Summary
Este estudio describe un método rápido y eficaz para el análisis de componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrales a través de la disolución de coágulos, la tinción celular y el examen de sangre de rutina.
Abstract
La trombosis cerebral, un coágulo de sangre en una arteria o vena cerebral, es el tipo más común de infarto cerebral. El estudio de los componentes celulares de los coágulos sanguíneos cerebrales es importante para el diagnóstico, el tratamiento y el pronóstico. Sin embargo, los enfoques actuales para estudiar los componentes celulares de los coágulos se basan principalmente en la tinción in situ , que no es adecuada para el estudio exhaustivo de los componentes celulares porque las células están firmemente envueltas en los coágulos. Estudios anteriores han aislado con éxito una enzima fibrinolítica (sFE) de Sipunculus nudus, que puede degradar la fibrina reticulada directamente, liberando los componentes celulares. Este estudio estableció un método integral basado en el sFE para estudiar los componentes celulares del trombo cerebral. Este protocolo incluye la disolución de coágulos, la liberación de células, la tinción de células y el examen de sangre de rutina. De acuerdo con este método, los componentes celulares podrían estudiarse cuantitativa y cualitativamente. Se muestran los resultados representativos de los experimentos realizados con este método.
Introduction
La enfermedad cerebrovascular es una de las tres principales enfermedades que pueden amenazar la salud humana, entre las cuales la enfermedad cerebrovascular isquémica representa más del 80%. La trombosis cerebral y la trombosis venosa cerebral son las enfermedades cerebrovasculares isquémicas más preocupantes en la actualidad, causadas principalmente por coágulos sanguíneos cerebrales 1,2. Si el tratamiento no se realiza adecuadamente, tendrá altas tasas de discapacidad y mortalidad y una alta tasa de recurrencia después del alta3.
Recientemente, un número creciente de estudios ha demostrado que los componentes celulares de los coágulos sanguíneos cerebrales están estrechamente correlacionados con el diagnóstico, tratamiento y pronóstico de la trombosis cerebral 4,5,6. Por lo tanto, la disponibilidad de datos sobre la composición de los trombos, especialmente los componentes celulares, es importante para el diagnóstico clínico y el tratamiento. Desafortunadamente, los métodos disponibles actualmente no pueden analizar exhaustivamente el componente del coágulo de sangre cuantitativa y cualitativamente. Por ejemplo, la tinción in situ basada en Martius Scarlett Blue solo puede estudiar los glóbulos rojos/blancos de ciertas rebanadas del coágulo7. La tinción in situ basada en la inmunohistoquímica (IHQ) solo puede estudiar componentes sanguíneos limitados de ciertos cortes del coágulo utilizando sus anticuerpos8. Los métodos basados en imágenes microscópicas solo se ocupan de la estructura específica del coágulo9. Además, todos estos métodos son laboriosos y requieren mucho tiempo10. Hasta la fecha, no se han descrito los procedimientos para estudiar cuantitativa y cualitativamente los componentes de las células trombos cerebrales. Es ampliamente reconocido que la fibrina reticulada envuelve firmemente las células sanguíneas en los coágulos11. En consecuencia, la degradación específica de la fibrina reticulada y la liberación de las células intactas es fundamental para el análisis preciso de los componentes celulares.
Trabajos previos aislaron una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE), que puede degradar la fibrina de manera específica y rápida12. En este trabajo, se propuso un método para analizar los componentes celulares de los trombos cerebrales basado en la actividad única de sFE. Este protocolo utilizó sFE para degradar primero la fibrina de los coágulos y luego analizó los componentes celulares mediante tinción de Wright y análisis de sangre de rutina13,14. De acuerdo con este método, los componentes celulares de los trombos cerebrales pueden ser estudiados cuantitativa y cualitativamente. Este protocolo simple y efectivo podría aplicarse para el análisis de componentes celulares de otros coágulos sanguíneos.
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Protocol
La investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales del Comité de Ética Médica de la Universidad de Huaqiao. Los coágulos sanguíneos cerebrales se extirparon quirúrgicamente y se recogieron en el Primer Hospital de Quanzhou, afiliado a la Universidad Médica de Fujian, con el consentimiento informado de los pacientes.
1. Pretratamiento de coágulos de sangre
- Coloque los coágulos en un plato limpio, agregue 5 ml de solución salina fisiológica con una pinza, agite el plato suavemente y retire la solución salina con una pipeta.
NOTA: Repita el enjuague tres veces. - Corta los coágulos en trozos más pequeños (menos de 5 mm x 5 mm x 5 mm) con una tijera. Añadir 5 ml de solución salina fisiológica, agitar el plato suavemente y retirar la solución salina con una pipeta.
NOTA: Repita el enjuague tres veces. Asegúrese de que no se aspiren trozos de coágulos durante el enjuague. - Transfiera los coágulos a otra placa en U limpia.
NOTA: El protocolo puede pausarse aquí (almacenar la placa a 2-8 °C) y reiniciarse más tarde.
2. Trombólisis
- Prepare la solución de trabajo de sFE ajustando la concentración de sFE a 2000 U/mL con solución salina fisiológica.
NOTA: El sFE se preparó de acuerdo con los protocolos bien establecidos de Tang Lab15. - Añadir 300 μL de solución de trabajo de sFE en los coágulos pretratados.
- Realice la primera ronda de degradación.
- Incubar la mezcla de sFE y coágulos a 37 °C durante 0,5 h.
NOTA: El blot tratado con suero fisiológico se estableció como control negativo. No gire la muestra sobre el agitador. - Mezcle la muestra suavemente. Transfiera la parte líquida a otro tubo limpio con una pipeta limpia.
NOTA: Los coágulos restantes se utilizaron para otra ronda de degradación. - Centrifugar la parte líquida a 200 × g durante 5 min a 4 °C.
- Transfiera el sobrenadante a otro tubo limpio con una pipeta para obtener la solución de sFE recuperada.
- Mezclar suavemente la precipitación celular con 50 μL de solución salina fisiológica.
NOTA: La mezcla de células se almacenó a 2-8 °C para su uso posterior.
- Incubar la mezcla de sFE y coágulos a 37 °C durante 0,5 h.
- Realice la degradación posterior.
- Degradar los coágulos restantes (paso 2.3.2) con la solución de sFE recuperada (paso 2.3.4) a 37 °C durante 0,5 h.
NOTA: Los pasos de descanso fueron los mismos que en la primera ronda de degradación. El proceso de degradación se terminaba hasta que se degradaban todos los coágulos.
- Degradar los coágulos restantes (paso 2.3.2) con la solución de sFE recuperada (paso 2.3.4) a 37 °C durante 0,5 h.
- Realice la recolección de células.
- Prepare la muestra de células sanguíneas recogiendo la mezcla celular de cada ronda de degradación.
3. Tinción de Wright
- Realizar frotis celular.
- Ajuste las celdas a una densidad de 1 x 106 células/ml.
- Agregue 5 μL de las células al portaobjetos de vidrio recubierto de poli-L lisina, luego úntelas con el cubreobjetos.
- Evapora el líquido a temperatura ambiente.
- Realice la tinción.
- Agregue 200 μL de colorante de Wright (consulte la Tabla de materiales) al frotis celular suavemente y agregue 600 μL de colorante B de Wright para mezclar uniformemente. Tiñir durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Enjuaga el tinte suavemente con agua limpia.
NOTA: El frotis de células teñidas se puede almacenar a temperatura ambiente para su uso posterior.
- Realizar imágenes microscópicas.
- Examine las células teñidas con un microscopio óptico (consulte la Tabla de materiales).
4. Examen de sangre de rutina
- Ajuste las celdas a una densidad de 1 x 106 células/ml.
- Analice los componentes celulares como plaquetas, eritrocitos, glóbulos blancos, linfocitos, neutrófilos, monocitos, eosinófilos, basófilos y granulocitos inmaduros utilizando un analizador de autohematología de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales).
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Representative Results
En la etapa inicial del proceso de degradación, se encontró que los coágulos de sangre tenían una estructura compacta roja y la solución de trabajo era incolora. Después de la incubación durante 30 minutos, la solución de trabajo se volvió de color rojo claro, lo que indicaba que las células sanguíneas cruzadas se liberaron en la solución de trabajo. La mayoría de los coágulos se disolvieron al alargar el tiempo de incubación a 5 h, y la solución de trabajo se volvió de color rojo claro. Por el contrario, no hubo cambios significativos en el grupo fisiológico de solución salina (NC) incluso después de 10 h de incubación (Figura 1). Estos resultados mostraron que las células sanguíneas encerradas en los coágulos se liberaron con éxito gracias a este protocolo.
Después de la tinción de Wright, los componentes celulares se examinaron claramente bajo un microscopio óptico (Figura 2A). Entre las células sanguíneas liberadas, se pudo observar un gran número de glóbulos rojos maduros con superficies ligeramente cóncavas y en forma de disco. En el portaobjetos de vidrio se observó una gran cantidad de pequeñas partículas de color rojo púrpura de forma irregular, que eran las plaquetas liberadas de los coágulos de sangre. Los glóbulos blancos exhibieron plasma más grande y nuclear condensado. También se observaron varios tipos de granulocitos, como granulocitos neutrófilos maduros, eosinófilos y monocitos.
Con la ayuda de un analizador de hematología automático, los componentes celulares se analizaron cuantitativamente. Entre las células detectadas, las plaquetas y los eritrocitos representaron el 51,25% y el 45,24%, respectivamente. Estos datos son consistentes con los resultados de la tinción de Wright. También se detectaron otras células sanguíneas, como glóbulos blancos, linfocitos, neutrófilos, monocitos, eosinófilos, basófilos y granulocitos inmaduros (Tabla 1). Así, siguiendo este protocolo, se pueden estudiar los componentes celulares de un trombo cerebral no solo cualitativamente sino también cuantitativamente.
Figura 1: Proceso de disolución. El trombo cerebral se disolvió en la solución salina (NC) y en el sFE, respectivamente. La fotografía se tomó a las 0 h, 5 h y 10 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Microscopía y citometría de flujo de las células liberadas . (A) Las células bajo el microscopio después de la tinción de Wright. Barra de escala = 20 μm. (B) Resultados de la citometría de flujo de las células liberadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Análisis de sangre de rutina | ||
| Parámetros | Resultados | Unidad |
| Número absoluto de granulocitos inmaduros (IG#) | 1 | 109/L |
| Porcentaje de granulocitos inmaduros (IG%) | 3.7 | % |
| Recuento de eritrocitos (RBC) | 1.52 | 1012/L |
| Volumen específico de glóbulos rojos (HCT) | 13.7 | % |
| Volumen corpuscular medio (VCM) | 90.1 | F1 |
| Número de glóbulos blancos (WBC) | 26.98 | 109/L |
| Número de linfocitos (LYM) | 1.41 | 109/L |
| Porcentaje de linfocitos (LYM%) | 5.2 | % |
| Número de neutrófilos (Neu#) | 24.08 | 109/L |
| Porcentaje de neutrófilos (Neu%) | 89.2 | % |
| Número de monocitos (Mon#) | 1.02 | 109/L |
| Porcentaje de monocitos (Món%) | 3.8 | % |
| Número de eosinófilos (Eos#) | 0.34 | 109/L |
| Porcentaje de eosinófilos (Eos%) | 1.3 | % |
| Número de basófilos (Bas#) | 0.13 | 109/L |
| Porcentaje de basófilos (Bas%) | 0.5 | % |
| recuento de plaquetas (PLT) | 1722 | 109/L |
| Volumen plaquetario medio (VPM) | 11.6 | F1 |
Tabla 1: Examen de sangre de rutina.
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Discussion
El sFE es un agente fibrinolítico que puede degradar la fibrina de forma directa y eficaz12,16. Aquí, el sFE se empleó para degradar la fibrina reticulada de los coágulos sanguíneos cerebrales, liberar las células encerradas dentro de los coágulos y analizar los componentes celulares de los coágulos cualitativa y cuantitativamente. Los datos de la microscopía y el examen de sangre de rutina indicaron que las células encerradas se liberaron de los coágulos de sangre. Además, los tipos celulares y las estructuras de las células liberadas no se vieron afectados significativamente después del tratamiento con sFE. Por lo tanto, se creó por primera vez un método único, simple y efectivo para analizar los componentes celulares de los coágulos sanguíneos cerebrales.
Debido a que las células liberadas no son tan estables como dentro de los coágulos, las condiciones de degradación deben optimizarse para disminuir la proporción rota de células liberadas, como la temperatura, la dosis de sFE, la velocidad de rotación y el tiempo de degradación. Los resultados de la tinción de Wright mostraron que el fondo de la degradación de 10 h era más turbio que el de 5 h. Estas diferencias se deben probablemente a los restos celulares y otros fragmentos celulares. Además, los datos de citometría de flujo indicaron que los restos celulares aumentaron con el tiempo de degradación (Figura 2B). La tasa de residuos celulares de 10 h de degradación (32,5%) fue significativamente mayor que la de 5 h de degradación (11,2%). Por lo tanto, era fundamental separar las células liberadas de la solución de trabajo lo antes posible. Por lo tanto, en este estudio, las células se recolectaron cada 0,5 h. Otro punto clave fue la rotación, que podría acelerar la degradación, pero es mala para mantener intacta la estructura celular de las células liberadas.
Aunque las condiciones de degradación se han optimizado, algunas células pueden ser lisadas en este proceso. Los restos celulares pueden ser adversos para la microscopía celular y el examen de sangre de rutina17. Por lo tanto, se recomienda separar esos restos celulares de las células intactas. Otra limitación de esta técnica es la posibilidad de contaminación microbiana. La razón subyacente de este fenómeno es probablemente el largo tiempo de degradación en combinación con la operación no estéril. Por lo tanto, algunos antibióticos adecuados deben ser añadidos en futuros estudios18. Es bien sabido que los diferentes coágulos de sangre comparten estructuras de coágulos similares. Por lo tanto, el protocolo aquí reportado será adecuado para el análisis de componentes celulares de otros coágulos sanguíneos. Además, con la ayuda de esta técnica, no solo se pudieron analizar cualitativa y cuantitativamente los componentes celulares, sino también el plasma con los coágulos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por la Oficina de Ciencia y Tecnología de la ciudad de Xiamen (3502Z20227197) y la Oficina de Ciencia y Tecnología de la provincia de Fujian (No. 2019J01070, No.2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
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