Summary
Her præsenteres en detaljeret protokol til isolering og karakterisering af knoglemarvsmikromiljøpopulationer fra murine modeller af myelodysplastiske syndromer og akut myeloid leukæmi. Denne teknik identificerer ændringer i den ikke-hæmatopoietiske knoglemarvsniche, herunder endotel- og mesenkymale stromale celler, med sygdomsprogression.
Abstract
Knoglemarvsmikromiljøet består af forskellige cellepopulationer, såsom mesenkymale stromale celler, endotelceller, osteolineageceller og fibroblaster, som yder støtte til hæmatopoietiske stamceller (HSC'er). Ud over at understøtte normale HSC'er spiller knoglemarvsmikromiljøet også en rolle i udviklingen af hæmatopoietiske stamcelleforstyrrelser, såsom myelodysplastiske syndromer (MDS) og akut myeloid leukæmi (AML). MDS-associerede mutationer i HSC'er fører til en blokering i differentiering og progressiv knoglemarvssvigt, især hos ældre. MDS kan ofte udvikle sig til behandlingsresistent AML, en sygdom karakteriseret ved en hurtig ophobning af umodne myeloide blaster. Knoglemarvsmikromiljøet vides at være ændret hos patienter med disse myeloide neoplasmer. Her beskrives en omfattende protokol til isolering og fænotypisk karakterisering af knoglemarvsmikromiljøceller fra murinmodeller af myelodysplastisk syndrom og akut myeloid leukæmi. Isolering og karakterisering af ændringer i knoglemarvsnichepopulationerne kan hjælpe med at bestemme deres rolle i sygdomsinitiering og progression og kan føre til udvikling af nye lægemidler rettet mod kræftfremmende ændringer i knoglemarvstromale populationer.
Introduction
Knoglemarvsmikromiljøet består af hæmatopoietiske celler, ikke-hæmatopoietiske stromale celler og den ekstracellulære matrix 1,2. Dette mikromiljø kan fremme hæmatopoietisk stamcelle selvfornyelse, regulere afstamningsdifferentiering og give strukturel og mekanisk støtte til knoglevævet 1,2,3,4,5. Den stromale niche omfatter osteolineageceller, fibroblaster, nerveceller og endotelceller6, mens den hæmatopoietiske niche består af lymfoide og myeloide populationer 1,2,3. Ud over at understøtte normale HSC'er kan knoglemarvsmikromiljøet også spille en rolle i udviklingen af hæmatopoietiske stamcelleforstyrrelser såsom MDS og AML 7,8,9,10,11. Mutationer i osteolineageceller har vist sig at fremme udviklingen af MDS, AML og andre myeloproliferative neoplasmer 10,12,13,14.
Myelodysplastiske syndromer er en gruppe af præ-leukæmiske lidelser, der opstår som følge af mutationer i hæmatopoietiske stamceller. MDS er ofte forbundet med en blok i HSC-differentiering og produktion af dysplastiske celler, hvilket ofte kan føre til knoglemarvssvigt. MDS er den mest almindeligt diagnosticerede myeloide neoplasma i USA og er forbundet med en 3-årig overlevelsesrate på 35% -45%15. MDS er ofte forbundet med en høj risiko for transformation til akut myeloid leukæmi. Dette kan være en fatal komplikation, da MDS-afledt AML er resistent over for de fleste behandlinger og sandsynligvis vil komme tilbage. AML, der opstår de novo på grund af translokationer eller mutationer i hæmatopoietisk stamme og forfædre, er også ofte resistent over for standard kemoterapi16,17. Da MDS og AML primært er sygdomme hos ældre, hvor størstedelen diagnosticeres over 60 år, er de fleste patienter ikke berettiget til helbredende knoglemarvstransplantationer. Der er således et betydeligt behov for at identificere nye regulatorer for sygdomsprogression. Da knoglemarvsmikromiljøet kan yde støtte til maligne celler14, kan definition af ændringer i knoglemarvsnichen med sygdomsprogression føre til identifikation af nye terapier med det formål at hæmme tumornicheremodellering. Der er derfor et betydeligt behov for at identificere nye regulatorer for sygdomsprogression. Til dette formål er det afgørende at identificere og karakterisere ændringer i knoglemarvens stromale cellepopulationer, der kan yde støtte til de ondartede celler.
Der er genereret flere murine modeller af AML og MDS, som kan bruges til at studere ændringer i knoglemarvsmikromiljøet under sygdomsinitiering og progression 6,1,19,20,21,22. Her beskrives protokoller til identifikation af ændringer i knoglemarvsstromale cellepopulationer ved hjælp af murine modeller af retroviralt induceret AML 6,20 samt den kommercielt tilgængelige Nup98-HoxD13 (NHD13) model af højrisiko-MDS til AML-transformation19. Mus, transplanteret med de novo AML-celler, bukker under for sygdommen på 20-30 dage6. NHD13-musene udvikler cytopenier og knoglemarvsdysplasi omkring 15-20 uger, som til sidst omdannes til AML, og næsten 75% af musene bukker under for sygdommen omkring 32 uger. For at analysere murine model knoglemarv mikromiljø populationer, knogler høstes, knoglemarv og knogle spicules fordøjes ved hjælp af enzymatisk fordøjelse, og cellerne er derefter beriget for CD45-/Ter119- ikke-hæmatopoietiske populationer ved magnetisk sortering. Mens lignende analyser tidligere er beskrevet 11,13,22,23,24,25, fokuserer de ofte på enten knoglemarven eller knoglen og inkorporerer ikke celler fra begge kilder i deres analyser. Den kombinerede karakterisering af disse populationer sammen med genekspressionsanalyser kan give en omfattende forståelse af, hvordan det cellulære hæmatopoietiske mikromiljø giver støtte til sygdomsinitiering og progression (figur 1). Mens protokollen beskrevet nedenfor fokuserer på retroviralt induceret AML-model og en genetisk MDS-model, kan disse strategier let tilpasses til at studere ændringer i knoglemarvsnichen i enhver murinmodel af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af University of Rochester University Committee on Animal Resources. Mus blev opdrættet og vedligeholdt i dyreplejefaciliteterne ved University of Rochester. For at modellere højrisiko-MDS anvendes den kommercielt tilgængelige NHD13-murin model19. I denne model analyseres knoglemarvstromale celler i kvindelige NHD13-mus ved 8 ugers alder, før sygdomsdebut. De novo AML genereres som tidligere beskrevet 6,11,20. De onkogener, der anvendes til at inducere AML, såsom MLL-AF9 og NRas, er mærket med GFP eller YFP, hvilket muliggør analyse af de ikke-leukæmiske GFP-knoglemarvspopulationer ved hjælp af flowcytometri. Kort fortalt transplanteres 10 uger gamle C57BL/6J-hunmus med murin GFP/YFP+ AML-celler, og knoglemarven høstes 2 uger efter transplantationen. Mens hunmus anvendes i denne undersøgelse til demonstrationsformål, kan denne protokol udføres med enten han- eller hunmus. Det kan også udføres ved hjælp af enten en lårben eller alle lange knogler.
1. Høst af knoglemarv
BEMÆRK: For nærmere oplysninger om dyredissektionsprotokollen henvises til ændringsforslag et al.26.
- Rens mørtel og støderi med 70% ethanol, skyl dem med kølet FACS-buffer (tabel 1), og læg dem på is for at afkøle, inden høsten påbegyndes. Placer også MACs buffer (tabel 1) på bænken, så den kan nå stuetemperatur.
- Aflive dyret efter den institutionelle dyrepleje og brug retningslinjer og protokoller.
- På bordpladen sprøjtes musen grundigt med 70% ethanol, indtil pelsen er våd. Brug tang og buet saks til at løfte huden på maven og lav to snit ca. 0,5 mm i længden på begge sider af musen, lateralt fra maven. Lav derefter et 0,5 mm snit distalt fra maven. Træk ned for at fjerne hud og pels fra musens ben.
- Placer saks vinkelret på bækkenet, tryk ned, mens du trækker op på lårbenet med tang. Lårbenshovedet skal løsne sig fra bækkenet. Adskil lårbenet og skinnebenet ved patellofemoralleddet. Placer knoglerne i FACS-buffer i en 6-brønds plade på is.
- Fjern væv fra knoglerne ved hjælp af laboratoriekvalitet væv og læg de rensede knogler i en ny 6-brønds plade med frisk FACS-buffer på is.
- Placer alle knogler i mørtlen med 2-5 ml FACS-buffer, så alle knogler nedsænkes i bufferen (juster buffervolumenet baseret på hvor mange knogler du behandler). Knus og slib knoglerne ved hjælp af støderen i en cirkulær bevægelse, indtil knoglemarvsvævet frigives.
- Brug en 3 ml sprøjte til at homogenisere knoglemarven ved at trække væsken op og skylle ned fra mørtel.
- Brug en 3 ml sprøjte til at trække væsken op fra mørtlen og filtrere den gennem en 70 μm cellesi ind i et 50 ml rør på is. Skyl knogle-/vævsstykkerne fra filteret tilbage i mørtlen med FACS-buffer, og vend tilbage til trin 1.7 for at homogenisere og sile en anden gang. Dette udgør knoglemarvsfraktionen.
- Skyl de resterende knoglestykker (spicules) tilbage i mørtlen med FACS-buffer og skyl dem i et 15 ml rør ved hjælp af FACS-buffer for at sikre maksimalt celleudbytte. Dette er knogle spicules fraktion.
2. Fordøjelse af knoglemarv
- Knoglemarven centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten dekanteres og kasseres.
- Resuspender knoglemarven i 2 ml af knoglemarvsfordøjelsesblandingen (tabel 1) og overfør den til et 15 ml rør. Der inkuberes ved 37 °C i 45 minutter på en rotator.
- Tilsæt 10 ml FACS-buffer for at stoppe den enzymatiske fordøjelse. Filtrer blandingen gennem en 70 μm cellesi til et nyt 50 ml rør.
- Pellet blandingen ved 400 x g i 7 minutter ved 4 °C.
- Resuspender knoglemarvpellet i 1 ml RBC-lysebuffer (se materialetabel). Inkuber i 4 min på is.
- Tilsæt 10 ml FACS-buffer for at stoppe lysis. Filtrer blandingen gennem en 70 μm cellesi til et nyt 50 ml rør.
- Pellet blandingen ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes og pellets resuspenderes i 100 μl FACS-buffer.
3. Fordøjelse af knogle spicules
- Vortex knoglespicules fra trin 1.9 og lad dem bosætte sig. Supernatanten dekanteres, og benet fastholdes forneden.
- Resuspender knoglesplinter i 1 ml af knoglesplekspiulefordøjelsesblandingen (tabel 1).
- Anbring rørene på en rørrotator i 60 minutter ved 37 °C.
- Tilsæt 10 ml FACS-buffer for at stoppe den enzymatiske fordøjelse. Blandingen filtreres gennem en 70 μm cellesi ind i 50 ml røret indeholdende RBC-lyseret og fordøjet knoglemarv.
4. Farvning
- Bland forsigtigt knoglespicules og knoglemarvscellesuspension.
- Brug 10 μL af cellesuspensionen til at tælle det levende cellenummer på et hæmocytometer ved hjælp af 0,4% Trypan blåbaseret farvning, som beskrevet i offentliggjorte protokoller27. Saml 50.000 celler til en ufarvet kontrol fra cellesuspensionen.
- De resterende celler centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes og resuspenderes i 100 μl FACS-buffer.
BEMÆRK: Antistoffer kan titreres for at bestemme den ideelle fortynding. Antistofvalg (epitoper og fluorkromer) kan tilpasses. - Til farvning med antistoffer mod magnetisk udtømning tilsættes FC-blok (1 μL pr. 25 x 106 celler), CD45-APC (10 μL pr. 25 x 106 celler) og Ter119-APC (4 μL pr. 25 x 106 celler) (se materialetabel).
- Inkuber på is i 20 min. Der vaskes med FACS-buffer, fjernes 50.000 celler (~50 μL) til APC-farvet kontrol, centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C, og opslæmmes igen i 100 μL FACS-buffer.
- Til farvning af cellesuspensionen med mikroperler til magnetisk udtømning tilsættes mIgG (8 μL pr. 25 x 106 celler) og Anti-APC-mikroperler (20 μL pr. 25 x 106 celler) (se materialetabel).
- Inkuber på is i 20 min. Der vaskes med 10 ml FACS-buffer, centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
5. Nedbrydning af prøven ved magnetisk sortering
BEMÆRK: Dette trin udføres ved hjælp af en kommercielt tilgængelig manuel magnetisk separator i henhold til producentens anvisninger. Dette trin kan også udføres med en automatiseret separator (se materialetabel).
- Forbered LD-kolonnen ved at vaske den med 2 ml MAC-buffer (tabel 1). Kassér spildevandet, og skift opsamlingsrøret.
- Resuspender op til 1 x 108 celler i MACs buffer og filtrer dem gennem et 5 ml reagensglas med en 35 μm celle sihætte.
- Placer LD-søjlen på magnetseparatorstativet. Anbring et 5 ml reagensglas under søjlen for at opsamle eluatet.
- Tilsæt cellesuspensionen til den forberedte LD-kolonne. Lad den negative fraktion strømme igennem i opsamlingsrøret. Kolonnen vaskes to gange med 1 ml MAC-buffer, og eluatet opsamles i samme reagensglas. Dette er den negative fraktion, der anvendes i trin 5.6 nedenfor.
- Fjern LD-søjlen fra det magnetiske separatorstativ, og placer den på et nyt 5 ml reagensglas. Brug en pipette til at dispensere 3 ml buffer i kolonnen for at skylle celler, der er blevet positivt mærket, ud ved hjælp af søjlestemplet.
- De negative og positive fraktioner centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. De resuspenderes i 100 μL FACS-buffer.
- Tæl 10 μL af de negative og positive fraktioner med 0,4% trypanblåt. Volumenerne for osteoanalyse / endotelpanelfarvning nedenfor vil være baseret på dette celletal.
- Brug 50.000 levende celler fra den positive fraktion til flowcytometri-gatingkontroller.
6. Osteo-analyse / endotelpanel plet
BEMÆRK: Kompensation skal udføres i henhold til standard flowcytometriprotokoller, herunder alle passende farvnings- og gatingkontroller.
- Til farvning af den CD45/Ter119 negative fraktion (1 μL af hvert antistof pr. 1 x 106 celler) tilsættes CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE og CD140a-PE-Cy5 (se materialetabel).
- Inkuber på is i 20 min. Der vaskes med 2 ml FACS-buffer, og centrifugeres derefter ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Der tilsættes 1 ml FACS-buffer og en 1:1000 fortynding af PI til levende/død farvning, og prøven filtreres derefter gennem et 5 ml reagensglas med et 35 μm cellesidæksel.
- Analyser cellerne på et flerfarvet flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne artikel beskriver en flowcytometribaseret metode til analyse af knoglemarvsmikromiljøpopulationer, såsom endotel- og mesenkymale stromale celler, fra MDS- og leukæmimurine modeller (figur 1). Figur 2 viser gating-strategien til påvisning af populationer af interesse, begyndende med udvælgelsen af celler (P1) i den fordøjede og CD45/Ter119-udtømte fraktion gennem fremad- og sidespredningsprofil. Eksempel gating af celler i en leukæmiprøve er vist i P1 (figur 2A). Singlets er udvalgt, og dubletter er udelukket fra denne analyse, P2 (figur 2B). Figur 2C viser porte til udvælgelse af propidiumjodnegative levende celler, P3. For at fokusere på ikke-hæmatopoietiske stromale populationer, celler, der er CD45-/Ter119-, P4 (APC, Y-akse) vs. SSC-A vælges (figur 2D). Denne indledende gating-strategi er fælles for alle prøver, der skal analyseres.
Leukæmi murine modellen bruges til at illustrere gating for endotelceller i figur 2E-G. Figur 2E viser CD31-positiv (Pe-Cy7, Y-akse) vs. SSC-A-celler i en ikke-kræftkontrolmus samt en leukæmisk mus, gated gennem P4. Celler positivt mærket med CD31 er endotelceller, P5. I figur 2F, gated gennem P5, identificeres arteriolære endotelceller som CD45-Ter119-CD31 + Sca1 +, P6, og sinusformede endotelceller identificeres som CD45-Ter119-CD31 + Sca1-, P7 (BV421, Y-akse) vs. SSC-A.
Selvom denne analyse fokuserer på ikke-leukæmiske knoglemarvsmikromiljøceller, er det også nyttigt at bestemme tumorbyrden. Dette kan gøres med en lille brøkdel af ufordøjet/ikke-udtømt prøve inden forsøget påbegyndes. I denne eksperimentelle kontrol (stiplede linjer) figur 2G, P8 repræsenterer tumorbyrden i prøven og P9 repræsenterer de ikke-kræftceller.
MDS murine modellen bruges til at illustrere analyse af mesenkymale stromale celler i figur 2H-J. Figur 2H viser CD31-negativ (Pe-Cy7, Y-akse) vs. SSC-A-celler, lukket gennem P4. Mesenkymale stromale cellepopulationer i en vildtypekontrolmus og MDS-mus er vist i figur 2I. Gated gennem P10, mesenkymale stromale celler identificeres som CD45-Ter119-CD31-CD51 + CD140a +, P113 (Pe, Y-akse; Pe-Cy5, X-aksen). Den eksperimentelle kontrol (stiplede linjer), figur 2J viser eksempler på ensfarvede gating-kontroller, CD51-enkeltpletter og CD140a-enkeltpletter, der bruges til at gates for MSC'erne vist i de eksperimentelle prøver i figur 2I.
Disse data indikerer, at arteriolære endotelceller ekspanderer signifikant i AML-mikromiljøet med et samtidigt tab i de sinusformede endotelpopulationer (figur 2F), i overensstemmelse med tidligere undersøgelser med patientafledte xenotransplantater i immundefekte mus28. Det er sandsynligt, at den lille ekspansion i de mesenkymale stromale celler, der ses i NHD13-musene ved 8 ugers alderen (figur 2I), kan stige efter 16-20 uger, når disse mus begynder at vise karakteristika for MDS25. Selvom kun leukæmimodellen bruges til at illustrere endotelcellepopulationen, og MDS-murinmodellen bruges til at illustrere mesenkymale stromale cellepopulationer, kan lignende farvnings- og gatingstrategier bruges til at analysere de forskellige mikromiljøpopulationer i en af disse modeller eller faktisk i enhver genetisk manipuleret murinmodel af interesse.
Figur 1: Isolering af knoglemarvsstromale celler. Skematisk viser processen med at isolere ikke-hæmatopoietiske knoglemarvstromale celler fra kontrol- og leukæmiske mus. Kort fortalt fordøjes knoglespicules og knoglemarv separat og samles derefter. CD45-Ter119-populationen er beriget ved magnetisk sortering og farvet med antistofpaneler mod populationer af interesse, såsom mesenkymale stromale celler og endotelceller. Cellerne analyseres derefter ved flowcytometri. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Gating strategi for ikke-hæmatopoietisk knoglemarv og stromale celler. (A-D) Flowcytometri-gating-strategi, der anvendes til at vælge fordøjede, CD45-/Ter119-, ikke-hæmatopoietiske populationer (P4) i både leukæmi- og MDS-murinmodellen. (E) Leukæmi knoglemarvsendotelceller (P5, CD31+) kan opdeles som (F) Sca1+ arteriolære (P6) eller Sca1- sinusformede endotelceller (P7). (G) Leukæmi engraftment i en AML-prøve, hvor P8 repræsenterer engraftment, mens P9 repræsenterer ikke-kræftceller. Stiplede linjer angiver, at dette plot er en eksperimentel kontrol. (H) Gated gennem P4, MDS knoglemarv CD31- celler, P10 (I) Mesenkymale stromale celler (CD51+/CD140a+, P11). (J) Eksempel på enkeltfarvede gating-kontroller, CD51 (venstre) og CD140a (højre), der bruges til at bestemme portene til mesenkymale stromale celler i (I). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Opløsning | Reagens | Koncentration | Beløb, der skal tilføjes |
| FACS-buffer | HBSS | 10x | 100 ml |
| EDTA | 0,5 m | 4 ml | |
| Føtalt bovin serum | - | 50 ml | |
| Vand | - | 848 ml | |
| Knoglemarv fordøjelse blanding | HBSS | 1x | 2 ml |
| DNase 1 | 1 μg/ml i 1x DPBS | 20 μL | |
| Dispase II pulver | - | 4 mg | |
| Collagenase Type IV | - | 2 mg | |
| Bone spicule fordøjelsesblanding | DPBS | 1x | 320 ml |
| Collagenase Type 1 | - | 1 g | |
| Føtalt bovin serum | - | 80 ml | |
| MAC-buffer | BSA | 66 g/mol | 5 g |
| DPBS | 10x | 100 ml | |
| EDTA | 0,5 m | 4 ml | |
| Vand | - | 896 L |
Tabel 1: Sammensætning af opløsninger og buffere anvendt i nærværende undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Murine leukæmi modeller er blevet flittigt anvendt til at identificere celle iboende og niche-drevne signaler, der fremmer aggressiv myeloid leukæmi progression 6,19,21. Her præsenteres en omfattende flowcytometribaseret protokol til definition af den cellulære sammensætning af knoglemarvsmikromiljøet i murine modeller af MDS og AML.
Før du erhverver flowcytometriske data fra eksperimentelle prøver, er det vigtigt at omhyggeligt kompensere for fluorescensoverlapning. Det er også vigtigt at medtage alle passende farvnings- og gatingkontroller. Disse trin gør det muligt for eksperimentatoren at bekræfte, at positiv eller negativ antistoffarvning repræsenterer nøjagtigt udtryk for cellemarkører af interesse og ikke er en artefakt af fluorescensspektral overlapning eller autofluorescens. Selvom denne protokol beskriver udvalgte celleoverflademarkører, kan antistofpanelerne udvides baseret på eksperimentelt behov. For eksempel kan CD144 (Ve-Cadherin) administreres in vivo før høst af musene og kan tjene som en yderligere specifik markør for endotelceller 5,29. Mens fluoroforerne og antistofkloner, der er angivet her, kan ændres, bør titreringer udføres for at bestemme deres ideelle fortynding. For kategorisk at definere alle cellepopulationer i knoglemarvsnichen kan enkeltcelle RNA-sekventering bruges til at etablere knoglemarvsnichelandskabet under MDS / AML-initiering og progression 23,24,30.
Det er vigtigt at forberede prøven omhyggeligt i henhold til de trin, der er beskrevet i denne protokol. Ved homogenisering af knoglerne er det afgørende, at mørtel og støder, og alle trin udføres på is for at forhindre celledød og for at sikre høj cellegendannelse. Det er meget vigtigt at fjerne alt væv omkring knoglerne før homogenisering for at forhindre forurening af andre uønskede celletyper. Under RBC-lyse og fordøjelser er det vigtigt at stoppe den enzymatiske reaktion med en passende mængde FACS-buffer og resuspendere grundigt i frisk buffer, ellers vil cellerne fortsætte med at fordøje og til sidst dø.
Adskillelse af knogle- og knoglemarvsfraktionerne er afgørende, da knoglespicules kræver en anden blanding af enzymer til fordøjelsesbuffer og har brug for længere tid til at fordøje. I knoglefordøjelser er collagenase type 1 nyttig til fordøjelse af kollagenasefibriller, som almindeligvis findes i ekstracellulær matrix og kollagenfibre31. Derudover vil nogle knoglemarvsceller placeret tæt på endosteum forblive fastgjort til knoglen efter homogenisering og frigives kun ved enzymatisk fordøjelse. Ved fordøjelse af knoglemarv anvendes kollagenase type IV til at fordøje kældermembranen af epitel- og endotelceller i knoglemarven32, mens dispase hovedsageligt spalter fibronectin31. Knoglemarven kræver mindre tid at fordøje, da sammenhængen mellem celler og matrix er svagere. Inkubation af knoglemarvsfraktionen under lignende forhold kan skade populationerne af interesse. Brug af to forskellige fordøjelsesbuffere øger antallet af stomipopulationer, der kan detekteres, betydeligt, og giver dermed et større datasæt at analysere.
De fleste tilgængelige protokoller til analyse af murine knoglemarvsmikromiljøpopulationer bruger en sprøjte til at skylle knoglemarven fra kun de lange knogler 13,24. Den nuværende metode til knusning af knogler giver mulighed for at erhverve data fra andre knogler såsom bækkenet, reducerer prøveforberedelsestiden betydeligt og mindsker muligheden for skader med skarpe nåle. I betragtning af at knoglen består af modne osteoblaster og andre cellepopulationer, der kan yde støtte til normale og ondartede hæmatopoietiske celler, muliggør denne metode til at inkludere celler fra knoglespicules en mere nøjagtig repræsentation af knoglemarvsmikromiljøet i prøven. Mens en tidligere undersøgelse fordøjede knoglemarv og knoglesplinter separat11, viste den ikke farvning af osteolineage og endotelceller i samme prøve. En anden undersøgelse brugte kommercielt tilgængelige proprietære enzymblandinger til at fordøje knoglemarv og knoglesplinter23 og analyserede dataene ved hjælp af den signifikant dyrere enkeltcelle RNA-sekventeringsteknologi. Denne metode til berigelse for CD45-/Ter119-celler vælger celler af interesse og reducerer signifikant den tid, der er nødvendig for at erhverve data om flowcytometeret. Sammenlignet med andre avancerede metoder såsom enkeltcelle RNA-sekventering er denne flowcytometribaserede metode således mere tilgængelig, omkostningseffektiv og kræver ikke sofistikeret analyse af uddannede bioinformatikere 23,24,30.
Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol kan bruges til at karakterisere knoglemarvsmikromiljøet for ikke kun nogen af de tilgængelige murine modeller af MDS og AML, men enhver genetisk musemodel. Lignende metoder kan også være effektive til at analysere ændringerne i murin knoglemarvsniche af patientafledte xenograft (PDX) modeller. Disse metoder kan være nyttige til undersøgelser, der sigter mod at bestemme de mekanismer, hvormed MDS / AML påvirker deres knoglemarvsniche. I betragtning af de tekniske udfordringer, der er forbundet med at tage prøver af store mængder knoglemarv fra humane patienter, er disse analyser af murinmodeller et effektivt værktøj til at fremme forståelsen af det ondartede knoglemarvsmikromiljø og definere dets rolle i sygdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen angivne interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke URMC Flow Cytometry Core. Dette arbejde blev støttet af American Society of Hematology Scholar Award, Leukemia Research Foundation award og NIH tilskud R01DK133131 og R01CA266617 tildelt JB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors - sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
References
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
- Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).
- Kfoury, Y., Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Bajaj, J., et al. Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).
- Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting. J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).
- Kim, Y. W., et al. Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease. Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).
- Walkley, C. R., et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
- Raaijmakers, M. H., et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
- Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. Stem cells in cancer initiation and progression. J Cell Biol. 219 (1), e201911053 (2020).
- Sekeres, M. A., Taylor, J. Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review. Jama. 328 (9), 872-880 (2022).
- Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W.
- Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).
- Yoshimi, A., et al. Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis. Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).
- Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
- Kwon, H. Y., et al. Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia. Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).
- Bajaj, J., et al. An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia. Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Balderman, S. R., et al. Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome. Blood. 127 (5), 616-625 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. JoVE. 110, e53936 (2016).
- JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , JoVE. (2023).
- Passaro, D., et al. Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response. Blood. 128 (22), 2662 (2016).
- Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nat Commun. 9 (1), 2449 (2018).
- Baccin, C., et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).
- Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).
- Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes. N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).
