Summary
Bu protokol, Manyetik Arşimet etkisine dayalı mürekkepsiz, etiketsiz, substrattan bağımsız, yüksek verimli bir hücre desenleme yöntemini açıklar.
Abstract
Hücre konumlandırmasının hassas kontrolüne izin veren hücre modellemesi, hücre davranışının incelenmesinde benzersiz bir avantaj sunar. Bu protokolde, Manyetik-Arşimet (Mag-Arch) etkisine dayalı bir hücre modelleme stratejisi tanıtılmaktadır. Bu yaklaşım, mürekkep malzemeleri veya etiketleme parçacıkları kullanılmadan hücre dağılımının hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlar. Hücre kültürü ortamının manyetik duyarlılığını arttırmak için bir paramanyetik reaktif ekleyerek, hücreler mıknatıslar tarafından itilir ve kendilerini mikroakışkan substratın altına yerleştirilmiş mıknatıs setlerini tamamlayıcı bir desen halinde düzenler.
Bu makalede, Mag-Arch tabanlı stratejiyi kullanarak hücre modellemesi için ayrıntılı prosedürler sağlanmıştır. Tek hücreli tiplerin yanı sıra ko-kültür deneyleri için çoklu hücre tiplerini modelleme yöntemleri sunulmaktadır. Ek olarak, hücre modellemesi için kanallar içeren mikroakışkan cihazların imalatı için kapsamlı talimatlar sağlanmıştır. Paralel yöntemler kullanarak bu özelliği elde etmek zordur ancak basitleştirilmiş ve uygun maliyetli bir şekilde yapılabilir. Mag-Arch tabanlı hücre modellemesinin kullanılması, araştırmacıları in vitro araştırmalar için güçlü bir araçla donatır.
Introduction
Hücre modelleme, in vitro çalışmalar için sezgisel ve güçlü bir teknolojiye dönüşüyor1. Kültür plakalarındaki hücre konumlarını manipüle ederek, hücre göçü2, biyomimetik çok hücreli ko-kültür3, organoid montajı4, biyomateryal çalışmaları5 ve daha fazlası dahil olmak üzere çeşitli deneyler için çözümler sunar. Çoğu durumda, hücre desenleme için mürekkepsiz, etiketsiz bir yöntem tercih edilir, çünkü sonraki araştırmalar için kullanım kolaylığı ve yüksek hücre canlılığı sunar.
Mag-Arch etkisi, paramanyetik sıvılardaki diyamanyetik nesnelerin zayıf manyetik alanlara sahip bölgelere doğru hareket etme eğiliminde olduğu fiziksel bir olgudur6. Canlı hücreler doğal olarak diyamanyetiktir, hücre kültürü ortamı ise kontrast madde olarak nükleer manyetik rezonans görüntülemede intravenöz olarak yaygın olarak kullanılan gadopentetat dimeglumin (Gd-DTPA) gibi çözünür paramanyetik elementler eklenerek paramanyetik hale getirilebilir7. Sonuç olarak, hücrelerin çevredeki paramanyetik ortam tarafından itilmesi ve manyetik alanların daha zayıf olduğu bölgelere doğru hareket etmesi beklenir8. Desenli bir manyetik alan, bir dizi neodimyum mıknatıs kullanılarak kolayca oluşturulabilir. İdeal olarak, hücre desenleri mıknatıs desenlerine zıt olarak birleştirilir. Teknik olarak bu, etiketsiz bir yöntem olarak tanımlanır, çünkü tek ek reaktif olan Gd-DTPA, hücre dışı ortamda kalır ve hücrelere bağlanmaz. Böylece, sonraki hücre kültürü üzerindeki potansiyel etkiler, kültür ortamının değiştirilmesiyle kolayca önlenebilir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında 1,3,9,10, Mag-Arch tabanlı strateji, hücreleri pozitif olarak etiketlemek için biyo-mürekkep bileşenleri veya belirli parçacıkların uygulanmasını gerektirmez. Ayrıca, hücre yapışması için birden fazla substrat üzerinde çalıştığı ve yüksek verimli hücre modelleme yeteneğine sahip olduğugösterilmiştir 4.
Bu makale, cihaz imalatından hücre modelinin ayarlanmasına kadar her şeyi kapsayan, Mag-Arch tabanlı yöntemi kullanarak hücre modellemesi için ayrıntılı bir protokol sunar. Gösterdiğimiz desenlere ek olarak, kullanıcılar mıknatıslar ve Gd-DTPA çözümü kullanarak kolayca çeşitli hücre desenleri oluşturabilirler. Ayrıca, karmaşık ko-kültür kalıplarının birleştirilmesi ve kapalı mikroakışkan çiplerde hücrelerin manipüle edilmesi için protokoller de sağlanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mıknatıs setlerinin montajı
- Şerit desenleri için mıknatıs setlerini birleştirin.
- Şekil 1A'da gösterildiği gibi düz dikdörtgen mıknatıslar seçin. Bu gösteri için kullanılan dikdörtgen mıknatısların boyutları 1,5 mm × 10 mm × 35 mm'dir (kalınlık × yükseklik × uzunluk) (bkz. Mıknatısların kalınlığı, hücre şeritleri arasındaki boşlukları belirler.
- 2 mm kalınlığındaki silikon plakaları (Malzeme Tablosuna bakın) 2 mm × 8 mm × 30 mm dikdörtgenler halinde kesin. Montajı optimize etmek için bu silikon plakaların son iki boyutunun yukarıda belirtilen dikdörtgen mıknatıslarınkinden biraz daha küçük olduğundan emin olun. Silikon plakaların kalınlığı, hücre şeritlerinin genişliğini belirler.
- Dikdörtgen mıknatısları ve silikon plakaları Şekil 1A'da gösterildiği gibi katman katman birleştirin. Her bir mıknatıs seti 4 adet mıknatıs ve 3 adet silikon plakadan oluşmaktadır. Mıknatıs setlerinin içsel çekici kuvvet nedeniyle otomatik olarak hizalanabilmesi için her bir bitişik mıknatısın kutuplarının zıt olduğundan emin olun.
- Kullanmadan önce mıknatısları sterilize edin.
NOT: Mıknatıs setlerinin saf su ile yıkanması ve ardından 10 dakika boyunca %75 etanole batırılması tavsiye edilir. Bu mıknatıs setlerinin genel boyutları 12 mm × 10 mm × 35 mm'dir ve standart 6 oyuklu hücre kültürü plakalarına uyacak şekilde tasarlanmıştır.
- Nokta dizisi desenleri için mıknatıs setlerini birleştirin
- Şekil 1B'de gösterildiği gibi minyatür silindirik mıknatısları seçin. Bu gösteri için kullanılan silindirik mıknatısların boyutları, eksenel yönde mıknatıslanmış Φ1.5 mm × 10 mm'dir (çap × yükseklik).
- Silindirik mıknatısları Şekil 1B'de gösterildiği gibi birleştirin. Her mıknatıs setinin 6 × 6 ızgarada düzenlenmiş 36 silindirik mıknatıstan oluştuğundan emin olun. Ayrıca, mıknatıs setlerinin içsel çekim kuvveti nedeniyle otomatik olarak hizalanmasına izin vermek için her bir bitişik mıknatısın kutuplarının zıt olduğundan emin olun.
- Kullanmadan önce mıknatısları sterilize edin, adım 1.1.4'teki prosedürün aynısını izleyin. Bu mıknatıs setlerinin genel boyutları 9 mm × 10 mm × 9 mm'dir ve standart 6 oyuklu hücre kültürü plakalarına uyacak şekilde tasarlanmıştır.
2. Cam slaytlarda hücre deseni
- Hücre kültürü cihazını hazırlayın.
- Silikon kalıplar oluşturmak için 2 mm kalınlığında silikon plakalar kullanın. Plakada 1 cm × 1 cm dikdörtgen delik oluşturmak için bir zımba kullanın. Şekil 25C'de gösterildiği gibi, delik merkezde olacak şekilde yuvarlak bir kalıp (çap = 1 mm) yapmak için silikon plakayı deliğin etrafında kesin.
- Silikon kalıpları ultrasonik bir temizleyici kullanarak iyice temizleyin. Kalıpları 10 dakika saf suyla yıkayarak sterilize edin, ardından suyu 10 dakika daha %75 etanol ile değiştirin. Son olarak, kalıpları bir sterilizatör kutusunda 65 °C'de 60 dakika kurutun.
- Sterilize edilmiş silikon kalıbı Φ25 mm'lik yuvarlak bir cam hücre sürgüsüne takın ve Şekil 1C'de gösterildiği gibi silikonun cama yapışması için hafifçe bastırın. Elde edilen hücre kültürü cihazı, bir cam alt tarafa ve 200 μL'lik bir kültür boşluğuna sahip olacaktır. Cihazın boyutları Φ25 mm × 2,15 mm'dir, bu da onu standart 6 oyuklu hücre kültürü plakaları için uygun hale getirir.
NOT: Yukarıda açıklanan hücre kültürü cihazı, konfokal kaplar gibi alt kısımları 0,5 mm'den daha ince olan diğer Petri kapları ile değiştirilebilir. - Mıknatıs setlerini 6 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Kullanım kolaylığı için manyetik olmayan cımbız önerilir.
NOT: Sonraki tüm adımlar, bu noktadan hücre modellerinin gözlemlenmesine kadar steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. - Hücre kültürü cihazını, 6 oyuklu plakanın kuyusuna yerleştirilmiş mıknatısın üzerine yerleştirin. Hücre kültürü cihazının yatay olarak yerleştirildiğinden ve alt tarafının mıknatıs seti ile yakın temas halinde olduğundan emin olun.
- Gd-DTPA içeren hücre kültürü ortamını hazırlayın
- Genellikle 500 mM'lik bir konsantrasyonda, ticari olarak temin edilebilen Gd-DTPA enjeksiyonunu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız). 30 mM'lik bir hedef konsantrasyon elde etmek için 470 μL tam hücre kültürü ortamına 30 μL Gd-DTPA enjeksiyonu ekleyerek enjeksiyonu seyreltin.
NOT: Yerel düzenlemelere ve bulunabilirliğe bağlı olarak, aynı hedef konsantrasyona sahip diğer gadolinyum bazlı kontrast maddeler (GBCA'lar) benzer sonuçlar verebilir11.
- Genellikle 500 mM'lik bir konsantrasyonda, ticari olarak temin edilebilen Gd-DTPA enjeksiyonunu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız). 30 mM'lik bir hedef konsantrasyon elde etmek için 470 μL tam hücre kültürü ortamına 30 μL Gd-DTPA enjeksiyonu ekleyerek enjeksiyonu seyreltin.
- Hücre desenlerini oluşturun.
- Desenleme için hücreleri hasat edin. Bu demonstrasyonda, modelleme için insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC'ler, bkz . Malzeme Tablosu) kullanılmıştır (Şekil 2). Hücreleri süspansiyondan toplamak için 200 x g'da (oda sıcaklığında) 5 dakika santrifüjleyin ve Gd-DTPA içeren ortamda yeniden süspanse edin. Hücre yoğunluğunu sayın.
- Gd-DTPA içeren ortam ile hücre yoğunluğunu yaklaşık ~ 2 × 105 hücre / mL'ye ayarlayın. Hücre süspansiyonunu nazikçe karıştırın ve ağzına kadar dolu bir sıvı yüzey oluşturmak için her bir hücre kültürü kalıbının boşluğuna 200 μL ekleyin.
- Plakayı dikkatlice bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın ve hücreler substrata iyice yapışana kadar 3-6 saat inkübe edin. Hücre modellerinin montajına müdahale edilmesini önlemek için inkübatör kapısını çarpmaktan kaçının. Zayıf yapışma oranlarına sahip hücreler için, GBCA'larla gece tedavisi genellikle güvenlidir12.
- Hücreler, hücre kültürü cihazının boşluğunun dibine yapıştığında hücre desenlemesi tamamlanmış kabul edilir. Gd-DTPA içeren ortamı tam kültür ortamıyla değiştirin.
- Hücre kültürü cihazını mıknatıs setinden çıkarın. Hücre modeli hemen gözlemlenebilir veya daha fazla ekim için cihaz yeni bir kültür plakasına aktarılabilir.
3. Mıknatıs yanlarına doğru ortak kültür deseni: hareketli şablonun imalatı
NOT: Mag-Arch tabanlı hücre modellemesinden yararlanmak ve daha fazla uygulama olasılığını araştırmak için aşağıdaki prosedür sunulmuştur.
- 1. ve 2. adımları izleyerek cihazı şerit hücre deseni için hazırlayın. Bununla birlikte, hücre yoğunluğunu 1 × 105 hücre/mL'ye düşürün ve mıknatısları ayıran silikon plakaları daha ince olanlarla değiştirerek her şerit hücre desenini daha ince hale getirin.
NOT: Bu, birden çok hücreyi şerit desenlerinde yerleştirmek için yeterli alan sağlar. Referans olarak, mıknatısları ayırmak için 2 mm yerine 1 mm silikon plakalar kullanmanızı öneririz. - Adım 2.2-2.3'te gösterildiği gibi ilk hücre türünü modelleyin. Bu adım ayrıca hücre bağlantısı için 3-6 saat gerektirir.
NOT: Ko-kültür sistemindeki farklı hücre tiplerini ayırt etmek için kullanıcılar, desenlemeden önce hücreleri DiI, DiD gibi floresan boyalarla veya hücre izleyicilerle (CMTPX, CMFDA, CMAC, vb.) etiketleyebilir. Örneğin, DiI ve DiD boyama için, 1 mL FBS içermeyen ortam başına 1 μL stok çözeltisi (10 mM) ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve çalışan bir çözelti elde etmek için iyice karıştırın. Yapışık hücreleri örtmek için kültür ortamını çalışma solüsyonu ile değiştirin. 30 dakika inkübe ettikten ve PBS ile üç kez yıkadıktan sonra hücre toplamaya devam edin. - İlk tip hücreleri modelledikten sonra, Şekil 3Aii'de gösterildiği gibi, hücre kültürü cihazını aşağıdaki mıknatıslardan 1 mm sağa doğru hareket ettirin.
- Cam slaytları 200 μL PBS ile iki kez nazikçe yıkayın. Slaytların kurumasına izin vermeyin.
- İkinci hücre türünü, 2.2-2.3 adımlarında gösterildiği gibi desenlendirin.
- Hücre kültürü cihazını Şekil 3Aiii'de gösterildiği gibi aşağıdaki mıknatıslardan 1 mm sağa doğru hareket ettirin ve cam slaytları tekrar 200 μL PBS ile yıkayın. Üçüncü hücre türünü, 2.2-2.3 adımlarında gösterildiği gibi modelleyin.
- Tüm hücre tiplerini modelledikten sonra, cam slaytları iki kez 200 μL PBS ile nazikçe yıkayın ve tam hücre kültürü ortamı ile değiştirin.
- Hücre kültürü cihazını mıknatıs setinden çıkarın. Daha sonra hücre modeli gözlemlenebilir veya daha fazla ekim için cihaz yeni bir kültür plakasına aktarılabilir.
4. Gd-DTPA konsantrasyonunu ayarlayarak ko-kültür modellemesi
NOT: GBCA'lar, çalışma konsantrasyonlarında (≤75 mM) hücre yapışmasını veya müteakip büyümeyi önemli ölçüde etkilemez. Ek olarak, hücre kalıpları Gd-DTPA konsantrasyonundan etkilenir: daha yüksek konsantrasyonlar daha küçük / daha ince hücre kalıpları ile sonuçlanır. Böylece, sadece Gd-DTPA konsantrasyonunu ayarlayarak ko-kültür sistemleri oluşturmak mümkündür. Bu örnek, eşmerkezli dairesel dizilerin desenlenmesini gösterir.
- Adım 1.2'deki minyatür silindirik mıknatısları kullanarak 2.2-2.3 adımlarında gösterildiği gibi ilk hücre tipini modelleyin. Ko-kültür sistemindeki farklı hücre tiplerini ayırt etmek için hücreleri hasat etmeden önce DiI, DiD veya hücre izleyicileri gibi floresan boyalarla etiketleyin (bkz. adım 3).
NOT: Daha yüksek bir Gd-DTPA konsantrasyonuna (30 mM yerine 50 mM) ve daha düşük bir hücre yoğunluğuna, yaklaşık 1 × 105 hücre / mL'ye ihtiyaç duyulacaktır. - İlk hücre dizisini modelledikten sonra, cam slaytları iki kez 200 μL PBS ile nazikçe yıkayın. Slaytların kurumasına izin vermeyin.
- Daha önce olduğu gibi aynı yordamı izleyerek ikinci tür hücreleri modelleyin. Yerinden çıkmayı önlemek için cam kızakları mıknatıslar üzerinde nispeten hareketsiz tutun. Mıknatıs setlerini cam sürgünün alt yüzeyine oturtan içi boş bir silikon plakanın takılması önerilir.
NOT: Burada, Şekil 3B'de gösterildiği gibi, ikinci hücre modellerinin birinciden daha büyük olması beklenmesi için daha düşük bir Gd-DTPA konsantrasyonuna (30 mM yerine 20 mM) ihtiyaç duyulacaktır. - Tüm hücre tiplerini modelledikten sonra, cam slaytları iki kez 200 μL PBS ile nazikçe yıkayın ve ortamı tam hücre kültürü ortamıyla değiştirin.
- Hücre kültürü cihazını mıknatıs setinden çıkarın. Daha sonra hücre modeli gözlemlenebilir veya daha fazla ekim için cihaz yeni bir kültür plakasına aktarılabilir.
5. Mikroakışkan çipte hücre deseni
NOT: Mag-Arch tabanlı yöntemin kapalı dar odacıklarda çalıştığı bir önceki çalışmamızdagösterilmiştir 8. İşte bir mikroakışkan kanalda nokta dizilerinin modellenmesine bir örnek.
- Mikroakışkan çipinin imalatı
- Şekil 4A×da gösterildiği gibi, 24 mm 50 mm × 8 mm×lik dikdörtgen bir boşluk içeren 20 mm × 75 mm 4 mm Politetrafloroetilen (PTFE) kalıplarını (Malzeme Tablosuna bakın) özelleştirin.
- 0,5 mm kalınlığında bir silikon plakayı düzleştirin. Silikon plakaları, Şekil 4A,B'de gösterildiği gibi, hem giriş hem de çıkış taraflarında üçgen tampon alanları olan 15 mm × 20 mm × 0,5 mm dikdörtgen boşluğa sahip sıvı kanalının şekline göre kesin.
- 40 mm × 75 mm dikdörtgen cam plakaları özelleştirin. Cam plakaları 30 saniye boyunca hava plazması ile temizleyin.
- Hava plazma temizliğinden hemen sonra, cam plakaları 0,5 mL piyasada bulunan bir yapışma önleyici tamponla örtün (Malzeme Tablosuna bakın) ve havada kurumaya bırakın. Cam plakaları bir kez etanol ile yıkayın ve kurumaya bırakın.
- Adım 5.1.2'de hazırlanan bir silikon plakayı, Şekil 4A'da gösterildiği gibi bir cam plakanın ortasına sağlam bir şekilde takın.
- Polidimetilsiloksan (PDMS) prepolimerini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın (bkz. Her PDMS çipi için, 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 10 g baz bileşen ve 1 g sıkılaştırıcı madde tartın.
- Kolloid içinde küçük kabarcıklar eşit olarak dağılana kadar ajanları bir cam karıştırma çubuğuyla iyice karıştırın. Karıştırma, kolloid hacmine bağlı olarak 5-10 dakika sürer. Kabarcıkları gidermek için kolloid prepolimeri 500 x g'da (oda sıcaklığında) 1 dakika santrifüjleyin.
- PTFE kalıbını doldurmak için ~ 10 mL prepolimeri yavaşça boşluğa dökün.
- Kalıbı dikkatlice bir vakum haznesine yerleştirin ve prepolimerin akmasını önlemek için yatay tutun.
- Bir vakum pompası ile prepolimerden kalan hava kabarcıklarını çıkarın. Vakumlama 120-180 dakika sürer.
- Gerekirse, kalıp boşluğunu daha fazla doldurmak için daha fazla prepolimer dökün. 60 dakika daha vakumlayın.
- PTFE kalıbını, Şekil 4Bi'de gösterildiği gibi, silika tarafı boşluğa bakacak şekilde cam plaka ile dikkatlice kapatın.
- Tüm baloncukların ortadan kaldırıldığından emin olun. Prepolimerin gece boyunca katılaşması için kalıbı 60 °C'lik bir kurutma fırınına aktarın.
- Kalıbı fırından çıkarın. Soğuduktan sonra, katılaşmış PDMS kapağını dikkatlice kalıptan çıkarın. Φ1 mm iğne zımba ile bir giriş ve bir çıkış oluşturun.
- PDMS kapağını ve 24 mm × 50 mm kapak kızaklarını adım 2.1.2'ye göre yıkayın.
NOT: Steril koşullar altında aşağıdaki adımlarla devam edin. - Yaklaşık ~500 μm yüksekliğinde bir akış kanalı içeren bir mikroakışkan çipi oluşturmak için bir PDMS kapağı ve bir kapak sürgüsü takın. Alt taraf, Mag-Arch tabanlı strateji ile hücre desenini etkinleştirmek için ~0.15 mm'lik bir cam kapak sürgüsünden oluşmalıdır.
- Piyasada bulunan steril adaptörleri mikroakışkan çipinin8 hem girişine hem de çıkışına monte edin.
- % 2 (a/h, PBS içinde çözülmüş) jelatin kaplama tamponu hazırlayın. Tamponu otoklavlayarak sterilize edin.
- Jelatin kaplama tamponunu, 1 mL'lik bir şırınga kullanarak giriş adaptörü aracılığıyla çipe enjekte edin. Kabarcıklar ortaya çıkarsa, bunları ekstra kaplama tamponu ile yıkayın.
- Çipi 10 cm'lik bir hücre kültürü kabına yerleştirin. Kurumasını önlemek için kabın tabanına 1 mL PBS ekleyin. Çanağı bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Kaplama 30 dakika sürer.
- Kaplama tamponunu giriş yoluyla 2 mL Gd içeren ortam (30 mM) ile yıkayın.
- 1 mL'lik bir şırınga ile 30 mM Gd-DTPA içeren 1 mL hücre süspansiyonunu nazikçe enjekte edin.
- Adım 1.2'deki minyatür silindirik mıknatıslar kullanılarak 2.2-2.3 adımlarında gösterildiği gibi desen hücreleri.
NOT: Bununla birlikte, Şekil 4Ci'de gösterildiği gibi, mıknatıs setlerini cam sürgünün alt yüzeyine oturtan içi boş bir silikon plakanın takılması önerilir. - Desenlemeden sonra, Gd-DTPA içeren ortamı 1 mL'lik bir şırınga ile yıkayarak 1 mL tam ortamla nazikçe yenileyin.
NOT: Mikroakışkanlarda 5.7-5.9 adımlarından hücre desenleme işlemi yaklaşık 180 dakika sürer, bu da standart cam slaytlardaki hücre desenlemeye benzer. - Desenleri mikroskop altında ölçün. Gerekirse, daha fazla ekim için mikroakışkan çipini bir sirkülasyon kültürü cihazına bağlayın.
NOT: Deneyimlerimize göre, mikroakışkanlara bir hücre inkübatöründe sürekli bir taze kültür ortamı akışı sağlayan basit bir mikro pompa tabanlı cihaz tarafından desteklendiğinde hücreler en az 72 saat büyüyebilir8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dikdörtgen (1,5 mm × 10 mm × 35 mm) ve silindirik (Φ1,5 m × 10 mm) mıknatıslar seçilerek hücre desenleri oluşturuldu. Kullanıcılar, mıknatısların boyutunu ve şeklini değiştirme veya çeşitli hücre desenleri oluşturmak için bunları farklı şekilde bir araya getirme esnekliğine sahiptir. Şekil 1A,B'de mıknatıslar, netlik için manyetik kutuplar mavi (güney) ve kırmızı (kuzey) olarak gösterilecek şekilde birleştirilmiştir. Bu konfigürasyonda, mıknatıslar Şekil 2'de gösterildiği gibi birbirlerini yanal olarak çeker ve hizalanırlar. Şekil 1C,D, hücre kültürü cihazının yapısını ve hücre modelleme prosedürünü göstermektedir.
Şekil 2'de tek tip hücre desenleri gösterilmektedir. GFP etiketli HUVEC'ler floresan mikroskobu altında gözlem için kullanıldı. Hücreler, karşılık gelen mıknatıs setleri kullanılarak şerit ve nokta dizisi desenleri halinde düzenlendi. Cam slaytlara hızlı bir şekilde yapışan (120-180 dakika içinde) HUVEC'ler için tüm prosedür 4 saat içinde tamamlandı. Protokolün takip edilmesi, iyi tanımlanmış kenarlara ve yüksek tekdüzeliğe sahip desenlerle sonuçlandı. Canlılığı belirlemek için, hücreler 12 saat boyunca Gd-DTPA ile muamele edildi, bu da 2. adımda 3-6 saatten çok daha uzundur. Bununla birlikte, hem Canlı / Ölü boyama hem de CCK8 testi8 , hücre canlılığında önemli bir azalma göstermedi. Nispeten yüksek bir Gd-DTPA konsantrasyonu (50 mM) istatistiksel bir farka neden oldu, ancak yine de% 90.76 ±% 1.78'lik bir yaşam oranını korudu (Ek Şekil 1).
Tek tip hücre modelleme protokolü üzerine inşa edilerek, potansiyel birlikte kültürleme uygulamaları için çok tipli hücre modelleme örnekleri sağlanmıştır. Bu senaryoda, HUVEC'ler, A2780 yumurtalık kanseri hücreleri ve düz kas hücreleri (SMC'ler) kullanıldı. Aralarında ayrım yapmak için, hücreler desenlenmeden önce GFP, DiD ve DiI ile etiketlendi. Adım 3'ü izleyerek, yan yana şeritlerden oluşan üçlü bir hücre modeli oluşturuldu (Şekil 3A). Tersine, Gd-DTPA konsantrasyonunu ayarlayarak eşmerkezli nokta dizileri oluşturmak için 4. adım kullanıldı (Şekil 3B). İlk hücre tabakası DiI (kırmızı) ile boyandı ve 50 mM Gd-DTPA ile desenlendi, ikinci hücre tabakası GFP (yeşil) ile etiketlendi ve 25 mM Gd-DTPA ile desenlendi. Sonuç olarak, ilk katmanın nokta boyutu daha küçüktü ve ikinci nokta desenli hücre katmanı ile eşmerkezli olarak çevrelendi. Farklı hücre tipleri, HUVEC'lerin hızlı bir şekilde bağlanması ve yayılması, A2780'lerin hızlı bir şekilde bağlanması ancak daha yavaş yayılması ve SMC'lerin nispeten yavaş bağlanması ve yayılması ile değişen bağlanma ve yayılma oranları sergiledi. Bu sonuçlar, çeşitli hücre tiplerinin 3 saat içinde hücre kalıpları oluşturabileceğini ve ko-kültür deneylerinde kullanılabileceğini göstermiştir.
Ayrıca, manyetik alan kullanarak hücre modellemesinin, mikroakışkan çipler gibi kapalı dar kültür cihazlarıyla uyumlu olduğu gösterilmiştir. Adım 5'i izleyerek, mikroakışkan çipler üretildi ve içlerinde nokta dizileri oluşturuldu (Şekil 4).
Şekil 1: Mag-arch tabanlı hücre deseninin kurulumu ve şematik diyagramı . (A) Şerit hücre desenleri oluşturmak için mıknatıs setlerinin montajı. (B) Nokta dizisi hücre desenleri oluşturmak için mıknatıs setlerinin montajı. (C) Hücre kültürü cihazının kurulumu. (D) Hücre modellemesi için adım adım prosedür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Cihazların montajı ve HUVEC'lerin şerit ve nokta dizisi desenlerine modellenmesi . (A) Hücre kültürü cihazları (i) içine hapsedilmiş ve bir hücre kültürü plakasına (ii) yerleştirilmiş mıknatıs setleri. (B) ve (C) Mıknatıs setleri ve bunlara karşılık gelen hücre desenleri. Hücreler, hücre modelinin görselleştirilmesi için yeşil floresan proteini (GFP) ile etiketlendi. Ölçek çubukları = 1,5 mm; iç kısımlar = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Adım adım strateji ile ortak kültür sistemlerinin modellenmesi. (A) Mıknatıs yanlamasına kullanarak ortak kültür modellemesi (i-iii). Hücreler, farklı hücre tiplerini ayırt etmek için GFP (yeşil), DiD (mavi) ve DiI (kırmızı) ile etiketlendi. Ölçek çubukları = 1 mm. (B) GD-DTPA konsantrasyonunun ayarlanmasıyla elde edilen ko-kültür deseni; (i) 50 mM, (ii) 20 mM. Ölçek çubukları = 1,5 mm; iç kısımlar = 250 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mikroakışkan bir odada hücre deseni. (A) Mikroakışkan kalıbın şematik diyagramı. (B) Polidimetilsiloksan (PDMS) (i,ii) kullanılarak mikroakışkanların imalatı. (C) Mikroakışkan cihaz içindeki hücre deseni (i,ii) ve nokta dizisi hücre desenlerini (iii) gösteren temsili bir sonuç. Hücreler yeşil floresan proteini (GFP) ile etiketlendi. Ölçek çubuğu = 3 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Gd-DTPA'nın hücre canlılığı üzerindeki etkisi. HUVEC'ler 12 saat boyunca değişen konsantrasyonlarda Gd-DTPA ile muamele edildi ve daha sonra Canlı / Ölü boyama veya CCK-8 testine tabi tutuldu. (A) HUVEC'lerin Canlı/Ölü boyamaları. Ölçek çubukları = 200 μm. (B) Canlı/Ölü boyama sonuçlarını gösteren histogram. (C) CCK-8 tahlil sonuçlarını gösteren histogram. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mag-Arch tabanlı hücre modellemesi, çoğu biyomedikal laboratuvar için kullanıcı dostu bir çözüm sunar. Bu yöntem, mürekkepsiz, etiketsiz, alt tabakadan bağımsız karakterlere ve yüksek verimli desenleme yeteneğine paralel olarak ilerler 8,13. Tek tip hücre deseni için, hücreleri tek adımlı bir şekilde desenlendirir. Prosedür sadece kültür ortamlarının yenilenmesiyle sona erer.
Önceki çalışmalar, hücreleri etiketlemek ve hassas desenler oluşturmak için onları mıknatıslarla çekmek için manyetik parçacıklar kullanmıştır14,15. Bununla birlikte, hücreler üzerinde manyetik parçacıkların varlığı, hücre davranışları üzerindeki potansiyel etkiler hakkında endişeleri artırdı. Mag-Arch tabanlı hücre deseni, hücrelerden ziyade hücre dışı sıvıları paramanyetik hale getirerek tam tersi bir strateji izler. Bu strateji, kültür ortamını yenileyerek ekstra paramanyetik reaktiflerin çıkarılmasını çok daha kolay hale getirir. Çalışmalar, Mag-Arch tabanlı hücre deseni11,16 ile hücresel küreler ve nokta dizileri oluşturmuştur. Mevcut Mag-Arch tabanlı çalışmalarla karşılaştırıldığında, bu protokol tarafından sunulan yöntemler, desenlerin şeklini serbestçe özelleştirebilir. Ayrıca protokol, ortak kültür sistemlerinin üretilmesi için stratejiler sunmaktadır. Mikroakışkanlarda test ettiğimiz gibi, kapalı dar hücre kültürü odaları içinde çalıştığı da kanıtlanmıştır.
Profesyonel biyo-baskı ekipmanı17, özelleştirilmiş şablonlar18 veya karmaşık19'un yüzey modifikasyonu gerektiren paralel yöntemlerden ziyade, Mag-Arch tabanlı yöntem yalnızca iki gereklilik gerektirir: mıknatıslar ve GBCA'lar. Mıknatıs deseninin yüzeyi, hücre desenini tersten belirler. Temel olarak çeşitli şerit desenleri ve nokta dizileri gösterildi. Kullanıcılar, piyasada bol miktarda bulunan farklı mıknatıs setleri ile özgürce desenler oluşturabilirler. İdeal bir sonuç elde etmek için, yeterli manyetik kuvvet sağlayan mıknatısların kullanılması önerilir. Uygulamamızda, kutuplarda kalıcılığı 1430 mT'nin üzerinde ve yüzey manyetizması 100 mT'nin üzerinde olan N52 neodimyum-demir-bor mıknatısları kullandık. GBCA'lar için Gd-DTPA, fizyolojik koşullarda stabil olduğu ve çoğu ülke ve bölgede ucuza temin edilebildiği için benimsenmiştir. Diğer GBCA'lar alternatif olarak kabul edilebilir. Gadobutrol ve gadoteridol gibi makrosiklik iyonik olmayan GBCA'lar, uzun süreli tedavi için savunmasız hücreleri şekillendirirken daha düşük sitotoksisite için daha iyi bir seçim olabilir11,12.
Mag-Arch tabanlı hücre modellemesinin sınırlaması, esas olarak mıknatıslar tarafından üretilen manyetik alanın çalışma alanında yatmaktadır. Ters kare formülünü takiben, manyetik alan8 mesafesi ile keskin bir şekilde azalır. Sonuç olarak, Mag-Arch yöntemi, tabanları 1 mm'den daha kalın olan genel polistiren hücre kültürü kapları veya plakaları üzerinde ideal hücre modellerini bir araya getiremez. Bu nedenle, protokolün cam slaytlar veya konfokal hücre kültürü kapları gibi daha ince hücre kültürü yüzeyleri üzerinde çalışması gerekir. Mikroakışkanların içinde desen oluştururken, mikroakışkanların alt slaytlarının 0,5 mm'den daha ince olması da gerekir. Ko-kültür sistemleri kurmak için, yöntem zaman alıcı olabilir, her ek hücre tipi için hücre bağlanması için süreyi 3-6 saat artırır.
Genel olarak, bu protokol, çoğu laboratuvarda herhangi bir özel ekipman olmadan çoğaltılabilen hücre modellemesi için basitleştirilmiş bir yol sağlar. Kullanıcılar, hücre davranışlarını incelemek, çok hücreli mikro ortamları taklit etmek veya biyomalzemelerin hücre afinitesini test etmek için güçlü bir araç olarak benimseyebilir8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2021YFA1101100), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32000971), Merkezi Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (No. 2021FZZX001-42) ve Zhejiang Üniversitesi Şanghay İleri Araştırma Enstitüsü Yıldızlı Gece Bilim Fonu (Hibe No. SN-ZJU-SIAS-004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2780 ovarian cancer cells | Procell | CL-0013 | |
| Cell culture medium (DMEM, high glucose) | Gibco | 11995040 | |
| Cover slides | Citotest Scientific | 80340-3610 | For fabricating microfluidics. Dimension: 24 mm × 50 mm |
| DiD | MedChemExpress (MCE) | HY-D1028 | For labeling cells with red fluorescence (Ex: 640 nm) |
| DiI | MedChemExpress (MCE) | HY-D0083 | For labeling cells with orange fluorescence (Ex: 550 nm) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochannel | BC-SE-FBS07 | |
| Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA) | Beijing Beilu Pharmaceutical | H10860002 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | V900863 | |
| Glass cell slides | Citotest Scientific | 80346-2510 | Diameter: 25 mm; thickness: 0.19-0.22 mm |
| Glass plates | PURESHI hardware store | For fabricating microfluidics. Dimension: 40 mm × 75 mm | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Servicebio | STCC12103G-1 | |
| Neodymium-iron-boron magnets (N52) | Lalaci | ||
| Non-toxic glass plate coating (Gel Slick Solution) | Lonza | 1049286 | For convenience of demolding when fabricating microfluidics |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Servicebio | G4200 | |
| Plasma cleaner | SANHOPTT | PT-2S | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | DOWSIL | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | For fabricating microfluidics |
| Polytetrafluoroethylene (PFTE) mold | PURESHI hardware store | Customized online, for fabricating microfluidics | |
| Silicon plate | PURESHI hardware store | ||
| Smooth Muscle Cells (SMC) | Procell | CL-0517 | |
| Ultrasonic cleaner | Sapeen | CSA-02 |
References
- Christian, J., et al. Control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy. J Vis Exp. 179, e63121 (2022).
- Abbas, Y., Turco, M. Y., Burton, G. J., Moffett, A. Investigation of human trophoblast invasion in vitro. Hum Reprod Update. 26 (4), 501-513 (2020).
- Park, M., et al. Modulation of heterotypic and homotypic cell-cell interactions via zwitterionic lipid masks. Adv Healthc Mater. 6 (15), 1700063 (2017).
- Ren, T., Chen, P., Gu, L., Ogut, M. G., Demirci, U. Soft ring-shaped cellu-robots with simultaneous locomotion in batches. Adv Mater. 32 (8), e1905713 (2020).
- Ren, T., Steiger, W., Chen, P., Ovsianikov, A., Demirci, U. Enhancing cell packing in buckyballs by acoustofluidic activation. Biofabrication. 12 (2), 025033 (2020).
- Ge, S., et al. Magnetic levitation in chemistry, materials science, and biochemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 59 (41), 17810-17855 (2020).
- Puluca, N., et al. Levitating cells to sort the fit and the fat. Adv Biosyst. 4 (6), e1900300 (2020).
- Ren, T., et al. Programing cell assembly via ink-free, label-free magneto-archimedes based strategy. ACS Nano. 17 (13), 12072-12086 (2023).
- Li, Y. C., et al. Programmable laser-assisted surface microfabrication on a poly(vinyl alcohol)-coated glass chip with self-changing cell adhesivity for heterotypic cell patterning. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (40), 22322-22332 (2015).
- Chliara, M. A., Elezoglou, S., Zergioti, I. Bioprinting on organ-on-chip: Development and applications. Biosensors (Basel). 12 (12), 1135 (2022).
- Moncal, K. K., Yaman, S., Durmus, N. G. Levitational 3D bioassembly and density-based spatial coding of levitoids. Adv Funct Mater. 32 (50), 2204092 (2022).
- Parfenov, V. A., et al. Magnetic levitational bioassembly of 3D tissue construct in space. Sci Adv. 6 (29), eaba4174 (2020).
- Dell, A. C., Wagner, G., Own, J., Geibel, J. P. 3D bioprinting using hydrogels: Cell inks and tissue engineering applications. Pharmaceutics. 14 (12), 2596 (2022).
- Ino, K., Ito, A., Honda, H. Cell patterning using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1309-1317 (2007).
- Okochi, M., Matsumura, T., Honda, H. Magnetic force-based cell patterning for evaluation of the effect of stromal fibroblasts on invasive capacity in 3d cultures. Biosens Bioelectron. 42, 300-307 (2013).
- Mishriki, S., et al. Rapid magnetic 3D printing of cellular structures with mcf-7 cell inks. Research (Wash D C). 2019, 9854593 (2019).
- Ozturk-Oncel, M. O., Leal-Martinez, B. H., Monteiro, R. F., Gomes, M. E., Domingues, R. M. A. A dive into the bath: Embedded 3D bioprinting of freeform in vitro models. Biomater Sci. 11, 5462-5473 (2023).
- Sahni, G., Yuan, J., Toh, Y. C. Stencil micropatterning of human pluripotent stem cells for probing spatial organization of differentiation fates. J Vis Exp. 112, e54097 (2016).
- Joddar, B., et al. Engineering approaches for cardiac organoid formation and their characterization. Transl Res. 250, 46-67 (2022).
