Imagerie en temps réel de la dynamique acrosomique du calcium et de l’exocytose dans les spermatozoïdes de souris vivants

Les spermatozoïdes acquièrent la capacité de féconder au cours d’un processus appelé capacitation¹. L’un des points d’évaluation de ce processus est que les spermatozoïdes acquièrent la capacité de subir un EI. Plus de deux décennies de données confirment la présence d’un modèle complexe d’EI en plusieurs étapes dans les spermatozoïdes de mammifères (résumé en ^2,3). Cependant, l’étude de l’EI dans les spermatozoïdes vivants est difficile, et les méthodes actuellement disponibles pour surveiller ce processus avec une résolution adéquate sont lourdes et nécessitent de multiples étapes de préparation⁴, sont limitées à la détection de l’étape finale de l’EI (par exemple, à l’aide de PNA⁵), sont limitées aux mesures des changements dans le calcium cytosolique (contrairement à la dynamique acrosomale du calcium), ou sont limités à des mesures de la dynamique du calcium cytosolique ou de l’AE⁶.

Afin de surmonter certaines des principales limites des études d’EI en temps réel dans des conditions physiologiques et d’étudier l’interaction entre la dynamique du calcium et l’AE, un modèle murin unique a été généré. Dans ce modèle murin, une protéine de fusion composée du capteur Ca²⁺ (GCaMP3) et de mCherry est exprimée et ciblée sur l’acrosome à l’aide d’un promoteur d’acrosine et d’un peptide de signalisation². Le double capteur ciblé GCaMP3-mCherry permet de mesurer simultanément en temps réel les concentrations de calcium et l’état du contenu acrosomique dans les spermatozoïdes vivants dans des conditions physiologiques à l’aide de la microscopie et d’un système d’administration de stimulants unicellulaires (Figure 1). En tant que composant de la matrice acrosomique, la fusion membranaire et l’AE entraîneraient la perte de la fluorescence mCherry photostable et insensible au pH du spermatozoïde, car cette protéine diffuse hors de la vésicule acrosomique. À cet égard, la capacité du modèle à refléter le moment et l’occurrence de l’EI s’apparente aux avantages de la lignée de souris GFP^ciblant l’acrosome ^7,8,9.

La variante GCaMP3 utilisée dans cette lignée de souris transgéniques a un KD approximatif de 400 μM et une plage dynamique pour Ca²⁺ de 10-4-10-3 M¹⁰, ce qui convient à cette vésicule. Nous avons montré que cette combinaison de caractéristiques de GCaMP3 pouvait révéler la formation de pores de fusion entre la membrane plasmique et la membrane acrosomique externe (OAM)². La détection des pores de fusion est le résultat du fait que la taille des pores est trop petite pour permettre à la protéine AcroSensE de se disperser hors de l’acrosome (via la perte de contenu en acrosome) tout en fournissant un « canal » membranaire qui permet l’afflux d’ions Ca²⁺ dans la lumière de l’acrosome, conduisant à une augmentation de l’intensité de fluorescence du GCaMP3.

La protéine fluorescente mCherry, brillante et monomère et non sensible au calcium, permet de visualiser l’acrosome lorsque le signal GCaMP3 est faible (par exemple, avant la liaison au Ca²⁺ , Figure 2) et, surtout, elle permet également d’identifier des spermatozoïdes intacts dans l’acrosome adaptés à l’imagerie.

Le protocole suivant décrit l’utilisation du modèle murin unique AcroSensE et les méthodes de microscopie utilisées expérimentalement pour étudier la dynamique de l’AE et du calcium des spermatozoïdes avec une haute résolution spatiale et temporelle.

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été effectuées conformément aux lignes directrices et approuvées par le Comité institutionnel sur le soin et l’utilisation des animaux de l’Université Cornell (#2002-0095). Des souris AcroSensE 2 âgées de 8 à 10^{semaines ont été} utilisées pour la présente étude. Les demandes d’informations sur la disponibilité des souris AcroSensE peuvent être adressées à l’auteur correspondant.

1. Collecte et lavage du sperme

1. Prélever des spermatozoïdes épididymaires de la caudale (plus de détails sur cette procédure sont fournis dans^{la section 11}) de souris AcroSensE. Attendre 15 minutes dans une boîte de culture tissulaire de 3,5 cm contenant 0,5 mL de milieu de Whitten modifié (MW) à 37 °C. La parabole doit être couverte pour réduire l’évaporation du MW et doit être inclinée de manière à ce que le milieu ait suffisamment de profondeur pour couvrir les épididymes de la cauda.
   REMARQUE : Le milieu de Whitten modifié (MW) comprend 22 mM de HEPES, 1,2 mM de MgCl₂, 100 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 1 mM d’acide pyruvique, 4,8 mM d’acide lactique hémi-Ca²⁺ , pH 7,35. Le glucose (5,5 mM), le NaHCO₃ (10 mM) et la 2-hydroxypropyl--cyclodextrine (CD ; 3 mM) sont complétés (voir le tableau des matériaux) au besoin pour l’induction de la capacitation, et les concentrations peuvent être modifiées pour des expériences spécifiques. De plus, d’autres accepteurs de stérols pourraient être utilisés à la place de la CD (p. ex., albumine sérique bovine ou lipoprotéines de haute densité).
2. À l’aide d’une pince fine, retirez tout tissu épididymaire de la boîte de collecte. Transvaser le milieu contenant les spermatozoïdes dans un tube conique de 15 mL et centrifuger la suspension à 100 x g pendant 1 min dans un rotor à godets oscillants à température ambiante. À l’aide d’une pipette en plastique, retirez le surnageant MW contenant les spermatozoïdes de tous les débris tissulaires grossiers qui se seront enroulés à cette étape.
3. Porter le surnageant MW contenant les spermatozoïdes à un volume total de 3 mL en ajoutant MW à 37 °C. Centrifuger à 400 x g pendant 8 min (à température ambiante) dans un tube à fond rond. Retirez lentement le surnageant de MW du sperme granulé lâchement.
4. S’il est viable, le sperme devrait apparaître sous la forme d’une pastille d’apparence « duveteuse ». Remettre doucement les spermatozoïdes en suspension par trituration à l’aide d’une pipette de transfert de gros calibre ou en tapotant doucement manuellement sur le tube (« effleurement des doigts »). Une fois remis en suspension uniformément, transférez-les dans un nouveau tube à fond rond. Utilisez 10 à 20 μL de la suspension de spermatozoïdes pour compter et évaluer la motilité. Diluer le sperme dans MW pour l’utiliser.
   REMARQUE : Pour la plupart des expériences impliquant la capacitation de spermatozoïdes de souris, une concentration finale de 5 à 10 millions de spermatozoïdes/mL MW est utilisée. Le protocole d’imagerie décrit ici ne nécessite pas la capacitation des spermatozoïdes, bien qu’il soit nécessaire que les spermatozoïdes acquièrent la capacité de subir une exocytose acrosomique physiologiquement pertinente. On pourrait étudier l’exocytose pathologique ou l’exocytose induite par des réactifs tels qu’un ionophore de calcium sans capaciter les spermatozoïdes. De plus, on pourrait explorer les changements potentiels du calcium acrosomique dans les cellules non capacites en réponse à divers stimuli.
5. Utilisez le sperme dans les 3 à 5 heures suivant le prélèvement, en gardant le temps aussi court que possible et cohérent entre les essais expérimentaux.
6. Effectuer toutes les étapes de collecte et de lavage à 37 °C à l’aide d’un milieu MW, en utilisant des méthodes pour minimiser les dommages à la membrane. Cela inclut l’utilisation de pipettes de transfert en plastique de grand diamètre ou de pointes de pipette à grand orifice, qui sont recommandées pour une utilisation à toutes les étapes de la procédure.

2. Revêtement en poly-D-lysine des plaques de lamelles pour l’imagerie

REMARQUE : Les plats en poly-D-lysine (PDL) doivent être préparés frais avant chaque expérience.

1. Distribuer une gouttelette de 0,5 μL de PDL (0,5 mg/mL, voir le tableau des matériaux) au centre d’une lamelle.
2. À l’aide d’une pointe graduée de 10 μL, étalez la gouttelette PDL sur la lamelle (motif entrecroisé comme illustré à la figure 1B).
3. Laisser sécher à 37 °C pendant 10 min. Conservez la vaisselle recouverte de PDL couverte et à 37 °C jusqu’à utilisation.

3. Tirage capillaire, chargement pour le soufflage

1. Tirez les capillaires en verre borosilicaté (O.D, 2 mm, D.I., 1,56 mm, voir le tableau des matériaux) en utilisant les réglages suivants : Chaleur : 330, Traction : 250, Vitesse : 250 et Temps : 70. Cette étape doit être optimisée pour l’extracteur spécifique utilisé.
2. Avant chaque expérience, chargez un seul capillaire avec la solution stimulante contenant 3 à 5 fois la concentration du stimulant (pour tenir compte de la diffusion rapide de la solution lors de la bouffée). Avant le remplissage, utilisez une pince à épiler fine pour ouvrir l’extrémité capillaire à environ 1-2 mm de l’extrémité. Cela devrait produire un diamètre d’ouverture de ∼5 μm. Le polissage à chaud n’est pas nécessaire.
3. À l’aide d’une fine pipette de transfert en plastique, injectez lentement la solution stimulante dans le capillaire jusqu’à ce que les trois quarts de sa longueur soient pleins.
4. Éliminez les bulles d’air formées lors du remplissage en effleurant doucement le capillaire.
5. Montez le capillaire rempli sur le micromanipulateur (voir le tableau des matériaux).

4. Préparation de la livraison de la stimulation pour la bouffée

REMARQUE : Pour minimiser le risque de blessure de l’utilisateur, des lunettes de sécurité doivent être portées pendant le fonctionnement de la procédure de bouffée.

1. Configurez les paramètres du système de distribution à cellule unique pour fournir une impulsion de 10 s à 5 psi.
2. Connectez le capillaire borosilicaté au porte-pipette du système d’administration à cellule unique. Assurez-vous que les joints sont bien serrés.
3. Tout en observant l’embout capillaire, appliquez une courte bouffée de 2 s à 20 psi pour vous assurer que la solution est bien distribuée par l’extrémité de l’embout (une petite goutte doit être évidente à l’extrémité de l’embout).

5. Microscopie et acquisition d’images

REMARQUE : Plusieurs marques de microscopes sont disponibles et peuvent être utilisées ; Cependant, une fréquence d’images minimale de 3 images/s est souhaitable. En ce qui concerne le contrôle de la température et de l’environnement, veuillez noter que la température réelle du fluide dans la boîte doit être confirmée, par exemple, à l’aide d’un thermomètre infrarouge sans contact.

1. Ajouter 80 μL de spermatozoïdes dilués au centre d’une boîte de lamelles de 35 mm recouverte de poly-D-lysine. Pour la plupart des expériences impliquant la capacitation des spermatozoïdes de souris, une concentration finale de 5 à 10 millions de spermatozoïdes/ml est utilisée.
2. Ajouter lentement au sperme 3 mL de milieu de base MW chaud (37 °C) complété par 10 mM de CaCl₂.
   REMARQUE : On pourrait effectuer des expériences à température ambiante pour ralentir les processus cellulaires, mais il est important de noter que parce que la capacitation est médiée par les échanges lipidiques et la fluidité des micro- et macro-domaines, il faut garder à l’esprit que la capacitation physiologiquement pertinente et l’exocytose de l’acrosome sont des processus dépendants de la température.
3. Montez la boîte avec le sperme sur le microscope (préchauffé à 37 °C).
4. Excitez le GCaMP3 à l’aide d’une ligne laser de 488 nm et visualisez avec un filtre passe-bande (BP) de 505 à 550 nm. Excitez le mCherry à l’aide d’une ligne laser de 555 nm et visualisez avec un filtre BP de 575-615 nm.
5. À l’aide d’un micromanipulateur (il est recommandé de fixer le manipulateur à la table d’air sur laquelle le microscope a été installé), positionnez la pointe du capillaire à environ 100 μm sur le côté et à 5-10 μm au-dessus du plan de la cellule d’intérêt.
   REMARQUE : Les solutions stimulantes sont fabriquées à 3-5 fois la concentration normale pour compenser la diffusion rapide qui se produit dans le volume entre le capillaire et la cellule.
6. Démarrez la séquence d’imagerie sur le microscope.
7. Imagez des spermatozoïdes à une fréquence d’images élevée, de préférence >10 images/s. Ici, un scanner résonant a été utilisé qui permet d’obtenir des images à 33 ms/image.
8. Dix secondes après avoir démarré l’acquisition de l’image sur le microscope, activez le système d’administration de la cellule unique pour initier la bouffée de stimulant de 10 s.
9. Cellules d’image pour une durée de 10 à 15 min.
10. À l’aide du système d’administration à cellule unique, imagez plusieurs cellules d’une seule boîte en fonction des emplacements indiqués à la figure 1B.
    REMARQUE : Les spermatozoïdes non traités/non stimulés au microscope doivent apparaître principalement rouges, avec une faible intensité du signal vert. Les têtes de spermatozoïdes doivent être attachées à la lamelle, et les spermatozoïdes vivants peuvent être identifiés par leurs queues mobiles. Dans les spermatozoïdes qui subissent un AE, le signal vert GCaMP3 augmentera initialement, et le signal rouge mCherry et le signal vert GCaMP3 disparaîtront si l’AE est complet, comme illustré à la figure 2. La réduction de la fluorescence mCherry fournit un indicateur plus précis du moment où l’AE commence, car les changements dans les concentrations de Ca²⁺ entraîneront continuellement des changements dans l’intensité de la fluorescence GCaMP3.

6. Analyse d’images et de données

REMARQUE : L’analyse d’image hors ligne est effectuée à l’aide d’ImageJ (voir le tableau des matériaux). Auparavant, plusieurs étapes intermédiaires ont été rapportées dans le processus menant à l’AE, y compris l’élévation acrosomique du calcium (ACR) et la fusion membranaire complète. Ce dernier conduit à la perte de la fluorescence mCherry et représente donc un AE complet. Dans certaines cellules, des signaux similaires à ceux des événements antérieurs au pied de pointe (PSF) sont observés lors de l’utilisation d’approches ampérométriques dans les études d’exocytose (pour plus de détails, voir²). Plusieurs méthodes optionnelles sont disponibles pour analyser les données brutes d’AcroSensE afin de quantifier l’ACR, l’AE et ses étapes intermédiaires. Ce qui suit décrit quelques-unes des méthodes analytiques de base.

1. En fonction de l’extension de fichier spécifique du système de microscope, utilisez l’outil Split Channel (Image > Colors > Split Channels) pour générer des fenêtres individuelles pour les canaux GCaMP3 et mCherry.
2. Synchronisez les différentes fenêtres à l’aide de l’outil « Synchroniser la fenêtre » (Analyser > Outils > Synchroniser les fenêtres).
3. Sélectionnez une région d’intérêt (ROI) autour de la tête du spermatozoïde dans le canal rouge pour inclure la région de l’acrosome (Figure 3A,B). L’outil de synchronisation permet d’appliquer automatiquement la même sélection de zone sur le canal vert, dans lequel les spermatozoïdes sont encore trop faibles pour être visibles.
4. Choisissez le plugin « Z Profiler » (Plugins > Stacks > Z Profiler) ou « Time Series Analyzer » (Plugins > Stacks > Time Series Analyzer) pour tracer le changement d’intensité de fluorescence en fonction du nombre d’images/temps pour chacun des deux canaux.
5. Copiez les données dans un tableur (p. ex., Microsoft Excel) pour les tracer et les analyser plus en profondeur.
   REMARQUE : Une fois les données copiées dans une feuille de calcul, plusieurs paramètres peuvent être extraits pour l’analyse, notamment les suivants, comme illustré à la figure 4.
   1. Heure de début du pore de fusion (FP) : mesurez le temps entre le point temporel 0 et le moment où le signal GCaMP3 commence à monter. Ce paramètre indique le délai entre la stimulation et la réponse ACR des spermatozoïdes.
   2. Heure de début de l’exposition automatique : mesurez le temps écoulé entre le point temporel 0 et le moment où le signal mCherry commence à se dégrader. Ce paramètre indique le délai entre la stimulation et la réponse AE des spermatozoïdes. Ce paramètre pourrait également être utilisé pour calculer le délai entre la formation de FP et la réponse d’AE.
   3. Amplitude de crête FP : mesure le signal de fluorescence de la base au pic de l’élévation du signal GCaMP3. Ce paramètre indique l’augmentation totale de la réponse de l’ACR.
   4. Taux de perte de mCherry : déterminer ce paramètre par un ajustement linéaire ou exponentiel sur la section de perte de signal mCherry (comme indiqué par « pente » dans la Figure 4B).
      REMARQUE : Vous pouvez également déterminer le taux de décroissance par la méthode du signal résiduel (R) à différents points temporels (par exemple, R60 : durée en secondes jusqu’à un signal résiduel de 60 % par rapport à la ligne de base du signal mCherry). Ce paramètre peut être utilisé pour quantifier la vitesse à laquelle le contenu acrosomique est dispersé lors de l’AE.
   5. Diminution du signal pour la perte de mCherry : déterminer la différence d’amplitude entre l’intensité de fluorescence de base de mCherry et le signal suivant l’AE. Ce paramètre indique la quantité totale de contenu acrosomique dispersée lors de l’AE.
   6. Tracez les changements de fluorescence (F) pour les canaux rouge et vert en tant que données brutes, ou normalisez-les par la fluorescence initiale (F0) et exprimez-les sous la forme ΔF/F0. Ce dernier permet de mieux visualiser les changements en rouge et en vert sur un même graphique (voir par exemple la figure 3D et la figure 3H).
      REMARQUE : Enfin, les différents paramètres mesurés peuvent être comparés entre différentes conditions afin de déterminer la relation entre les changements de la concentration acrosomique de calcium et l’AE. Pour des exemples de comparaisons de conditions expérimentales, voir la référence².

La figure 2 fournit une illustration simplifiée montrant la séquence des changements de fluorescence attendus après la stimulation réussie des spermatozoïdes. Le panneau supérieur de la figure 2 illustre les changements dans l’intensité de fluorescence de GCaMP3, où le signal est initialement faible (les concentrations de calcium acrosomique de base sont inférieures à GCaMP3 KD), et lors de l’entrée d’ions calcium par les pores de fusion, la luminosité de la fluorescence augmente. Enfin, lors de l’AE, il y a une perte de signal due à la diffusion et à la perte du capteur dans l’espace extracellulaire. Le panneau inférieur de la figure 2 illustre les changements dans l’intensité de fluorescence mCherry, où le signal initial est brillant, et ce n’est qu’après l’AE et la diffusion du capteur ainsi que d’autres contenus de la matrice acrosomique que le signal rouge s’estompe.

La figure 3 fournit des données mesurées réelles pour les stades illustrés ci-dessus chez deux spermatozoïdes vivants stimulés avec 125 μM du ganglioside GM1 (pour plus de détails sur la façon dont GM1 régule l’AE dans les spermatozoïdes12), capturés dans un seul champ de vision. Les figures 3A, B et 3E, F montrent les signaux rouges et verts mesurés chez deux spermatozoïdes au point de temps 0 (avant la stimulation), où initialement, le signal mCherry est brillant et le GCaMP3 est faible. La figure 3C, la figure 3G et la figure 3D, la figure 3H fournissent l’analyse Z Profiler pour toute la durée de l’expérience (données brutes ou F/F0, respectivement). Les panneaux d’insertion fournissent une vue agrandie de la fenêtre temporelle où l’ACR et l’AE se produisent.

Étant donné que les spermatozoïdes sont à la fois très hétérogènes et très sensibles aux dommages membranaires dus à diverses procédures de manipulation, la figure 5 fournit des exemples de deux types de résultats négatifs. Les figures 5A et C montrent plusieurs spermatozoïdes capturés dans un champ de vision. Le contour jaune met en évidence deux spermatozoïdes qui présentent un signal GCaMP3 élevé au point de temps 0 (avant la stimulation). Dans les expériences actuelles, de telles cellules ont été évitées, car elles indiquent que la vésicule acrosomique est déjà en train de subir un processus de fusion membranaire ou qu’elles ont subi des dommages membranaires qui permettent au calcium de s’échapper. Les spermatozoïdes de la figure 5A indiqués par la flèche (cercle ROI dans les figures 5A, C) montrent un signal mCherry initial mais aucune réponse dans les canaux rouge ou vert (Figure 5B, D, respectivement, montrant la fenêtre d’analyse Z-Profiler telle que fournie par ImageJ) après une stimulation avec 125 μM GM1. Bien qu’une sous-population de spermatozoïdes, comme celle présentée dans cet exemple, ne montre aucune réponse à la stimulation, ceux-ci sont inclus dans l’analyse finale et sont calculés dans l’analyse des données de réponseen pourcentage 2 (figure 3).

Figure 1 : Instrumentation et dispositif expérimental. (A) Spermatozoïdes vivants sur une boîte de lamelles revêtue de PDL placée dans une chambre d’incubation à 37 °C. Un capillaire borosilicaté, tiré et attaché à un système d’administration unicellulaire, est positionné près du spermatozoïde au centre de la zone d’imagerie pour l’administration directe de stimulants. Les canaux vert (GCaMP3) et rouge (mCherry) sont surveillés en permanence et enregistrés à une fréquence d’images élevée (par exemple, 10 images/s) pendant la stimulation. (B) Représentation schématique du modèle de dépôt PDL sur la parabole de couvercle. (C) Représentation schématique des zones spécifiques de la boîte où les spermatozoïdes peuvent être stimulés à l’aide du capillaire afin de minimiser la stimulation non spécifique des bouffées précédentes dans la même boîte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Changements dans le signal et l’intensité de la fluorescence. Panneau supérieur : Une augmentation du signal GCaMP3 signifie un afflux de calcium dans l’acrosome, suivi d’une perte de signal due à la diffusion de la protéine de fusion AcroSensE. Panneau inférieur : le signal mCherry reste stable lors de la fusion membranaire initiale, avec une atténuation ultérieure lors de la diffusion d’AcroSensE et de l’exocytose acrosomique (AE). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Données représentatives et traces de fluorescence. Un champ contenant deux spermatozoïdes a été imagé. La fluorescence du canal vert/rouge a été quantifiée hors ligne à l’aide d’ImageJ et tracée dans Excel (comme décrit à l’étape 6). (A-D) Quantification de l’intensité de fluorescence des canaux rouge (A) et vert (B) pour la cellule #1 au fil du temps, calculée pour des retours d’intérêt sélectionnés, puis présentée sous forme de données brutes (C) ou normalisée au signal initial (D, F/F0). L’encart en (D) fournit une vue agrandie de la période de 25 à 125 s. (E-H) Quantification de l’intensité de fluorescence des canaux rouge (E) et vert (F) pour la cellule #2 au fil du temps, calculée pour des ROI sélectionnés, puis présentée sous forme de données brutes (G) ou normalisée au signal initial (H, F/F0). L’insertion (H) permet d’agrandir la période de 25 à 125 s. Barre d’échelle = 5 μm. Tous les axes des x représentent le temps en secondes (s). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Paramètres d’analyse et de quantification des données. (A) Illustration d’un tracé typique de l’intensité de fluorescence GCaMP3, affichant des paramètres quantifiables, y compris l’heure de début (secondes), l’amplitude (intensité de fluorescence) et la durée (secondes). (B) Illustration d’une trace typique de l’intensité de fluorescence mCherry, affichant des paramètres quantifiables, notamment l’heure de début (secondes), la durée (secondes), la pente (F/s), le R60 (intensité de fluorescence) et l’amplitude (intensité de fluorescence). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Résultats négatifs. (A,C) Canaux mCherry (rouge) et GCaMP3 (vert) montrant plusieurs spermatozoïdes capturés dans un seul champ de vision. La flèche en (A) indique un spermatozoïde présentant initialement une fluorescence mCherry, mais aucun changement ultérieur de l’intensité de la fluorescence en réponse à une stimulation GM1 de 125 μM, comme observé dans les traces générées par le profileur Z fournies dans (B) (mCherry) et (D) (GCaMP3). Les cellules à l’intérieur du rectangle jaune présentent une intensité de fluorescence GCaMP3 élevée au point de temps 0, avant la stimulation. Barre d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Aucun auteur n’a de conflit d’intérêts à signaler en lien avec ce travail.