Développement de tests RT-qPCR multiplex en temps réel pour la détection du SRAS-CoV-2, de la grippe A/B et du MERS-CoV

La pandémie de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) en cours est causée par le nouveau coronavirus connu sous le nom de coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2)¹. En raison de la forte contagiosité du SAR-CoV-2 et de sa capacité de transmission rapide, la pandémie de COVID-19 est apparue dans la ville de Wuhan, en Chine, et s’est propagée rapidement dans le monde entier. Cela a finalement conduit à l’apparition de signes de détresse respiratoire et même à la mort ^2,3,4. La COVID-19 a été déclarée pandémie dans plus de 213 pays, ce qui devrait entraîner une forte augmentation du nombre de cas confirmés, comme en témoignent les articles publiés par différentes études de recherche ^3,5. La COVID-19 se transmet principalement par de petites gouttelettes respiratoires que les personnes infectées libèrent dans l’environnement, puis sont exposées aux personnes vulnérables par inhalation ou par contact étroit avec des surfaces contaminées. Lorsque ces gouttelettes entrent en contact avec la muqueuse des yeux, de la bouche ou du nez, une personne peut être infectée⁶. Les statistiques publiées par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) montrent qu’il y a eu plus de 76 millions de cas confirmés de la pandémie dans le monde, avec un nombre stupéfiant de 7 millions de décès⁷. Ainsi, les Nations Unies ont classé la pandémie causée par la maladie COVID-19 comme une catastrophe en raison de son impact direct sur la vie de milliards de personnes dans le monde et de ses effets économiques, environnementaux et sociaux de grande portée.

Les initiatives de santé publique, y compris les tests approfondis, la détection précoce, la recherche des contacts et l’isolement des cas, se sont toutes avérées cruciales pour garder cette pandémie sous contrôle 8,9,10,11. Les mois d’hiver augmenteront la circulation d’autres virus respiratoires comme la grippe A et B avec des symptômes semblables à ceux de la COVID-19, ce qui rendra difficile l’identification, le suivi et l’isolement précoces des cas de COVID-19. Chaque année, les éclosions de grippe A et B commencent à la fin de l’automne ou au début de janvier avec une saisonnalité prévisible¹². De nombreux traits épidémiologiques sont communs aux virus SARS-CoV-2 et grippal. En outre, partageant des similitudes dans les populations sensibles qui comprennent les enfants, les personnes âgées, les immunodéprimés et les personnes souffrant de comorbidités chroniques telles que l’asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive, l’insuffisance cardiaque et rénale ou le diabète^12,13. Ces virus partagent non seulement des populations vulnérables, mais aussi des voies de transmission de contact et de gouttelettes respiratoires¹⁴. On s’attend à ce que les patients contractent plus d’un de ces virus respiratoires à^{l’approche de} la saison de la grippe. Pour cela, le dépistage du SARS-CoV-2 et des virus de la grippe doit être effectué sur les patients symptomatiques avant qu’ils ne soient isolés. Il n’est pas possible d’effectuer des tests séparés pour les trois virus (SRAS-CoV-2, grippe A et grippe B) en raison du manque mondial de ressources pour l’extraction et le diagnostic des acides nucléiques. Afin de les dépister tous en une seule réaction, une méthode ou un test doit être développé.

Le syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS)-CoV est un membre de la famille des coronavirus humains (CoV). Les premiers isolats du virus MERS-CoV provenaient d’un patient hospitalisé en Arabie saoudite qui était décédé en septembre 2012 des suites de problèmes respiratoires aigus¹⁵. Il existe des preuves qui suggèrent que les dromadaires sont un hôte de réservoir important pour le MERS-CoV. Il a été prouvé que les virus des dromadaires infectés sont zoonotiques et peuvent donc infecter les humains^16,17. Les humains infectés par ce virus peuvent le transmettre à d’autres personnes par contact étroit¹⁸. Au 26 janvier 2018^{, il} y avait eu 2143 cas confirmés en laboratoire d’infection par le MERS-CoV, dont 750 décès dans le^monde. Les symptômes les plus typiques du MERS-CoV sont la toux, la fièvre et l’essoufflement. Des infections par le MERS-CoV ont également été signalées comme présentant des symptômes de pneumonie, de diarrhée et de maladies gastro-intestinales²⁰. À l’heure actuelle, il n’existe pas de vaccin commercial ou de traitement spécifique contre le MERS-CoV. Par conséquent, un diagnostic rapide et précis est essentiel pour prévenir les épidémies généralisées de MERS-CoV et différencier le MERS-CoV de la maladie SARS-CoV-2.

À ce jour, de nombreuses approches ont été proposées pour détecter ces virus telles que la RT-PCR multiplex 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas12^26,27, CRISPR/Cas9²⁸ et CRISPR/Cas3²⁹, le dosage immunologique à flux latéral³⁰, les capteurs biomoléculaires à base de papier³¹, le test SHERLOCK dans un pot³², l’aptamère d’ADN³³, l’isotherme médié par boucle amplification (LAMP)^19,34, etc. Chacune des méthodes susmentionnées présente des avantages et des inconvénients uniques en termes de sensibilité et de spécificité. Parmi ces méthodes, le test basé sur l’amplification des acides nucléiques : qRT-PCR multiplex, est la plus courante et est considérée comme l’étalon-or pour le diagnostic du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du MERS-CoV.

Dans cette étude, nous avons conçu et évalué diverses combinaisons d’amorces et de sondes pour la détection efficace, précise et simultanée du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du SRAS-CoV-2, du MERS-CoV à l’aide d’ARN viraux synthétiques à torsion standard. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) recommande les tests multiplexés développés pour les gènes cibles du MERS-CoV ou du SRAS-CoV-2. Ces gènes codent généralement pour des protéines et des complexes qui contribuent à la formation d’un complexe de réplication/transcription (RTC)³⁵, comme la région du cadre de lecture ouvert 1a (ORF1a) utilisée pour le dosage du MERS-CoV. De plus, les protéines structurales sont codées par les gènes utilisés dans les tests diagnostiques tels que le gène de la région amont de l’enveloppe (upE) et le gène de la nucléocapside (N) qui sont utilisés pour les tests MERS-CoV et SARS-Cov-2, respectivement^35,36. Nous avons utilisé le kit RT-qPCR en une étape R3T en interne pour établir la RT-qPCR pour la détection des virus³⁷. La détection des virus, la sensibilité, la spécificité et la plage dynamique de notre kit RT-qPCR en une étape R3T et de nos ensembles d’amorces ont été testés et évalués à l’aide de dilutions en série 10 fois des ARN synthétiques à torsion standard. La limite pratique de détection la plus basse était d’environ 10 copies de transcription par réaction. En conséquence, le kit RT-qPCR en une étape R3T interne et les ensembles d’amorces/sondes peuvent être utilisés et mis en œuvre avec succès pour le diagnostic simultané de routine du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du SRAS-CoV-2, MERS-CoV.

1. Expression et purification de la Taq polymérase

1. Construire un plasmide avec un marqueur d’hexa-histidine clivable à l’extrémité C de l’enzyme.
2. Transformer 50 ng du vecteur d’expression en souche E. coli BL21-(DE3) en suivant le protocole standard³⁸.
3. Inoculer les cellules transformées dans quatre flacons de 6 L contenant chacun 2 L de bouillon de milieu 2YT à 37 °C en agitant à 170 tr/min jusqu’à ce que la DO 600 de 0,8 ou le numéro de cellule 6,4 x 10⁸ soit atteint.
4. Induire l’expression de la Taq polymérase avec 0,5 mM d’isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) et poursuivre l’incubation à 16 °C pendant 18 h avec agitation.
5. Récoltez les cellules en les faisant tourner vers le bas à 4 °C à 7808 x g pendant 10 min. Remettre les pastilles en suspension dans 200 mL d’un tampon de lyse par polymérase Taq glacé (tableau 1) dans 5 mL/g de pastille cellulaire.
6. Incuber les cellules avec du lysozyme (2 mg/mL de tampon de lyse) et des inhibiteurs de protéase pendant 45 minutes, puis passer le lysat à travers un perturbateur cellulaire à 30 kPsi et centrifuger à 22 040 x g pendant 30 minutes à 4 °C pour séparer les débris cellulaires.
7. Faites chauffer le surnageant pendant 15 min à 85 °C. Essorage à 95 834 x g pendant 1 h à 4 °C. Récupérez le surnageant et filtrez-le sur de la glace à l’aide d’un filtre de 0,45 μm.
8. Effectuer la purification des protéines à l’aide de la chromatographie liquide rapide des protéines (FPLC) en faisant d’abord passer l’échantillon dans une colonne Ni-NTA HP de 5 mL à un débit de 4 mL/min à l’aide du tampon polymérase A Taq (Tableau 2 ; Graphique 1A).
9. Laver avec 10 volumes de colonne (CV) de tampon polymérase Taq A et 4 % de tampon polymérase Taq B (tableau 2). Éluer la protéine liée avec un gradient linéaire à l’aide du tampon polymérase B Taq sur 20 CV dans un flacon de 100 ml.
10. Faire passer l’éluant dans le flacon de 100 mL à travers une colonne échangeuse cationique de 5 mL à 4 mL/min à l’aide du tampon polymérase Taq C (Tableau 2 ; Graphique 1A).
11. Laver avec 20 CV de tampon polymérase C à 100 % Taq et de tampon polymérase D à 5 % Taq (tableau 2).
12. Élue avec un gradient linéaire à l’aide du tampon polymérase Taq D (tableau 2) à partir de 5 % à 100 %.
13. Vérifier les fractions éluées en effectuant l’électrophorèse sur gel SDS-PAGE ³⁹ suivie d’une coloration sur gel ⁴⁰ comme décrit précédemment. Brièvement, prenez 10 μL de chaque fraction et ajoutez un volume égal de 2x le colorant de chargement SDS. Dénaturer l’échantillon à 90^°C pendant 10 min. Chargez les échantillons sur du gel SDS-PAGE à 10 % et faites couler le gel pendant 25 min à 200 V. Colorez le gel avec Coomassie Brilliant Blue, puis détachez-le.
14. Prélever toutes les fractions qui contiennent de la Taq polymérase purifiée et les dialyser contre le tampon de stockage de la taq polymérase (tableau 3) à 4 °C. Préparez brièvement 2 L du tampon de stockage et plongez la cassette de dialyse dans le tampon pendant 2 min pour l’hydrater. Injectez les fractions prélevées à l’aide d’une aiguille dans la cassette de dialyse et laissez-la toute la nuit dans le tampon de dialyse à 200 tr/min sur l’agitateur.
15. Après la dialyse, mesurer la concentration en protéines à l’aide d’un spectrophotomètre, faire 10 μL d’aliquotes, congeler dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C.
    REMARQUE : Filtrez tous les tampons pour la purification à l’aide d’un filtre de 0,45 μm avant de les charger dans le système FPLC.

2. Expression de MMLV-RT dans le système d’expression et de purification des cellules d’insectes

1. Génération et isolement de l’ADN Bacmid
   1. Clonez la séquence de MMLV-RT avec une balise TEV-8xHis-Strep clivable en C-terminale comme décrit précédemment⁴¹.
   2. Mélangez 100 ng du vecteur d’expression dans 50 μL de cellules DH10Bac et mélangez doucement en tapotant le tube.
   3. Incuber les cellules sur de la glace pendant 15 min. Choc thermique des cellules pendant 1 min à 42 °C.
   4. Transférer immédiatement sur de la glace et ajouter 400 μL de milieu S.O.C. Incuber à 37 °C en agitant pendant 4 h.
   5. Plaquer 10 μL et 15 μL du mélange sur des plaques de gélose LB contenant trois antibiotiques ; 50 μg/mL de kanamycine, 10 μg/mL de tétracycline et 7 μg/mL de gentamicine ainsi que 40 μg/mL d’IPTG et 100 μg/mL de X-Gal pour la sélection bleu-blanc.
   6. Incuber les plaques à 37 °C pendant 48 h. Choisissez plusieurs colonies blanches et une colonie bleue comme témoin, et remettez-les sur des plaques de gélose LB fraîches contenant les antibiotiques ci-dessus. Incuber les plaques pendant une nuit à 37 °C.
   7. Après avoir confirmé le phénotype blanc, prélevez quelques colonies et inoculez-les dans 10 mL de milieu LB contenant 50 μg/mL de kanamycine, 10 μg/mL de tétracycline et 7 μg/mL de gentamicine dans des tubes de 50 mL.
   8. Incuber la culture à 37 °C en agitant à 170 tr/min pendant la nuit. Abaissez les cellules en les faisant tourner à 22 040 x g pendant 10 minutes.
   9. Décanter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 250 μL de solution de remise en suspension à partir d’un kit de minipréparation (cette solution doit être manipulée conformément aux instructions du fabricant), puis transférer la solution dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
   10. Ajouter 250 μL de solution de lyse, mélanger délicatement et incuber pendant 3 min. Ajouter 350 μL de solution neutralisante, inverser 2x-3x et centrifuger à 22 040 x g pendant 10 min.
   11. Transférez le surnageant dans un tube frais et ajoutez un volume égal d’isopropanol glacé et incubez pendant 30 min à -20 °C.
   12. Descendez l’ADN précipité en le faisant tourner à 22 040 x g pendant 10 minutes. Jetez le surnageant et lavez la pastille avec 700 μL d’éthanol glacé à 70 %, 2x.
   13. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette sans toucher la pastille. Laissez les granulés sécher à l’air libre dans la hotte à flux laminaire pendant 5 à 10 minutes ou jusqu’à ce qu’aucun liquide ne soit visible dans le tube. Dissoudre la pastille dans 100 μL de tampon EB.
2. Transfection de bacmides et amplification virale
   1. Préparation du virus P1
      1. Dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits, semer ~ 9 x 10⁵ cellules/puits dans 2 mL de milieu de culture de cellules d’insectes.
      2. Incubez la plaque pendant ~30 min à température ambiante pour permettre aux cellules de se fixer.
      3. Préparer le mélange Bacmid/Fugene comme suit : mélanger 1 μg d’ADN Bacmid et 300 μL de milieu de cellules d’insectes dans un tube. Dans un autre tube, mélanger 8 μL de réactif de transfection et 300 μL de milieu de cellules d’insectes. Mélangez les deux mélanges par pipetage doux et laissez agir ~30 min à température ambiante pour que le complexe bacmide/réactif de transfection se forme.
      4. Ajouter le mélange complexe bacmide (~210 μL) dans chaque puits goutte à goutte et sceller la plaque avec un film transparent.
      5. Incuber l’assiette à 27 °C pendant 3-4 jours.
      6. Prenez le milieu qui contient le virus, ajoutez le FBS (concentration finale de 2 %), filtrez à l’aide d’un filtre de 0,45 μm et conservez-le à 4 °C dans l’obscurité comme stock de virus P1.
   2. Préparation du virus P2
      1. Transfecter 50 mL de cellules d’insectes à 2 x 10⁶ cellules/mL avec 3 mL de virus P1 dans une fiole de culture.
      2. Incuber à 27 °C en agitant à 100 tr/min pendant 4 à 6 jours jusqu’à ce que le pourcentage de cellules mortes atteigne 25 à 30 %.
      3. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min et recueillir le surnageant qui contient le virus.
      4. Ajouter le FBS jusqu’à une concentration finale de 2 %, filtrer à travers un filtre de 0,45 μm et aliquote 1 mL chacun et conserver à -80 °C comme bouillon de virus P2.
   3. Préparation du virus P3
      1. Transfecter 100 mL de cellules d’insectes à raison de 2 x 10⁶ cellules/mL avec les 2 mL de virus P2 dans une fiole de culture.
      2. Incuber à 27 °C en agitant à 100 tr/min pendant 3-4 jours jusqu’à ce que le pourcentage de cellules mortes atteigne 15%-20%.
      3. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min et recueillir le surnageant qui contient le virus.
      4. Ajouter le FBS jusqu’à l’obtention d’une concentration finale de 2 %. Filtrez à travers un filtre de 0,45 μm. Il peut être conservé à l’obscurité à 4 °C pendant 1 mois.
3. Expression et purification du MMLV-RT dans les cellules d’insectes
   1. Ajouter 5 mL de virus P3 à des cellules d’insectes fraîches à une densité de 2 x 10⁶ cellules/mL (flacon de 700 mL/2L) dans un total de 6 flacons.
   2. Récoltez les cellules après 55-60 h de post-transfection en les faisant tourner à 7808 x g pendant 10 min.
   3. Remettre les pastilles cellulaires en suspension dans 200 mL de tampon de lyse MMLV-RT (tableau 4). Faire passer le lysat dans un perturbateur cellulaire à 15 kPsi et centrifuger à 22 040 x g pendant 30 min à 4 °C.
   4. Transvaser le surnageant dans de nouveaux tubes et faire tourner à nouveau à 95 834 x g à 4 °C pendant 1 h. Récupérez le surnageant et filtrez-le sur de la glace à l’aide d’un filtre de 0,45 μm.
   5. Commencer la purification des protéines à l’aide de la FPLC en faisant d’abord passer l’échantillon dans une colonne Ni-NTA Excel de 5 mL (Figure 1B) à un débit de 4 mL/min à l’aide du tampon MMLV-RT A (Tableau 5).
   6. Laver la colonne avec 10 CV de tampon MMLV-RT A et 4 % de tampon MMLV-RT B (tableau 5) et éluer la protéine avec le gradient linéaire de tampon MMLV-RT B sur 20 CV dans un flacon de 100 mL.
   7. Faire passer l’échantillon élué dans la colonne de 5 mL de streptocoque (figure 1B) équilibrée avec le tampon MMLV-RT C (tableau 5).
   8. Laver la colonne avec 10 CV de tampon C MMLV-RT à 100 % et éluer la protéine avec un gradient linéaire avec 20 CV de tampon D (tableau 5).
   9. Vérifiez les fractions éluées en exécutant SDS-PAGE comme indiqué aux étapes 1.13.-1.14. et recueillir les fractions qui contiennent du MMLV-RT purifié pour les dialyser dans le tampon de stockage du MMLV-RT (tableau 6) à 4 °C.
   10. Mesurer la concentration en protéines à l’aide de Nanodrop, aliquote, surgeler dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C.
       REMARQUE : Filtrez tous les tampons pour la purification à l’aide d’un filtre de 0,45 μm avant de les charger dans le système FPLC.

3. Préparation des composants du kit RT-qPCR en une étape R3T multiplex en interne

1. Préparation du mélange tampon
   1. Préparez le tampon 2x pour la réaction RT-qPCR qui contient les réactifs précédemment illustrés en³⁷. Préparez tous les réactifs dans de l’eau sans DNase/RNase et le mélange tampon conservé dans un congélateur à -20 °C.
2. Préparation des ensembles d’amorces et des sondes et des mélanges d’apprêts
   REMARQUE : Les sondes et les amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau 7. Le kit multiplexé Influenza et SARS-CoV-2 contient 3 sondes et 4 jeux d’amorces directes et inverses. Les sondes sont marquées aux extrémités 5′ à l’aide de rapporteurs 6-carboxyfluorescéine (FAM) pour InfA, Texas Red-XN pour le SARS-CoV-2 (gène N) et Yakima Yellow pour InfB. Le kit multiplexé MERS-CoV et SARS-CoV-2 contient 3 sondes et 3 jeux d’amorces directes et inverses. Les sondes sont également marquées aux extrémités 5′ à l’aide de rapporteurs Texas Red-XN pour le MERS-CoV (gène ORF1a), VIC pour le MERS-CoV (gène UpE) et 6-carboxyfluorescéine (FAM) SARS-CoV-2 (gène N).
   1. Préparer un mélange d’amorces contenant toutes les amorces et sondes énumérées dans le tableau 7 avec une concentration finale de 6,7 μM pour chaque amorce directe et inverse et de 1,25 μM pour chaque sonde dans un tube de 1,5 mL. Conservez le mélange d’apprêt au congélateur à -20 °C. Utilisez le tampon d’élution pour constituer le volume requis.
3. Préparation d’un mélange enzymatique
   1. Préparer le mélange d’enzymes Taq polymérase (30 U/μL) et MMLV-RT (60 ng/μL) dans le tampon de stockage de la polymérase Taq, comme indiqué dans le tableau 3 , pour obtenir le volume requis. Effectuez cette étape sur de la glace et conservez le mélange enzymatique à -20 °C.
4. Modèle d’ARN
   1. Remettre en suspension les ARN synthétiques du SRAS-CoV-2, de la grippe A H1N1, de la grippe A, du H3N2, de la grippe B et du MERS-CoV séparément dans 100 μL de tampon 1x Tris-EDTA (10 mM Tri-Cl et 1 mM EDTA (pH 8,0) pour obtenir un stock de 1 x 10⁶ copies d’ARN/μL.
   2. Mélanger les ARN synthétiques pour la RT-qPCR dans les configurations suivantes : 1) SARS-CoV-2, Influenza A et Influenza B en ajoutant 5 μL de chaque souche virale à un volume de 50 μL pour obtenir 1 x 10^{copies d’ARN de 5} cm/μL ; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV en ajoutant 5 μL de chaque souche virale à un volume de 50 μL pour obtenir 1 x 10⁵ copies d’ARN/μL. Effectuer des dilutions en série 10 fois de chaque mélange d’ARN synthétique allant de 1 x 10⁵ copies d’ARN/μL à 10 copies d’ARN/μL.
      REMARQUE : Assurez-vous d’utiliser de l’eau glacée sans DNase/RNase pour préparer la dilution en série des modèles.

4. Test RT-qPCR en une étape multiplexé en interne pour le SRAS-CoV-2, la grippe A, la grippe B et le SRAS-CoV-2, le MERS-CoV

REMARQUE : Désinfectez les surfaces du poste de travail et utilisez un gabarit de plaque à 96 puits pour planifier la disposition des plaques PCR.

1. Préparation d’une plaque à 96 puits
   1. Décongeler 2x tampon et mélange d’apprêt. Conservez le mélange d’enzymes sur de la glace.
   2. Dans chaque puits, ajoutez 10 μL de mélange tampon 2x, 1,5 μL de mélange d’amorce, 1 μL de mélange enzymatique, 6,5 μL d’eau exempte de DNase/RNase et 1 μL du mélange d’ARN correspondant qui doit être testé. Le volume final dans chaque puits est de 20 μL. Veuillez vous référer à la mise en page préparée pour obtenir de l’aide sur cette étape.
      REMARQUE : Il est recommandé de faire un mélange maître basé sur le nombre de réactions qui contiennent tous les réactifs à l’exception de l’échantillon d’ARN pour éviter le biais de pipetage. De plus, effectuez les réactions en double ou en triple exemplaire pour éviter les erreurs techniques.
   3. Scellez la plaque avec un joint adhésif de plaque PCR et centrifugez brièvement pendant 1 min pour recueillir tout le liquide au fond de la plaque. Assurez-vous que chaque puits a le même volume de liquide et qu’il est exempt de bulles avant de transférer les échantillons vers la machine qPCR.
      REMARQUE : Toutes les réactions PCR doivent être configurées sur de la glace.
2. Programme de PCR
   1. Ouvrez le programme de la machine qPCR en temps réel et choisissez les propriétés expérimentales suivantes :
      Le type de bloc : Rapide à 96 puits (0,1 ml)
      Configuration de l’expérience : Courbe standard
      Réactifs : Réactifs TaqMan
      Propriétés d’exécution : Standard.
   2. Définissez toutes les cibles génétiques et leur colorant rapporteur comme présenté dans le tableau 7. De plus, définissez des noms d’échantillons pour chaque réaction à tester afin de faciliter l’analyse des courbes d’amplification.
   3. Affectez des cibles et des échantillons à la disposition des plaques du programme en fonction de la plaque à 96 puits.
   4. Réglez le programme de cycle suivant dans l’instrument PCR comme suit :
      55 °C pendant 10 min
      40 cycles : 94 °C pendant 1 min
      94 °C pendant 10 s
      68 °C pendant 10 s
      68 °C pendant 20 s ; ici acquièrent de la fluorescence.
   5. Transférez la plaque sur la machine qPCR en temps réel et placez-la dans le support en veillant à l’orientation correcte de la plaque et commencez le cycle.
   6. Choisissez l’emplacement du fichier pour enregistrer les données expérimentales.
3. Analyse des données
   1. Il est essentiel d’examiner d’abord les diagrammes d’amplification produits par le programme qPCR. Analysez la limite de détection pour évaluer la concentration minimale d’ARN qui peut être détectée.
   2. Tracez le logarithme du nombre de copies d’ARN sur l’axe des abscisses et la valeur moyenne de Ct correspondante sur l’axe des ordonnées pour évaluer la sensibilité du dosage. La pente et le R² indiquent la fiabilité et l’efficacité de la réaction.

Au cours des dernières années, des progrès significatifs ont été réalisés dans l’approche diagnostique pour la détection des virus respiratoires courants à l’aide des approches PCR 21,22,23,24,25. Cependant, malgré ces avancées, l’approche multiplexée, qui permet de détecter plusieurs virus en un seul test, n’a pas été largement mise en œuvre, en particulier dans la plateforme RT-qPCR. Cette méthode a été mise en œuvre avec succès à l’aide de virus à ARN synthétiques et d’une optimisation interne des composants de la réaction37. La spécificité, la sensibilité et la fiabilité de l’essai diagnostique ont été évaluées comme étant élevées, grâce à l’utilisation d’une analyse de limite de détection. L’approche présentée pourrait grandement améliorer l’efficacité et la précision du diagnostic des virus respiratoires, en réduisant le besoin de tests multiples et en minimisant le risque d’erreur de diagnostic comme dans lecas de 43. D’autres recherches sont nécessaires pour explorer les avantages de cette approche à l’aide d’échantillons de patients et encourager son adoption dans la pratique clinique.

Expression et purification de l’ADN polymérase Taq marquée à l’histidine
Sur la base du protocole établi d’expression et de purification de l’ADN polymérase Taq44, le plasmide N-terminal de l’ADN polymérase Taq marqué à l’histidine a été construit sous le contrôle d’un promoteur de choc thermique pour faciliter son processus d’expression et de purification comme expliqué ci-dessus (Figures 1A et Figure 2A). Ainsi, en modifiant simplement la concentration et la température de l’IPTG, le niveau d’expression de cette nouvelle construction peut être facilement contrôlé. L’incubation de cellules contenant le plasmide d’ADN polymérase Taq à 16 °C avec 1 mM d’IPTG a montré une expression accrue de l’ADN polymérase His-Taq. De plus, le protocole44 établi antérieurement exigeait des étapes de précipitation de la polyéthylèneimine (PEI) qui prenaient beaucoup de temps, ce qui peut être sauté avec la construction utilisée ici, car la pureté du produit final n’était pas affectée et comparable à celle de la Taq polymérase disponible dans le commerce (figure 2B). La Taq polymérase purifiée a migré plus lentement que la polymérase commerciale en raison de la présence des peptides de liaison entre l’enzyme et le marqueur histidine à l’extrémité N-terminale. L’ADN polymérase Taq a été produite avec succès avec 0,98 mg/L de culture de protéines pures d’E. coli .

Expression et purification de la transcriptase inverse MMLV marquée à la fois His- et Strep-Tagged MMLV
Le système d’expression du baculovirus a été utilisé pour exprimer MMLV-RT avec un double His C-terminal et un marqueur streptocoque dans des cellules d’insectes (Sf9) comme décrit dans la figure 2A. Une étude antérieure a montré que le MMLV-RT marqué par C-terminale présente une activité plus élevée lorsque la protéine marquée N-terminale et la protéine marquée C-terminale ont été synthétisées chez les vers à soie à l’aide du système de vecteur d’expression du ver à soie-baculovirus (ver à soie-BEVS)41. Pour produire une protéine MMLV-RT homogène, les mêmes stratégies et protocoles ont été utilisés que ceux présentés dans l’étude mentionnée ci-dessus. En conséquence, une expression améliorée et plus de 95 % de protéines pures ont été obtenues avec un rendement de 7,5 mg/L de culture de cellules d’insectes, comme le montre le résultat du gel SDS-PAGE (Figure 2C).

Optimisation et standardisation de la qRT-PCR multiplexée
Un test RT-qPCR multiplexé optimisé et développé en interne a été assemblé et produit avec succès après des cycles d’optimisation du tampon et du mélange d’amorces pour détecter simultanément trois virus respiratoires courants différents (Figure 3)37. Le premier kit a été conçu pour cibler le gène N du SRAS-CoV-2, le gène de la grippe A H1N1 et H3N2 et le gène de la grippe B. et le deuxième kit est destiné au gène N du SRAS-CoV-2, aux gènes ORF1a et upE du MERS. Ainsi, les deux kits peuvent détecter avec succès et simultanément les trois cibles comme le montre le flux de travail présenté ici (Figure 3). Des échantillons d’ARN synthétique de chacun des virus utilisés dans ce protocole ont été amplifiés, indiquant la possibilité d’utiliser un kit multiplexé pour la détection des virus respiratoires courants. La sensibilité de ce test diagnostique est similaire aux résultats précédemment rapportés dans des échantillons de patients. Dans les cas où les patients présentent des symptômes pseudo-grippaux, l’utilisation d’une RT-qPCR multiplexée en temps réel a montré des résultats comparables avec le test multiplexé du SRAS-CoV-2, de la grippe A et de la grippe B45.

Sensibilité et limite de détection du kit RT-qPCR multiplexé interne vis-à-vis des virus respiratoires courants
L’efficacité du kit multiplexé interne a été évaluée à l’aide de deux ensembles de mélange d’amorces et de l’ARN synthétique correspondant pour chaque kit, comme illustré dans le flux de travail RT-qPCR multiplexé (Figure 3). En utilisant chaque mélange d’amorces avec une dilution en série de 10 fois de chaque mélange d’ARN synthétique allant de 10 à10 5 copies/μL comme modèle, la sensibilité, la spécificité et la limite de détection des deux RT-qPCR multiplexées développées peuvent être déterminées à l’aide d’une analyse de courbe standard. Cela se fait en trois répétitions indépendantes de chaque test, afin de confirmer l’efficacité et la cohérence du kit RT-qPCR multiplexé. En conséquence, les deux kits développés ici peuvent amplifier avec succès les trois gènes cibles simultanément avec aussi peu que 10 copies d’ARN/réaction, comme le montre la courbe d’amplification et la limite de détection (LoD) (Figure 4 et Figure 5). La pente et les valeurs R2 de chaque courbe ont été utilisées pour évaluer l’efficacité des essais individuels (Figure 4 et Figure 5). Les valeurs de R2 ont fourni une estimation de la qualité de l’ajustement linéaire aux points de données. Dans un test qPCR efficace, R2 doit être très proche ou supérieur à 0,90. Les efficacités d’amplification des titrages de la grippe A, de la grippe B et du SRAS-CoV-2 ou du MERS-CoV et du SRAS-CoV-2 étaient supérieures à 99 % pour tous les ensembles d’amorces (figure 4 et figure 5). De plus, les petites barres d’erreur prouvent la reproductibilité de chaque kit RT-qPCR multiplexé. Il est important de noter que les deux kits multiplexés n’ont montré aucune formation de dimères d’amorce car il n’y a pas d’amplification avec le témoin négatif (données non présentées). Ainsi, la conception des deux kits a permis d’amplifier avec succès tous les gènes cibles avec fiabilité, spécificité et sensibilité.

Figure 1 : Vue d’ensemble schématique de l’assemblage du kit RT-qPCR multiplexé en une seule étape. L’assemblage du kit commence par l’expression et la purification des enzymes nécessaires, l’ADN polymérase Taq et la transcriptase inverse MMLV. Les deux enzymes devaient être passées à travers deux colonnes, comme illustré. Deuxièmement, la purification a été suivie de l’optimisation des conditions de réaction et du programme de cyclage thermique, ce qui a permis d’obtenir des conditions optimales pour le kit d’essai multiplexé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Les constructions plasmidiques et les résultats de purification de His-Taq Pol et C-His/Strep MMLV-RT. (A) Représentation schématique des plasmides recombinants d’expression His-Taq Pol et C-His/Strep MMLV-RT. Abréviations : promoteur de l’ACPS - promoteur de la protéine A de choc thermique ; RBS - site de liaison des ribosomes ; 6x His - His-tag avec six histidines ; TEE - élément d’amélioration de la traduction ; Taq ORF - Cadre de lecture ouvert Taq Pol ; Polh - promoteur de polyhédrine ; MMLV-RT ORF - MMLV-RT cadre de lecture ouvert ; TEV - site de ciblage de la protéase virale de gravure ; 8x His - His-tag avec huit histidines ; Strep - Étiquette streptococcique ; polyA - Signal de polyadénylation tardive SV40. (B) Analyse SDS-PAGE de His-Taq Pol exprimé dans les cellules BL21(DE3) E. coli et Taq polymérase. (C) Analyse SDS-PAGE du MMLV-RT purifié C-His/Strep exprimé dans les cellules Sf9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Schéma de principe des deux kits RT-qPCR multiplexés en une étape optimisés, standardisés et développés, ainsi que des composants de réaction. Chaque réaction multiplexée est composée de dNTP, d’un mélange tampon, d’un mélange enzymatique, d’un mélange d’amorces multiplexées et de la matrice d’ARN synthétique à tester. (A) Influenza A/B, KIT SARS-CoV-2 et (B) MERS ORF1a/upE, SARS-CoV-2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Les courbes d’amplification et la limite de détection pour le kit RT-qPCR en une étape multiplex de la grippe A/B et du SRAS-CoV2. Les courbes d’amplification de la RT-qPCR multiplexée ont été réalisées à l’aide d’un mélange d’ARN synthétique avec des dilutions en série 10 fois (10 à 105 copies/μL) avec toutes les cibles (A) Grippe A, (C) Grippe B et (E) SARS-CoV-2. Les réactions ont été réalisées en trois exemplaires, en montrant une réplique à titre d’exemple. La limite de détection de (B) la grippe A, (D) la grippe B et (F) le SRAS-CoV-2 a été déterminée en traçant la moyenne de trois valeurs Ct répliquées par rapport au nombre de copies logarithmiques. Le coefficient de détermination (R2) et l’équation de la courbe de régression linéaire ont été calculés et représentés dans chaque panneau. Les barres d’erreur représentent l’écart type entre trois répétitions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Les courbes d’amplification et la limite de détection pour le MERS ORF1a/upE et le kit RT-qPCR multiplex en une étape du SARS-CoV2. Les courbes d’amplification de la RT-qPCR multiplexée ont été réalisées à l’aide d’un mélange d’ARN synthétique avec des dilutions en série 10 fois (10 à 105 copies/μL) avec toutes les cibles (A) MERS ORF1a, (C) MERS upE et (E) SARS-Cov-2. Les réactions ont été réalisées en trois exemplaires, en montrant une réplique à titre d’exemple. La limite de détection de (B) MERS ORF1a, (D) MERS upE et (F) SARS-CoV-2 a été déterminée en traçant la moyenne de trois valeurs Ct répliquées par rapport au nombre de copies logarithmiques. Le coefficient de détermination (R2) et l’équation de la courbe de régression linéaire ont été calculés et représentés dans chaque panneau. Les barres d’erreur représentent l’écart type entre trois répétitions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : La liste des composants du tampon de lyse par polymérase Taq. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Tampons de purification de la polymérase Taq. La liste des composants tampons nécessaires à la purification en deux colonnes de l’ADN polymérase Taq. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Tampon de stockage de la polymérase Taq. La liste des composants tampons nécessaires à la dialyse de l’ADN polymérase Taq après purification. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 : La liste des composants du tampon de lyse MMLV-RT. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5 : Tampons de purification MMLV-RT. La liste des composants tampons nécessaires à la purification à deux colonnes de MMLV-RT. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 6 : Mémoire tampon de stockage MMLV-RT. La liste des composants tampons nécessaires à la dialyse du MMLV-RT après purification. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 7 : Informations sur les amorces et les sondes. Informations sur la séquence des amorces et des sondes nécessaires pour chaque mélange d’amorces multiplexées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.