE был подготовлен в соответствии с хорошо зарекомендовавшими себя протоколами Tang Lab15. - Добавьте 300 мкл рабочего раствора sFE в предварительно обработанные сгустки.
- Выполните первый раунд деградации.
- Инкубируют смесь sFE и сгустков при 37 °C в течение 0,5 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блоттинг, обработанный физиологическим раствором, был установлен в качестве отрицательного контроля. Не вращайте образец на шейкере. - Аккуратно перемешайте пробу. Переложите жидкую часть в другую чистую пробирку с чистой пипеткой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшиеся сгустки были использованы для еще одного раунда разложения. - Центрифугируют жидкую часть при 200 × г в течение 5 мин при 4 °С.
- Переложите надосадочную жидкость в другую чистую пробирку с помощью пипетки, чтобы получить восстановленный раствор sFE.
- Осторожно смешайте клеточный осадок с 50 мкл физиологического раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная смесь хранилась при температуре 2-8 °C для последующего использования.
- Инкубируют смесь sFE и сгустков при 37 °C в течение 0,5 ч.
- Выполните последующую деградацию.
- Разлагают оставшиеся сгустки (этап 2.3.2) восстановленным раствором sFE (этап 2.3.4) при 37 °C в течение 0,5 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные этапы были такими же, как и в первом раунде деградации. Процесс разложения завершался до тех пор, пока не разлагались все сгустки.
- Разлагают оставшиеся сгустки (этап 2.3.2) восстановленным раствором sFE (этап 2.3.4) при 37 °C в течение 0,5 ч.
- Выполните сбор клеток.
- Подготовьте образец клеток крови, собрав клеточную смесь каждого раунда деградации.
3. Окрашивание Райта
- Выполняют мазок из клеток.
- Доведите клетки до плотности 1 x 106 клеток/мл.
- Добавьте 5 мкл клеток на предметное стекло с поли-L лизиновым покрытием, затем намажьте их с помощью покровного стекла.
- Выпарите жидкость комнатной температуры.
- Выполните окрашивание.
- Аккуратно добавьте 200 мкл красителя Райта (см. таблицу материалов) в клеточный мазок и добавьте 600 мкл красителя Райта B для равномерного смешивания. Окрашивать в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Аккуратно смойте краситель чистой водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенный клеточный мазок можно хранить при комнатной температуре для последующего использования.
- Выполните микроскопическую визуализацию.
- Осмотрите окрашенные клетки с помощью светового микроскопа (см. Таблицу материалов).
4. Плановое исследование крови
- Доведите клетки до плотности 1 x 106 клеток/мл.
- Анализ клеточных компонентов, таких как тромбоциты, эритроциты, лейкоциты, лимфоциты, нейтрофилы, моноциты, эозинофилы, базофилы и незрелые гранулоциты, с помощью аутогематологического анализатора в соответствии с инструкцией производителя (см. Таблицу материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На начальном этапе процесса деградации было установлено, что тромбы имели красную компактную структуру, а рабочий раствор был бесцветным. После инкубации в течение 30 мин рабочий раствор становился светло-красным, что указывало на то, что скрещенные клетки крови были высвобождены в рабочий раствор. Большинство сгустков растворялось при удлинении времени инкубации до 5 ч, а рабочий раствор становился светло-красным. Напротив, даже после 10-часовой инкубации не было выявлено существенных изменений в физиологической группе (НК) (рис. 1). Эти результаты показали, что клетки крови, заключенные в сгустки, были успешно высвобождены по этому протоколу.
После окрашивания по Райту клеточные компоненты были четко изучены под световым микроскопом (рис. 2А). Среди высвобожденных клеток крови можно было наблюдать большое количество зрелых эритроцитов со слегка вогнутыми и дискообразными поверхностями. На предметном стекле наблюдалось большое количество мелких фиолетово-красных частиц неправильной формы, которые представляли собой тромбоциты, высвобождающиеся из сгустков крови. Белые кровяные тельца демонстрировали большую плазму и конденсированную ядерную. Также наблюдалось несколько типов гранулоцитов, таких как зрелые нейтрофильные гранулоциты, эозинофилы и моноциты.
С помощью автогематологического анализатора количественно анализировали клеточные компоненты. Среди обнаруженных клеток тромбоциты и эритроциты составили 51,25% и 45,24% соответственно. Эти данные согласуются с результатами окрашивания Райта. Также были обнаружены другие клетки крови, такие как лейкоциты, лимфоциты, нейтрофилы, моноциты, эозинофилы, базофилы и незрелые гранулоциты (табл. 1). Таким образом, следуя этому протоколу, клеточные компоненты церебрального тромба могут быть изучены не только качественно, но и количественно.
Рисунок 1: Процесс растворения. Церебральный тромб растворяли в физиологическом растворе (NC) и sFE соответственно. Фотография была сделана в 0 ч, 5 ч и 10 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Микроскопия и проточная цитометрия высвобожденных клеток . (А) Клетки под микроскопом после окрашивания по Райту. Масштабная линейка = 20 мкм. (B) Результаты проточной цитометрии высвобожденных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Обычный анализ крови | ||
| Параметры | Результаты | Единица |
| Абсолютное число незрелых гранулоцитов (IG#) | 1 | 109/л |
| Процент незрелых гранулоцитов (IG%) | 3.7 | % |
| Количество эритроцитов (эритроциты) | 1.52 | 1012/л |
| Удельный объем эритроцитов (HCT) | 13.7 | % |
| Средний объем эритроцитов (MCV) | 90.1 | Ф1 |
| Количество лейкоцитов (WBC) | 26.98 | 109/л |
| Количество лимфоцитов (LYM) | 1.41 | 109/л |
| Процент лимфоцитов (LYM%) | 5.2 | % |
| Количество нейтрофилов (Neu#) | 24.08 | 109/л |
| Процент нейтрофилов (Neu%) | 89.2 | % |
| Количество моноцитов (Mon#) | 1.02 | 109/л |
| Процент моноцитов (Mon%) | 3.8 | % |
| Количество эозинофилов (Eos#) | 0.34 | 109/л |
| Процент эозинофилов (Eos%) | 1.3 | % |
| Количество базофилов (Bas#) | 0.13 | 109/л |
| Процентное содержание базофилов (Bas%) | 0.5 | % |
| количество тромбоцитов (PLT) | 1722 | 109/л |
| Средний объем тромбоцитов (MPV) | 11.6 | Ф1 |
Таблица 1: Рутинный анализ крови.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
sFE является фибринолитическим агентом, который может непосредственно и эффективно разрушать фибрин12,16. Здесь sFE использовали для разрушения сшитого фибрина церебральных тромбов, высвобождения заключенных клеток внутри сгустков и качественного и количественного анализа клеточных компонентов сгустков. Данные микроскопии и рутинного исследования крови показали, что заключенные клетки были высвобождены из сгустков крови. Кроме того, типы клеток и структуры высвобожденных клеток не подвергались существенному влиянию после лечения sFE. Таким образом, впервые был создан уникальный, простой и эффективный метод анализа клеточных компонентов церебральных тромбов.
Поскольку высвобожденные клетки не так стабильны, как в сгустках, условия деградации должны быть оптимизированы для уменьшения нарушенного соотношения высвобожденных клеток, таких как температура, доза sFE, скорость вращения и время деградации. Результаты окрашивания Райта показали, что фон деградации через 10 часов был более мутным, чем через 5 часов. Эти различия, вероятно, связаны с клеточным мусором и другими фрагментами клеток. Более того, данные проточной цитометрии показали, что клеточный мусор увеличивается со временем деградации (рис. 2B). Скорость разложения клеточных остатков через 10 ч (32,5%) была значительно выше, чем при 5-часовой деградации (11,2%). Поэтому было крайне важно как можно скорее отделить выделившиеся клетки от рабочего раствора. Так, в этом исследовании клетки собирали каждые 0,5 часа. Другим ключевым моментом было вращение, которое может ускорить деградацию, но плохо для сохранения неповрежденной клеточной структуры высвобожденных клеток.
Несмотря на то, что условия деградации были оптимизированы, некоторые клетки могут быть лизированы в этом процессе. Клеточный мусор может быть неблагоприятным для клеточной микроскопии и рутинного исследования крови17. Поэтому рекомендуется отделять эти клеточные остатки от неповрежденных клеток. Еще одним ограничением этого метода является возможность микробного загрязнения. Основной причиной этого явления, вероятно, является длительное время деградации в сочетании с нестерильной операцией. Таким образом, некоторые подходящие антибиотики должны быть добавлены в будущих исследованиях18. Хорошо известно, что разные тромбы имеют схожую структуру. Таким образом, протокол, представленный здесь, будет пригоден для анализа клеточных компонентов других тромбов. Более того, с помощью этой методики можно качественно и количественно проанализировать не только клеточные компоненты, но и плазму со сгустками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Бюро науки и технологий города Сямынь (3502Z20227197) и Бюро науки и технологий провинции Фуцзянь (No 2019J01070, No 2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
- Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
- Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
- Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
- Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
- Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
- Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
- Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
- Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536 (2021).
- Abbasi, M., et al. Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization. Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).
- C W Francis, a, Marder, V. J.
- Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. , https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Fotso Fotso, A., Drancourt, M. Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments. Front Public Health. 3, 254 (2015).
- Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446 (2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. Journal of Visualized Experiments. 196, e65631 (2023).
- Ge, Y. H., et al. A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus. International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).
- Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).
