Summary
A imagem por imunofluorescência é limitada pela capacidade de observar processos biológicos complexos e dependentes do tempo em apenas um único instantâneo no tempo. Este estudo descreve uma abordagem de imagem ao vivo conduzida em cortes de glândula submandibular de camundongos com corte preciso. Esta abordagem permite a observação em tempo real das interações célula-célula durante a homeostase e os processos de regeneração e reparo.
Abstract
A regeneração das glândulas salivares é um processo complexo que envolve intrincadas interações entre vários tipos celulares. Estudos recentes têm lançado luz sobre o papel fundamental desempenhado pelos macrófagos na condução da resposta regenerativa. No entanto, nossa compreensão desse papel crítico tem se baseado principalmente em visões estáticas obtidas de biópsias teciduais fixas. Para superar essa limitação e obter informações sobre essas interações em tempo real, este estudo delineia um protocolo abrangente para cultivar tecido de glândulas salivares ex vivo e capturar imagens vivas da migração celular.
O protocolo envolve várias etapas principais: primeiro, o tecido da glândula salivar submandibular de camundongos é cuidadosamente fatiado usando um vibratótomo e, em seguida, cultivado em uma interface ar-líquido. Essas fatias podem ser intencionalmente lesadas, por exemplo, pela exposição à radiação, para induzir dano celular e desencadear a resposta regenerativa. Para rastrear células específicas de interesse, elas podem ser marcadas endogenamente, por exemplo, utilizando tecido de glândula salivar coletado de camundongos geneticamente modificados onde uma determinada proteína é marcada com proteína fluorescente verde (GFP). Alternativamente, anticorpos fluorescentemente conjugados podem ser empregados para corar células que expressam marcadores específicos de superfície celular de interesse. Uma vez preparados, os cortes de glândulas salivares são submetidos a imagens ao vivo usando um sistema de imagem confocal de alto conteúdo durante uma duração de 12 h, com imagens capturadas em intervalos de 15 min. As imagens resultantes são então compiladas para criar um filme, que pode ser posteriormente analisado para extrair parâmetros valiosos do comportamento celular. Este método inovador fornece aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para investigar e entender melhor as interações de macrófagos dentro da glândula salivar após lesão, avançando assim nosso conhecimento dos processos regenerativos em jogo neste contexto biológico dinâmico.
Introduction
Os macrófagos têm demonstrado desempenhar papéis cada vez mais importantes nos processos de regeneração e reparo, estendendo-se além de sua função imune clássica 1,2. De fato, os macrófagos estão envolvidos em uma infinidade de processos relacionados à regeneração, exibindo atividade regulatória crítica em todos os estágios do reparo, bem como na formação de cicatrizes efibrose3,4. Macrófagos residentes em tecidos são tipos celulares altamente heterogêneos com mecanismos complexos que conduzem diversos fenótipos celulares, e desempenham papéis essenciais no desenvolvimento, função e homeostase de órgãos (conforme revisado em5). Os macrófagos residentes no tecido surgem inicialmente a partir de precursores no saco vitelínico e no fígado fetal e, posteriormente, são substituídos por proliferação ou por monócitos sanguíneos derivados da medula óssea em taxas variáveis, dependendo da longevidade dos macrófagos existentes e do tecido ou nicho em que residem 6,7.
É importante ressaltar que os macrófagos residentes no tecido estão dispersos por todos os tecidos e contribuem para diversas funções do órgão. Eles são programados exclusivamente por seu microambiente para executar funções específicas de nicho. Por essa razão, a localização dos macrófagos no interior do tecido oferece informações sobre sua função, com populações únicas observadas no pulmão, glândula mamária, intestino, pele e músculo 8,9,10. Durante o desenvolvimento da glândula mamária, os macrófagos ductais estão intimamente associados à árvore ductal, e sua depleção resulta em ramificação significativamente reduzida11. Além disso, macrófagos são necessários para a morfogênese durante a puberdade e alveologênese na gestação, onde monitoram ativamente o epitélio. Na lesão muscular, uma população específica de macrófagos "habita" dentro do local da lesão, fornecendo um nicho transitório no qual eles fornecem pistas induzidas pela proliferação necessárias para a proliferação de células-tronco. Assim, eles exibem o papel especializado de populações distintas de macrófagos na regulação do processo de reparo2. No pulmão, um fenômeno semelhante ocorre quando macrófagos intersticiais primam por células alveolares tipo II (AT2) que expressam interleucina (IL)-R1 para conversão em progenitores transitórios associados a danos por meio da liberação de IL-1B12. Além disso, pesquisas recentes mostraram que macrófagos são essenciais para a regeneração da glândula salivar submandibular (SMG) de camundongos após lesão por irradiação e, na sua ausência, a regeneração epitelial é interrompida13. Em conjunto, esses dados destacam a importância da ativação e função de macrófagos em nichos inflamatórios transitórios após lesão tecidual, bem como durante a homeostase.
Os macrófagos são células ativas e suas funções envolvem interações com uma variedade de diferentes tipos celulares, incluindo o contato direto célula-célula14,15, bem como métodos mais indiretos, como a secreção de fatores solúveis 2,16, que são essenciais para a regulação de nicho. Embora a imagem imunofluorescente clássica seja útil para começar a desvendar essas interações, ela é limitada por retratar apenas um único instantâneo no tempo, omitindo assim numerosos pontos críticos para um processo regenerativo altamente dinâmico17,18. À medida que a importância do tempo e o surgimento de diferentes ondas de regeneração entram em foco mais nítido, é essencial dissecar esses processos com mais detalhes.
A radioterapia é um tratamento que salva vidas para muitas pessoas diagnosticadas com câncer. Embora muitas vezes eficaz em encolher ou eliminar o(s) tumor(es), a radioterapia também pode danificar tecidos saudáveis que se encontram no campo de radiação e provocar uma resposta imune. A lesão por radiação pode induzir rápido recrutamento de macrófagos e respostas imunomoduladoras diretas e indiretas19,20. As glândulas salivares são frequentemente irradiadas inadvertidamente durante o tratamento do câncer de cabeça e pescoço21,22, levando a dano epitelial, atrofia celular e fibrose 23,24, resultando em xerostomia ou boca seca crônica25.
A glândula salivar é composta por uma infinidade de tipos celulares e estruturas, incluindo, mas não se limitando a, células epiteliais (tanto células acinares produtoras de saliva quanto células ductais transportadoras de saliva), células mioepiteliais, células progenitoras epiteliais, nervos, vasos sanguíneos, células imunes, fibroblastos e matriz extracelular (MEC). O papel e a resposta de muitos desses tipos celulares na resposta regenerativa foram previamente descritos 26,27,28,29,30. No entanto, como essas diferentes células interagem durante a homeostase e regeneração, e particularmente como as células imunes, como os macrófagos, se comportam, é menos bem estudado. Este manuscrito descreve um método recentemente estabelecido para estudar as interações vivas entre macrófagos SMG e outras células de interesse em tecido ex vivo. O SMG é fatiado em um vibratome, corado para marcadores de superfície e fotografado por até 12 h. Usando este método, a fagocitose das células vizinhas pelos macrófagos pode ser observada, a cinética de migração de macrófagos pode ser estudada e as interações diretas célula-célula entre macrófagos e células epiteliais podem ser demonstradas.
Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Ministério do Interior do Reino Unido e realizados sob as LPPs PB5FC9BD2 e PP0330540. Todos os experimentos estão alinhados às diretrizes do ARRIVE e da Universidade de Edimburgo.
Camundongos selvagens foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais). Krt14CreER; Camundongos R26mTmG foram criados em casa, cruzando camundongos Krt14CreER/+ 31 com camundongos R26mTmG/mTmG 32. Em todos os experimentos, camundongos fêmeas de 8-10 semanas de idade foram utilizados.
1. Coleta e incorporação do SMG
- Eutanasiar os camundongos/camundongos, expondo-os a uma concentração crescente de dióxido de carbono (CO2). Em seguida, pulverizar a área da incisão com etanol 70% (EtOH) e usar tesoura e pinça para dissecar cuidadosamente a(s) SMG(s) do tecido circundante (Figura 1A). Remova qualquer gordura e tecido conjuntivo usando pinças e coloque a glândula em um tubo de coleta contendo solução salina balanceada de Hanks gelada (HBSS, ver Tabela de Materiais).
- Separe a glândula em pedaços medindo aproximadamente 1 cm2 cada usando pinças.
- Aqueça 4% de agarose a 50 °C e, em seguida, despeje-a diretamente em um prato de 35 mm.
- Despeje uma pequena quantidade de agarose derretida a 50 °C em um prato separado e lave bem a glândula, movendo-a em torno do excesso de agarose.
NOTA: Esta etapa é necessária para remover o excesso de líquido das glândulas. Um excesso de líquidos pode impedir que as glândulas aderam adequadamente à agarose. - Posicionar 4-6 pedaços da glândula na agarose, garantindo que fiquem planos e no mesmo plano (Figura 1A).
NOTA: Certifique-se de que as glândulas não tocam a superfície do ágar ou o fundo da placa. - Coloque a tampa no prato de 35 mm e transfira-o para uma caixa de gelo, cobrindo o prato com gelo.
- Aguarde 5-10 min para que a agarose se solidifique.
2. Seccionamento
- Use um bisturi para cortar cuidadosamente ao redor do bloco de agarose embutido na glândula, removendo o bloco que contém o tecido do prato. Deixe aproximadamente uma borda de 5 mm.
- Fixe o bloco de agarose ao estágio do vibratótomo (ver Tabela de Materiais) aplicando uma gota de supercola, garantindo que toda a superfície inferior do bloco esteja em contato com a supercola.
- Deixe a supercola endurecer por aproximadamente 5 min. Em seguida, preencher a câmara vibratória com solução salina 1x tamponada com fosfato (PBS) contendo 1% de Penicilina-Estreptomicina (P/S) gelada.
- Adicione gelo ao lado e ao fundo da câmara vibratória.
OBS: Mantenha um ambiente muito frio e substitua o gelo conforme necessário. - Apague qualquer excesso de agarose e crie intervalos de 5 mm entre cada pedaço de glândula, fazendo incisões com um bisturi. Isso renderá fatias individuais.
- Alinhe a lâmina vibratómica com a face do bloco de agarose e defina os pontos inicial e final das seções para atingir a espessura de corte desejada.
- Antes de iniciar o processo de corte, certifique-se de que a lâmina não está em contato com o bloco. Esta precaução evitará o corte acidental de grandes pedaços de agarose e a perda de partes da amostra.
- Corte seções com espessura de 150 μm em baixa velocidade e alta vibração (por exemplo, velocidade 3 e ajuste de vibração de 8-10 em escala de 1 a 10 para cada parâmetro) (Figura 1A).
- Depois que uma seção for cortada e liberada no PBS circundante, colete as seções usando um pincel e coloque-as em um prato contendo mídia pré-aquecida do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) com P/S.
3. Cultura e coloração de fatias de SMG
- Cultivo
- Adicione 1,5 mL de meio RPMI a cada poço de uma placa de 6 poços que contenha um filtro de 0,4 μm. Certifique-se de que não há bolhas de ar presas sob o filtro.
- Transfira de 1 a 6 fatias para cada filtro usando um pincel, tomando cuidado para não quebrar as fatias.
Observação : certifique-se de que as fatias não estão submersas na mídia, mas em vez disso estão flutuando no filtro. Se estiverem totalmente submersas, podem sufocar durante a cultura. - Incubar a 37 °C com 5% de CO2 e trocar o meio a cada 3 dias (Figura 1A).
- Irradiar placas experimentais com uma dose única de radiação gama de 10 Gy utilizando um irradiador comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Depois, devolva-os à incubadora.
- Coloração para imagens ao vivo
- Usando um pincel, levante suavemente as fatias do filtro e coloque-as em uma placa de 24 poços contendo 500 μL de meio de cultura por poço, onde as fatias serão submersas.
- Adicionar os anticorpos conjugados relevantes e a coloração nuclear (ver Tabela de Materiais) ao meio nas concentrações adequadas27.
- Incubar as fatias com anticorpos durante 2 h a 37 °C com agitação suave.
- Lave as fatias submergindo-as em meios de cultura e lave durante 3 rondas de 10 minutos de lavagens a 37 °C com agitação suave.
4. Montagem e imagens ao vivo
- Usando pinças, remova a fita de um lado de um espaçador de imagem de dupla face e cole-a, de lado adesivo para baixo, no fundo de uma placa de 6 poços com fundo de vidro.
- Pipetar 50 μL de meio para o espaço no centro do espaçador.
- Coloque a fatia na mídia usando um pincel, garantindo que ela fique plana sem bolhas de ar presas.
- Usando uma pipeta, remova cuidadosamente 20 μL de meio da folga.
- Retire a fita do lado superior do espaçador usando pinça e coloque uma tampa circular de 25 mm por cima. Pressione ao redor da borda do espaçador para garantir que a tampa se fixe firmemente, sendo cauteloso para não quebrar a lamínula aplicando muita força (Figura 1A).
- Obtenha imagens do corte em um microscópio confocal para o período de tempo ou intervalos desejados (por exemplo, a cada 15 min por 12 h usando uma objetiva de água de 20x).
Representative Results
A resposta dos macrófagos à lesão na glândula salivar submandibular permanece desconhecida. Isso inclui se eles localizam e migram para estruturas específicas dentro da glândula, bem como a distância e a velocidade com que migram. Isso tem sido difícil de determinar por meio de abordagens de imagem estática.
Para resolver isso, uma abordagem de imagem ao vivo para estudar a interação macrófago-células epiteliais em tempo real foi desenvolvida. A coloração por imunofluorescência dos cortes foi combinada com um modelo de camundongo com traçado de linhagem endogenamente marcado (Figura 1A e Figura 2A). Nesse modelo, os cortes foram expostos a 10 Gy de irradiação gama para induzir a lesão por irradiação e foram fotografados em 2 h, 3 dias e 4 dias pós-irradiação (IR), com cortes não irradiados servindo como controle. Os dados foram adquiridos de quatro canais: Hoechst (usando laser 425 para minimizar a fototoxicidade), GFP (488), dTomato (561) e Alexa 647 (640). Uma pilha z foi realizada, e uma imagem foi capturada a cada 2-3 μm, com um total de 30 a 40 planos coletados, resultando em uma altura total de 80-90 μm.
Usando esta técnica e analisando o sinal de Tomate ligado à membrana (mT) e a atividade da caspase3/7, tornou-se evidente que os cortes organotípicos mantiveram sua estrutura epitelial, sobreviveram em cultura e exibiram morte celular mínima. Os dados mostraram que cortes não irradiados da glândula submandibular de camundongos R26mTmG 32, cultivados por 7 dias, mantiveram seu sinal mT e arquitetura epitelial (Figura 1B). Entretanto, aos 3 dias após a irradiação ex vivo, a atrofia das células acinares e ductais era evidente (Figura 1B; ácinos e estruturas ductais destacados por linhas brancas e verdes tracejadas, respectivamente), consistentes com lesão por radiação in vivo13. A apoptose foi desprezível nos cortes não irradiados, mas houve evidência de células Caspase 3/7+ nos cortes irradiados aos 4 dias pós-irradiação (Figura 1C; setas verdes), semelhante à lesão in vivo 33,34. Além disso, os cortes irradiados recapitularam danos in vivo ao DNA 34,35,36,37, como indicado pelo γH2AX38 elevado em comparação com controles não irradiados (Figura 1D,E). Assim, cortes organotípicos de glândulas salivares exibiram boa viabilidade em cultura e responderam de forma semelhante ao tecido in vivo à irradiação.
Em seguida, interações célula-célula em tempo real foram investigadas. Macrófagos interagindo diretamente com células progenitoras epiteliais marcadas com GFP (Krt14CreER-GFP) foram observados durante um período de tempo de 12 horas aos 3 dias pós-IR (Figura 2A e Vídeo 1). Notavelmente, ficou evidente que os macrófagos permaneceram próximos às células progenitoras epiteliais por horas, muitas vezes permanecendo em contato durante todo o período de 12 h de exame. Além disso, observou-se fagocitose em tempo real das células epiteliais pelos macrófagos, confirmando que os macrófagos cumprem sua função tradicional no modelo de cultura de corte (Figura 2B, Vídeos 2 e Vídeo 3). Essa técnica também identificou que os macrófagos são relativamente estacionários durante a homeostase e após a lesão por irradiação, provavelmente devido à sua alta densidade dentro do tecido. Isso demonstra, pela primeira vez, que os macrófagos das glândulas salivares não migram extensivamente durante a homeostase ou após a lesão por irradiação. No entanto, enquanto os macrófagos não mostraram migração significativa, o tecido circundante exibiu aumento da dinâmica após a irradiação, com múltiplos macrófagos interagindo ativamente em torno de aglomerados de células epiteliais marcadas. Além disso, baseada apenas na coloração nuclear, essa técnica nos permitiu visualizar o movimento celular dentro do corte ao longo do tempo, muitas vezes com ductos inteiros parecendo "migrar" dentro do tecido (Vídeo 4). Ao longo do tempo, durante o processo de cultivo, tornou-se evidente que as fatias mudaram de uma morfologia plana para uma morfologia semelhante a um esferoide, sugerindo que o movimento celular dentro da fatia é provavelmente devido ao seu rearranjo em uma estrutura semelhante a uma esfera, assemelhando-se a um evento potencial de reorganização.
Finalmente, os dados de imagem ao vivo gerados por este ensaio podem ser usados para medir quantitativamente o comportamento celular, como a migração. Células individuais podem ser detectadas e segmentadas (Figura 3A), e a migração pode ser medida usando um software de imagem e análise disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais e Vídeo 5). Além disso, a análise de objetos mais próximos pode ser realizada para determinar se as células, neste caso, os macrófagos, migram para mais perto de outras células de interesse, neste caso, as células Krt14CreER-GFP+, e como essa dinâmica muda ao longo do tempo (Figura 3B).
Figura 1: Recapitulação da resposta in vivo em cortes de tecido de glândulas salivares cortados com precisão. (A) Esquema do protocolo experimental. (B) Imagens representativas de tomateiro ligado à membrana obtidas de tecido fresco da glândula submandibular (SMG), fatias de SMG não manipuladas cultivadas por 7 dias ou cortes de SMG irradiados com dose única de irradiação gama de 10 Gy 3 ou 7 dias antes. Linhas brancas tracejadas indicam exemplos de estruturas acinares e linhas verdes tracejadas indicam estruturas ductais de exemplo. Barra de escala = 50 μm. (C) Imagens representativas da expressão da caspase-3/7 obtidas de cortes não manipulados de SMG ou SMG irradiados com dose única de irradiação gama de 10 Gy 2 h ou 4 dias antes. As pontas de seta verdes indicam núcleos positivos. Barra de escala = 50 μm. (D) Imagens representativas da expressão de γH2AX obtidas de cortes de SMG não manipulados ou cortes de SMG irradiados com dose única de irradiação gama de 10 Gy 3 dias antes. Barra de escala = 20 μm. (E) Expressão representativa de γH2AX em células epiteliais EpCAM+ de cortes de SMG não manipulados ou cortes de SMG irradiados com dose única de irradiação gama de 10 Gy 2 h e 3 dias antes. SSA = área de dispersão lateral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem ao vivo das interações macrófagos-células epiteliais e fagocitose. (A) Imagens estáticas sequenciais de interações entre células progenitoras KRT14+ e sua progênie (células Krt14CreER-GFP+) e macrófagos após irradiação. A imagem de células vivas captura a dinâmica celular durante um período de 90 minutos. Barra de escala = 20 μm. O vídeo associado é o Vídeo 1. (B) Imagens estáticas sequenciais de um macrófago fagocitando uma célula epitelial. Imagens de células vivas mostram o processo durante um período de 60 min. As setas brancas apontam para o macrófago e as setas amarelas indicam o núcleo da célula em fagocitose. Barra de escala = 50 μm. O vídeo associado é o Vídeo 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem ao vivo para análise da dinâmica celular. (A) Imagem ilustrando a identificação e segmentação de células individuais para análise de parâmetros de comportamento celular, como migração (ver Vídeo 5). As células são pseudocoloridas aleatoriamente para distinção de células individuais e faixas. Barra de escala = 100 μm. (B) Quantificação da distância (em μm) do objeto mais próximo a células individuaisKrt14 CreER-GFP+ plotadas ao longo de 10 pontos de tempo (imagens capturadas a cada 5 min). Dados apresentados como o valor médio por poço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Imagem ao vivo revelando interações dinâmicas entre células progenitoras KRT14+/progênie e macrófagos após irradiação. Os cortes foram expostos a uma única dose de irradiação gama de 10 Gy antes de imagens vivas. As células Krt14CreER-GFP+ estão representadas em verde, macrófagos (F4/80+) em vermelho e núcleos em ciano. O vídeo é composto por uma única pilha z, abrangendo um período de cultura de 12 h com imagens capturadas a cada 15 min. Clique aqui para baixar o vídeo.
Vídeo 2: Imagem ao vivo capturando um macrófago engolindo uma célula epitelial. Macrófagos (F4/80+) são representados em vermelho, e núcleos são mostrados em ciano. O vídeo consiste em uma única pilha z e abrange um período de cultura de 12 h com imagens tiradas a cada 15 min.Por favor, clique aqui para baixar o vídeo.
Vídeo 3: Imagem ao vivo de projeção máxima mostrando um macrófago engolindo uma célula epitelial. Macrófagos (F4/80+) são mostrados em vermelho, e núcleos são mostrados em ciano. O vídeo apresenta uma projeção máxima de imagens z-stack totalizando 80 μm (um único plano é apresentado no Vídeo 2) e abrange um período de cultura de 12 h com imagens tiradas a cada 15 min.Por favor, clique aqui para baixar o vídeo.
Vídeo 4: Imagem ao vivo ilustrando o comportamento dinâmico do epitélio das glândulas salivares em cultura após irradiação. Os cortes foram submetidos a uma dose única de irradiação gama de 10 Gy antes da realização de imagens ao vivo. Macrófagos (F4/80+) são representados em vermelho, núcleos em ciano. O vídeo compreende uma única pilha z, abrangendo um período de cultura de 12 h com imagens capturadas a cada 15 min.Por favor, clique aqui para baixar o vídeo.
Vídeo 5: Acompanhamento quantitativo da migração celular ao longo do tempo. Este vídeo demonstra o rastreamento individual de faixas de celular de vídeos de imagens ao vivo. As setas indicam rastros de células, e as células são pseudocoloridas individualmente. O vídeo consiste em uma única pilha z e abrange um período de cultura de 1 h com imagens tiradas a cada 15 min.Por favor, clique aqui para baixar o vídeo.
Discussion
A capacidade de cultivar tecido de glândulas salivares ex vivo apresenta uma excelente oportunidade para estudar interações célula-célula no contexto da homeostase e da resposta à lesão. Embora imagens intravitais da glândula submandibular de camundongos sejam viáveis 39,40, essa técnica depende do uso de modelos de camundongos repórteres fluorescentes para marcar endogenamente as células de interesse e deve ser realizada sob anestesia terminal. Aqui, um método para cultura de cortes de glândula submandibular ex vivo é descrito, mantendo a arquitetura celular e as interações célula-célula. Essa abordagem refina as técnicas atuais de imagem ao vivo e fornece uma alternativa à imagem intravital.
A manutenção do tecido a longo prazo usando esta técnica depende da cultura de cortes em uma interface ar-líquido. Modelos anteriores de explante26,41 provavelmente alcançaram cultura bem-sucedida por apenas alguns dias porque estavam submersos na mídia e essencialmente "sufocados". Em contraste, o uso de um sistema de cultura de interface ar-líquido mantém a saúde e a estrutura dos tecidos por um período prolongado, garantindo imagens de alta qualidade. O método de montagem de cortes de SMG antes da aquisição de imagens, com uma pequena quantidade de mídia e dentro de uma câmara de espaço restrito para manter o corte plano, é essencial para o sucesso da técnica. A visualização das células neste ensaio depende de camundongos repórteres marcados endogenamente ou anticorpos conjugados fluorescentemente. A abundância de modelos de camundongos repórteres fluorescentes transgênicos e anticorpos conjugados visando tipos e subconjuntos celulares específicos torna este método adequado para explorar várias interações células-específicas.
Embora este método forneça um bom modelo de lesão tecidual in situ e a irradiação ex vivo resulte em atrofia acinar e da estrutura ductal, semelhante ao que ocorre invivo13, alguns elementos não podem ser recapitulados ex vivo. Estes incluem a falta de funcionamento da vasculatura e entrada neuronal, bem como a ausência de células inflamatórias infiltrantes. Dado o papel bem documentado dos vasos sanguíneos e nervos na homeostase e regeneração das glândulas salivares 26,42 e a importância das células imunes migratórias43, como as células T e B, na função das glândulas salivares, na resposta à lesão, na infecção e na patogênese da Síndrome de Sjögren (SS) (conforme revisado em44), este ensaio pode perder algumas interações celulares importantes. Além disso, eventos migratórios muito rápidos, como o movimento da célula Natural Killer (NK)45 e da célula dendrítica (DC)46, podem ser perdidos por imagens a cada 15 min. No entanto, os intervalos de imagem podem ser otimizados para estudar as interações específicas célula-célula de interesse, e a capacidade de obter imagens em 3 dimensões através de pilhas z permite a avaliação do movimento celular 3D. A montagem segura do tecido durante a aquisição de imagens é crucial para a quantificação, como medidas de rastreamento celular. Além disso, embora este estudo tenha utilizado tecido de camundongo, o protocolo fornece um método viável para estudar interações célula-célula em glândulas salivares humanas, gerando valiosas informações translacionais inatingíveis por outros métodos.
Embora o papel dos macrófagos residentes em tecidos na homeostase e regeneração tenha sido demonstrado em vários tecidos2,10,11,12, seu papel nas glândulas salivares permanece em grande parte sem resposta. Embora se saiba que os macrófagos são essenciais para a regeneração epitelial após lesão por irradiação13, os mecanismos precisos subjacentes a esse efeito permanecem desconhecidos. A imagem ao vivo de cortes de glândulas salivares permite a visualização e análise em tempo real de dinâmicas teciduais complexas, que muitas vezes são perdidas por imagens confocais tradicionais. Além disso, é evidente que os macrófagos sofrem mudanças dinâmicas na forma enquanto desempenham várias funções in vivo 47,48,49, e este protocolo provavelmente fornece uma melhor representação dessas mudanças do que uma visão estática típica em tecido fixo. Estudos futuros podem utilizar essa técnica para investigar como a comunicação célula-célula muda ao longo da homeostase, lesão e regeneração/resolução. Essa abordagem será útil para elucidar as principais vias de sinalização e eventos que podem, em última análise, oferecer benefícios terapêuticos.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
A SE é financiada pela subvenção da Wellcome Trust 108906/Z/15/Z; O EE é financiado pela bolsa MR/MRC MR/S005544/1 e por uma bolsa de estudos da Universidade de Edimburgo. A Figura 1A é criada com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 µm filter cell culture inserts (Nunc) | Avantor/VWR | 734-2240 | Inserts pre-packed in 6-well multidishes, 20 mm × 25 mm |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 35 mm dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Coverslips | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111650 | Deckglaser Cover Glasses 25 mm diameter |
| Double-sided sticker | Grace Bio-Labs | 654004 | SecureSeal Imaging Spacers SS1 x 13, 13 mm diameter x 0.12 mm depth, 25 mm x 25mm OD |
| EtOH | Scientific Laboratories Supplies | CHE1924 | Absolute ethanol (EtOH) AR, 99.7% |
| F4/80 antibody | Invitrogen | 17-4801-82 | F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), APC, eBioscience |
| Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Student Fine Forceps Straight Broad Shanks |
| Glass bottom 6 well plate | Cellvis | P06-1.5H-N | 6 well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025050 | +calcium +magnesium, no phenol red |
| Hoechst | Sigma Aldrich | 14533 | Alternative name: bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Ice box | Fisher Scientific | 11339623 | Azlon Polyurethane Ice Buckets with Lid |
| Imaging and analysis software | Harmony | ||
| Low Melting Agarose | Merck | A9414-25G | |
| Paintbrush | Watercolour brush, 10 mm x 2mm tip | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 20012027 | |
| RPMI | ThermoFisher | 12634010 | Gibco Advanced DMEM/F-12 |
| Scalpel | Swann-Morton | Disposable scalpels, No. 11 blade | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Extra Narrow Scissors 10.5 cm |
| Shepherd Mark-I-68A 137Cs irradiator | JL Shepherd & Associates | ||
| Superglue | Bostik | Multi-purpose superglue, fast setting, ultra strong | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1000 S | |
| Vibratome blades | Astra | Superior Platinum Double Edge blade | |
| Wild-type (C57BL/BJ) mice | Charles River |
References
- Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
- Ratnayake, D., et al. Macrophages provide a transient muscle stem cell niche via NAMPT secretion. Nature. 591 (7849), 281-287 (2021).
- Lucas, T., et al. Differential roles of macrophages in diverse phases of skin repair. J Immunol. 184 (7), 3964-3977 (2010).
- Duffield, J. S., et al. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J Clin Invest. 115 (1), 56-65 (2005).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Mass, E., Nimmerjahn, F., Kierdorf, K., Schlitzer, A. Tissue-specific macrophages: how they develop and choreograph tissue biology. Nat Rev Immunol. 23 (9), 563-579 (2023).
- Dick, S. A., et al. Three tissue resident macrophage subsets coexist across organs with conserved origins and life cycles. Sci Immunol. 7 (67), (2022).
- Hassel, C., Gausserès, B., Guzylack-Piriou, L., Foucras, G. Ductal macrophages predominate in the immune landscape of the lactating mammary gland. Front Immunol. 12, 754661 (2021).
- Kolter, J., et al. A subset of skin macrophages contributes to the surveillance and regeneration of local nerves. Immunity. 50 (6), 1482-1497 (2019).
- Dawson, C. A., et al. Tissue-resident ductal macrophages survey the mammary epithelium and facilitate tissue remodelling. Nat Cell Biol. 22 (5), 546-558 (2020).
- Choi, J., et al. Inflammatory signals induce AT2 cell-derived damage-associated transient progenitors that mediate alveolar regeneration. Cell Stem Cell. 27 (3), 366-382 (2020).
- McKendrick, J. G., et al. CSF1R-dependent macrophages in the salivary gland are essential for epithelial regeneration after radiation-induced injury. Sci Immunol. 8 (89), doi:10.1126/sciimmunol.add4374 eadd4374 (2023).
- Muntjewerff, E. M., Meesters, L. D., vanden Bogaart, G.
- Bissonnette, E. Y., Lauzon-Joset, J. F., Debley, J. S., Ziegler, S. F. Cross-talk between alveolar macrophages and lung epithelial cells is essential to maintain lung homeostasis. Front Immunol. 11, 583042 (2020).
- Xue, Q., et al. Analysis of single-cell cytokine secretion reveals a role for paracrine signaling in coordinating macrophage responses to TLR4 stimulation. Sci Signal. 8 (381), (2015).
- McArdle, S., Mikulski, Z., Ley, K. Live cell imaging to understand monocyte, macrophage, and dendritic cell function in atherosclerosis. J Exp Med. 213 (7), 1117-1131 (2016).
- Gurevich, D. B., et al. Live imaging of wound angiogenesis reveals macrophage orchestrated vessel sprouting and regression. Embo j. 37 (13), (2018).
- Meziani, L., et al. CSF1R inhibition prevents radiation pulmonary fibrosis by depletion of interstitial macrophages. Eur Respir J. 51 (3), (2018).
- Bickelhaupt, S., et al. Effects of CTGF blockade on attenuation and reversal of radiation-induced pulmonary fibrosis. J Natl Cancer Inst. 109 (8), (2017).
- Formenti, S. C., Demaria, S.
- Chambers, M. S., Garden, A. S., Kies, M. S., Martin, J. W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: pathogenesis, impact on quality of life, and management. Head Neck. 26 (9), 796-807 (2004).
- Radfar, L., Sirois, D. A. Structural and functional injury in minipig salivary glands following fractionated exposure to 70 Gy of ionizing radiation: an animal model for human radiation-induced salivary gland injury. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 96 (3), 267-274 (2003).
- Grehn, A. L., Gustafsson, H., Franzén, L., Thornell, L. E., Henriksson, R. Ultrastructural morphometry of parotid acinar cells following fractionated irradiation. Oral Oncol. 33 (1), 23-28 (1997).
- Rocchi, C., Emmerson, E. Mouth-watering results: clinical need, current approaches, and future directions for salivary gland regeneration. Trends Mol Med. 26 (7), 649-669 (2020).
- Emmerson, E., et al. Salivary glands regenerate after radiation injury through SOX2-mediated secretory cell replacement. EMBO Mol Med. 10 (3), 8051 (2018).
- May, A. J., et al. Diverse progenitor cells preserve salivary gland ductal architecture after radiation-induced damage. Development. 145 (21), (2018).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nat Commun. 4, 1494 (2013).
- Mizrachi, A., et al. Radiation-induced microvascular injury as a mechanism of salivary gland hypofunction and potential target for radioprotectors. Radiat Res. 186 (2), 189-195 (2016).
- Friedrich, R. E., Bartel-Friedrich, S., Holzhausen, H. J., Lautenschläger, C. The effect of external fractionated irradiation on the distribution pattern of extracellular matrix proteins in submandibular salivary glands of the rat. J Craniomaxillofac Surg. 30 (4), 246-254 (2002).
- Vasioukhin, V., Degenstein, L., Wise, B., Fuchs, E. The magical touch: genome targeting in epidermal stem cells induced by tamoxifen application to mouse skin. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8551-8556 (1999).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Gilman, K. E., et al. P2X7 receptor deletion suppresses γ-radiation-induced hyposalivation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 316 (5), R687-R696 (2019).
- Ren, J., et al. Radioprotective effects and mechanism of HL-003 on radiation-induced salivary gland damage in mice. Sci Rep. 12 (1), 8419 (2022).
- Marmary, Y., et al. Radiation-induced loss of salivary gland function is driven by cellular senescence and prevented by IL6 modulation. Cancer Res. 76 (5), 1170-1180 (2016).
- Chang, S., et al. Inorganic nitrate alleviates total body irradiation-induced systemic damage by decreasing reactive oxygen species levels. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 103 (4), 945-957 (2019).
- Varghese, J. J., et al. Localized delivery of amifostine enhances salivary gland radioprotection. J Dent Res. 97 (11), 1252-1259 (2018).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. gammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair. Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).
- Takano, T., et al. Highly localized intracellular Ca(2+) signals promote optimal salivary gland fluid secretion. Elife. 10, (2021).
- Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of murine submandibular salivary gland for upright intravital microscopy. J Vis Exp. 135, (2018).
- O'Dell, N. L., Sharawy, M. H., Schuster, G. S. Effects of in vivo single and multiple isoproterenol injections on subsequently explanted submandibular glands. Acta Anat (Basel. 105 (4), 431-438 (1979).
- Lombaert, I. M., et al. Cytokine treatment improves parenchymal and vascular damage of salivary glands after irradiation). Clin Cancer Res. 14 (23), 7741-7750 (2008).
- Stolp, B., et al. Salivary gland macrophages and tissue-resident CD8(+) T cells cooperate for homeostatic organ surveillance. Sci Immunol. 5 (46), 4371 (2020).
- Verstappen, G. M., Pringle, S., Bootsma, H., Kroese, F. G. M. Epithelial-immune cell interplay in primary Sjögren syndrome salivary gland pathogenesis. Nat Rev Rheumatol. 17 (6), 333-348 (2021).
- Vanherberghen, B., et al. Microwell-based live cell imaging of NK cell dynamics to assess heterogeneity in motility and cytotoxic response. Methods Mol Biol. 1441, 87-106 (2016).
- de Winde, C. M., Munday, C., Acton, S. E. Molecular mechanisms of dendritic cell migration in immunity and cancer. Med Microbiol Immunol. 209 (4), 515-529 (2020).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Paterson, N., Lämmermann, T. Macrophage network dynamics depend on haptokinesis for optimal local surveillance. Elife. 11, (2022).
- Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
