Imagerie en temps réel de la dynamique acrosomique du calcium et de l’exocytose dans les spermatozoïdes de souris vivants

Résumé

Le modèle murin AcroSensE et les méthodes d’imagerie de cellules vivantes décrits ici offrent une nouvelle approche pour étudier la dynamique du calcium dans le compartiment subcellulaire de l’acrosome des spermatozoïdes et comment ils régulent les étapes intermédiaires menant à la fusion membranaire et à l’exocytose de l’acrosome.

Résumé

L’exocytose de l’acrosome (AE), dans laquelle la vésicule exocytotique unique du spermatozoïde fusionne avec la membrane plasmique, est un processus complexe, dépendant du calcium, essentiel à la fécondation. Cependant, notre compréhension de la façon dont la signalisation calcique régule l’AE est encore incomplète. En particulier, l’interaction entre la dynamique calcique intra-acrosomique et les étapes intermédiaires menant à l’EI n’est pas bien définie. Nous décrivons ici une méthode qui fournit des informations spatiales et temporelles sur la dynamique acrosomique du calcium et sa relation avec la fusion membranaire et l’exocytose subséquente de la vésicule acrosomique. La méthode utilise une nouvelle souris transgénique exprimant un capteur d’exocytose ciblant l’acrosome (AcroSensE). Le capteur combine un indicateur de calcium génétiquement codé (GCaMP) fusionné avec mCherry. Cette protéine de fusion a été spécialement conçue pour permettre l’observation simultanée de la dynamique acrosomique du calcium et des événements de fusion membranaire. La surveillance en temps réel de la dynamique acrosomale du calcium et de l’EI dans les spermatozoïdes vivants d’AcroSensE est réalisée à l’aide d’une combinaison d’imagerie à fréquence d’images élevée et d’un système d’administration stimulant qui peut cibler un seul spermatozoïde. Ce protocole fournit également plusieurs exemples de méthodes de base pour quantifier et analyser les données brutes. Étant donné que le modèle AcroSensE est génétiquement codé, son importance scientifique peut être augmentée en utilisant des outils génétiques facilement disponibles, tels que le croisement avec d’autres modèles génétiques de souris ou des méthodes basées sur l’édition de gènes (CRISPR). Grâce à cette stratégie, les rôles des voies de signalisation supplémentaires dans la capacitation et la fécondation des spermatozoïdes peuvent être résolus. En résumé, la méthode décrite ici fournit un outil pratique et efficace pour étudier la dynamique du calcium dans un compartiment subcellulaire spécifique - l’acrosome des spermatozoïdes - et comment cette dynamique régule les étapes intermédiaires menant à la fusion membranaire et à l’exocytose de l’acrosome.

Introduction

Les spermatozoïdes acquièrent la capacité de féconder au cours d’un processus appelé capacitation¹. L’un des points d’évaluation de ce processus est que les spermatozoïdes acquièrent la capacité de subir un EI. Plus de deux décennies de données confirment la présence d’un modèle complexe d’EI en plusieurs étapes dans les spermatozoïdes de mammifères (résumé en ^2,3). Cependant, l’étude de l’EI dans les spermatozoïdes vivants est difficile, et les méthodes actuellement disponibles pour surveiller ce processus avec une résolution adéquate sont lourdes et nécessitent de multiples étapes de ....

Protocole

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été effectuées conformément aux lignes directrices et approuvées par le Comité institutionnel sur le soin et l’utilisation des animaux de l’Université Cornell (#2002-0095). Des souris AcroSensE 2 âgées de 8 à 10^{semaines ont été} utilisées pour la présente étude. Les demandes d’informations sur la disponibilité des souris AcroSensE peuvent être adressées à l’auteur correspondant.

1. Collecte et lavage du sperme

1. Prélever des spermatozoïdes épididymaires de la caudale (plus de détails sur cette procédure sont fournis dans^{la secti....}

Résultats

La figure 2 fournit une illustration simplifiée montrant la séquence des changements de fluorescence attendus après la stimulation réussie des spermatozoïdes. Le panneau supérieur de la figure 2 illustre les changements dans l’intensité de fluorescence de GCaMP3, où le signal est initialement faible (les concentrations de calcium acrosomique de base sont inférieures à GCaMP3 KD), et lors de l’entrée d’ions calcium par les pores de fusion, la luminosité .......

Discussion

Ici, une méthode basée sur la microscopie est décrite pour utiliser le modèle de souris AcroSensE nouvellement généré pour la surveillance et l’analyse en temps réel d’une cellule unique et l’analyse de l’interaction entre la dynamique acrosomique du calcium et les étapes intermédiaires menant à l’AE. Associés à des approches génétiques facilement accessibles, telles que le croisement avec d’autres modèles génétiques murins ou l’édition de gènes, ce modèle et cette méthode fournissent un système puissant pour étudier le .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
100x objectif à huile  ;	Olympus Japan
;	Sigma	C0926
Housse de 35 mm, épaisseur 1,5	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C  ;
Tube à fond rond de 5 mL	Falcon	352054
Borosilicate glass capilarries	Sutter Instrument Co., CA USA	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Microscope confocal	Olympus Japan	Olympus FluoView  ;
Glucose  ;	Sigma	G7528
Pointe graduée  ;	TipOne, États-Unis Scientific
HEPES	Sigma	H7006
ImageJ  ;	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Acide lactique	Sigma	G5889
Systèmes d’incubation de microscope à cellules vivantes  ;	TOKAI HIT Shizuoka, Japon	Modèle STX
MgCl2	Sigma	M8266
Extracteur de micropipettes  ;	Sutter Instrument Co., CA USA,	Modèle P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Pipette de transfert en plastique  ;	FisherBrand  ;	13-711-6M
Poly-D-lysine  ;	Sigma	P7280
Acide pyruvique	Sigma	107360
Système d’administration à cellule unique	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III

UPlanApo,2-hydroxypropyl-b-cyclodextrine