Summary
여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 집단을 분리하고 특성화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 질병 진행에 따라 내피 및 중간엽 기질 세포를 포함한 비조혈 골수 틈새의 변화를 식별합니다.
Abstract
골수 미세환경은 조혈모세포(HSC)를 지원하는 중간엽 기질 세포, 내피 세포, 골계통 세포 및 섬유아세포와 같은 별개의 세포 집단으로 구성됩니다. 골수 미세환경은 정상적인 HSC를 지원하는 것 외에도 골수이형성 증후군(MDS) 및 급성 골수성 백혈병(AML)과 같은 조혈모세포 질환의 발병에도 중요한 역할을 합니다. HSC의 MDS 관련 돌연변이는 특히 노인에서 분화 및 진행성 골수 부전의 차단을 유발합니다. MDS는 종종 미성숙 골수성 모세포의 빠른 축적을 특징으로 하는 질병인 치료 저항성 AML로 진행될 수 있습니다. 골수 미세환경은 이러한 골수성 신생물 환자에서 변형되는 것으로 알려져 있습니다. 여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 세포를 분리하고 표현형적으로 특성화하기 위한 포괄적인 프로토콜이 설명됩니다. 골수 틈새 집단의 변화를 분리하고 특성화하면 질병 시작 및 진행에서 이들의 역할을 결정하는 데 도움이 될 수 있으며 골수 기질 집단의 암 촉진 변화를 표적으로 하는 새로운 치료법의 개발로 이어질 수 있습니다.
Introduction
골수 미세환경은 조혈 세포, 비조혈 기질 세포 및 세포외 기질 1,2로 구성됩니다. 이 미세환경은 조혈모세포의 자가재생을 촉진하고, 계통 분화를 조절하며, 뼈 조직 1,2,3,4,5에 구조적 및 기계적 지원을 제공할 수 있습니다. 기질 틈새는 골선세포, 섬유아세포, 신경세포, 내피세포6를 포함하며, 조혈 틈새는 림프구와 골수성 집단으로 구성된다 1,2,3. 골수 미세환경은 정상적인 HSC를 지원하는 것 외에도 MDS 및 AML 7,8,9,10,11과 같은 조혈모세포 질환의 발병에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 골혈통 세포의 돌연변이는 MDS, AML 및 기타 골수증식성 신생물의 발달을 촉진하는 것으로 나타났습니다 10,12,13,14.
골수이형성 증후군은 조혈모세포의 돌연변이로 인해 발생하는 백혈병 전단계 질환군입니다. MDS는 종종 HSC 분화 및 이형성 세포의 생성을 차단하는 것과 관련이 있으며, 이는 종종 골수 부전으로 이어질 수 있습니다. MDS는 미국에서 가장 흔하게 진단되는 골수성 신생물이며 3년 생존율은 35%-45%입니다15. MDS는 종종 급성 골수성 백혈병으로 전이될 위험이 높습니다. MDS에서 파생된 AML은 대부분의 치료에 내성이 있고 재발할 가능성이 높기 때문에 이는 치명적인 합병증이 될 수 있습니다. 조혈 줄기 및 전구 세포의 전위 또는 돌연변이로 인해 발생하는 AML은 종종 표준 화학 요법에 내성이 있습니다16,17. MDS와 AML은 주로 노인의 질병이며 대다수가 60세 이상이기 때문에 대부분의 환자는 근치적 골수 이식을 받을 수 없습니다. 따라서 질병 진행의 새로운 조절자를 규명할 필요가 있습니다. 골수 미세환경은 악성 세포를 지원할 수 있기 때문에14, 질병 진행에 따른 골수 틈새의 변화를 정의하면 종양 틈새 리모델링을 억제하는 것을 목표로 하는 새로운 치료법을 식별할 수 있습니다. 따라서 질병 진행의 새로운 조절자를 규명할 필요가 있습니다. 이를 위해서는 악성 세포를 지원할 수 있는 골수 기질 세포 집단의 변화를 식별하고 특성화하는 것이 중요합니다.
AML 및 MDS의 여러 쥐 모델이 생성되었으며 질병 시작 및 진행 중 골수 미세환경의 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다 6,1,19,20,21,22. 여기서, 후비랄 유도 AML 6,20의 쥐 모델을 사용하여 골수 기질 세포 집단의 변화를 식별하기 위한 프로토콜과 AML 형질전환(19)의 고위험 MDS의 상업적으로 이용 가능한 Nup98-HoxD13(NHD13) 모델이 설명된다. de novo AML 세포를 이식한 마우스는 20-30일 내에 질병에 굴복한다6. NHD13 마우스는 15-20주 경에 혈구감소증과 골수 이형성증이 발생하여 결국 AML로 전환되며 마우스의 거의 75%가 32주경에 질병에 굴복합니다. 쥐 모델 골수 미세환경 집단을 분석하기 위해 뼈를 채취하고, 효소 소화를 사용하여 골수 및 뼈 스피큘을 소화한 다음, 자기 분류를 통해 CD45-/Ter119- 비조혈 집단에 대해 세포를 농축합니다. 유사한 분석이 이전에 기술되었지만11,13,22,23,24,25 골수 또는 뼈에 초점을 맞추고 두 출처의 세포를 분석에 통합하지 않습니다. 유전자 발현 분석과 함께 이러한 집단의 결합된 특성 분석은 세포 조혈 미세환경이 질병 시작 및 진행을 어떻게 지원하는지에 대한 포괄적인 이해를 제공할 수 있습니다(그림 1). 아래에 설명된 프로토콜은 후귀바이러스로 유도된 AML 모델 및 유전적 MDS 모델에 중점을 두고 있지만, 이러한 전략은 관심 있는 쥐 모델의 골수 틈새 시장을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 로체스터 대학교 동물 자원 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 생쥐는 로체스터 대학의 동물 보호 시설에서 사육되고 유지되었습니다. 고위험 MDS를 모델링하기 위해 상업적으로 이용 가능한 NHD13 뮤린 모델19가 사용됩니다. 이 모델에서는 질병 발병 전 생후 8주에 암컷 NHD13 마우스에서 골수 기질 세포를 분석합니다. De novo AML은 앞서 설명한대로 생성됩니다 6,11,20. MLL-AF9 및 NRas와 같이 AML을 유도하는 데 사용되는 종양 유전자는 GFP 또는 YFP로 태그되어 유세포 분석을 사용하여 비백혈병 GFP- 골수 집단을 분석할 수 있습니다. 간단히 말해서, 10주 된 암컷 C57BL/6J 마우스에 쥐 GFP/YFP+ AML 세포를 이식하고, 이식 후 2주 후에 골수를 채취합니다. 이 연구에서는 시연 목적으로 암컷 마우스를 사용하지만, 이 프로토콜은 수컷 또는 암컷 마우스로 수행할 수 있습니다. 또한 하나의 대퇴골 또는 모든 긴 뼈를 사용하여 수행할 수 있습니다.
1. 골수 채취
참고: 동물 해부 프로토콜에 대한 자세한 내용은 Amend et al.26을 참조하십시오.
- 70% 에탄올로 절구와 유봉을 세척하고 식힌 FACS 완충액(표 1)으로 헹구고 얼음 위에 올려 식힌 후 수확을 시작합니다. 또한 MAC 버퍼(표 1)를 벤치에 놓아 실온에 도달할 수 있도록 합니다.
- 기관 동물 관리 및 사용 지침 및 프로토콜에 따라 동물을 안락사시킵니다.
- 벤치 탑에서 털이 젖을 때까지 쥐에게 70% 에탄올을 철저히 뿌립니다. 집게와 구부러진 가위를 사용하여 복부의 피부를 들어 올리고 복부 측면의 마우스 양쪽에 약 0.5mm 길이의 두 개를 절개합니다. 다음으로 복부에서 원위부를 0.5mm 절개합니다. 아래로 당겨 쥐의 다리에서 피부와 털을 제거합니다.
- 골반에 수직으로 가위를 놓고 집게로 대퇴골을 당기면서 아래로 누릅니다. 대퇴골두는 골반에서 분리되어야 합니다. 대퇴골대퇴 관절에서 대퇴골과 경골을 분리합니다. 얼음 위의 6웰 플레이트에 있는 FACS 완충액의 뼈를 놓습니다.
- 실험실 등급 조직을 사용하여 뼈에서 조직을 제거하고 세척된 뼈를 얼음에 신선한 FACS 완충액이 있는 새 6웰 플레이트에 넣습니다.
- 모든 뼈가 완충액에 잠기도록 2-5mL의 FACS 완충액을 사용하여 모든 뼈를 모르타르에 넣습니다(처리 중인 뼈 수에 따라 완충액의 부피 조정). 골수 조직이 풀릴 때까지 유봉을 사용하여 뼈를 부수고 갈아서 원을 그리며 합니다.
- 3mL 주사기를 사용하여 모르타르에서 액체를 위로 끌어 올려 아래로 흘려보내 골수를 균질화합니다.
- 3mL 주사기를 사용하여 모르타르에서 액체를 끌어 올리고 70μm 셀 스트레이너를 통해 얼음 위의 50mL 튜브로 여과합니다. FACS 완충액을 사용하여 필터의 뼈/조직 덩어리를 모르타르로 다시 헹구고 1.7단계로 돌아가 균질화하고 두 번째로 변형합니다. 이것이 골수 분획을 구성합니다.
- 남은 뼈 조각(스피큘)을 FACS 완충액으로 다시 헹구고 FACS 완충액을 사용하여 15mL 튜브로 세척하여 세포 수율을 극대화합니다. 이것은 뼈 스피큘 분율입니다.
2. 골수의 소화
- 골수를 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 디캔팅하고 폐기합니다.
- 골수 분해 혼합물 2mL에 골수를 재현탁하고(표 1) 15mL 튜브로 옮깁니다. 37°C에서 45분 동안 회전근에서 배양합니다.
- 효소 분해를 중지하기 위해 10mL의 FACS 완충액을 추가합니다. 혼합물을 70μm 셀 스트레이너를 통해 새 50mL 튜브로 여과합니다.
- 혼합물을 400 x g 에서 4 °C에서 7 분 동안 펠렛합니다.
- 골수 펠릿을 1mL의 RBC 용해 완충액에 재현탁시킵니다( 재료 표 참조). 얼음 위에서 4분간 배양합니다.
- 용해를 중지하기 위해 10mL의 FACS 완충액을 추가합니다. 혼합물을 70μm 셀 스트레이너를 통해 새 50mL 튜브로 여과합니다.
- 혼합물을 300 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 펠렛합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 100μL의 FACS 완충액에 재현탁시킵니다.
3. 뼈 스피큘의 소화
- 1.9단계에서 뼈 스피큘을 소용돌이치게 하고 가라앉히도록 합니다. 상층액을 디캔팅하고 뼈를 바닥에 유지합니다.
- 뼈 미세관 소화 혼합물 1mL에 뼈 미침을 재현탁시킵니다(표 1).
- 튜브를 37°C에서 60분 동안 튜브 회전기에 놓습니다.
- 효소 분해를 중지하기 위해 10mL의 FACS 완충액을 추가합니다. 70μm 세포 여과기를 통해 혼합물을 여과하여 적혈구 용해 및 소화된 골수가 들어 있는 50mL 튜브에 넣습니다.
4. 염색
- 뼈 스피큘과 골수 세포 현탁액을 부드럽게 섞습니다.
- 공개된 프로토콜27에 설명된 대로 0.4% Trypan blue 기반 염색을 사용하여 혈구분석기에서 10μL의 세포 현탁액을 사용하여 살아있는 세포 수를 계산합니다. 세포 현탁액에서 염색되지 않은 대조군을 위해 50,000개의 세포를 수집합니다.
- 나머지 세포를 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 100μL의 FACS 완충액에 재현탁시킵니다.
참고: 항체는 이상적인 희석을 결정하기 위해 적정할 수 있습니다. 항체 선택(에피토프 및 형광 색소)은 사용자 정의할 수 있습니다. - 자기 공핍 항체로 염색하려면 FC Block(25 x 106 세포당 1μL), CD45-APC(25 x 106 세포당 10μL) 및 Ter119-APC(25 x 106 세포당 4μL)를 추가합니다( 재료 표 참조).
- 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. FACS 완충액으로 세척하고, APC 염색 대조군을 위해 50,000개 세포(~50μL)를 제거하고, 4°C에서 5분 동안 300 x g 으로 원심분리하고, 100μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다.
- 자기 공핍을 위해 마이크로비드로 세포 현탁액을 염색하려면 mIgG(25 x 106 개 세포당 8μL) 및 Anti-APC 마이크로비드(25 x 106 개 세포당 20μL)를 추가합니다( 재료 표 참조).
- 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 10mL FACS 완충액으로 세척하고 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
5. 자석 분류에 의한 시료 고갈
알림: 이 단계는 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 수동 자기 분리기를 사용하여 수행됩니다. 이 단계는 자동 분리기를 사용하여 수행할 수도 있습니다( 재료 표 참조).
- LD 컬럼을 2mL의 MACs 완충액으로 세척하여 준비합니다(표 1). 폐수를 버리고 수집 튜브를 교체하십시오.
- MAC 완충액에 최대 1 x 108 세포를 재현탁시키고 35μm 세포 스트레이너 캡이 있는 5mL 시험관을 통해 여과합니다.
- LD 컬럼을 자기 분리기 스탠드에 놓습니다. 컬럼 아래에 5mL 시험관을 배치하여 용리액을 수집합니다.
- 준비된 LD 컬럼에 셀 현탁액을 추가합니다. 음의 분획이 수집 튜브로 흐르도록 합니다. 1mL의 MAC 완충액으로 컬럼을 두 번 세척하고 동일한 튜브에 용출액을 수집합니다. 이것은 아래 5.6단계에서 사용된 음의 분수입니다.
- 자기 분리기 스탠드에서 LD 컬럼을 제거하고 새 5mL 시험관에 놓습니다. 피펫을 사용하여 3mL의 버퍼를 컬럼에 분주하여 컬럼 플런저를 사용하여 양성 라벨이 부착된 세포를 플러시합니다.
- 음극 및 양극 분획을 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 100μL의 FACS 버퍼에 재현탁합니다.
- 0.4% Trypan blue로 음극 및 양성 분획의 10μL를 계산합니다. 아래의 골분석/내피 패널 염색을 위한 부피는 이 세포 수를 기반으로 합니다.
- 유세포 분석 게이팅 대조군을 위해 양성 분획의 50,000개의 살아있는 세포를 사용합니다.
6. 골분석/내피패널 염색
참고: 보정은 모든 적절한 염색 및 게이팅 제어를 포함한 표준 유세포 분석 프로토콜에 따라 수행해야 합니다.
- CD45/Ter119 음성 분획(1 x 106 세포당 각 항체의 1μL)을 염색하려면 CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE 및 CD140a-PE-Cy5를 추가합니다( 재료 표 참조).
- 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 2mL의 FACS 완충액으로 세척한 다음 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 살아있는/죽은 염색을 위해 1mL의 FACS 완충액과 1:1000 희석액의 PI를 추가한 다음 35μm 셀 스트레이너 캡이 있는 5mL 시험관을 통해 샘플을 여과합니다.
- multi-color 유세포 분석기에서 세포를 분석합니다.
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Representative Results
이 기사에서는 MDS 및 백혈병 쥐 모델에서 내피 및 중간엽 기질 세포와 같은 골수 미세환경 집단을 분석하기 위한 유세포 분석 기반 방법을 설명합니다(그림 1). 그림 2 는 분해된 CD45/Ter119 고갈된 분획에서 세포(P1)를 선택하는 것부터 시작하여 전방 및 측면 산란 프로파일을 통해 관심 집단을 검출하기 위한 게이팅 전략을 보여줍니다. 백혈병 샘플에서 세포의 게이팅(gating)의 예는 P1에 나와 있습니다(그림 2A). 단일항이 선택되고 이중항은 이 분석에서 제외됩니다(그림 2B). 그림 2C 는 프로피듐 요오드 음성 살아있는 세포 P3를 선택하는 게이트를 보여줍니다. 비조혈 기질 집단에 초점을 맞추기 위해 CD45-/Ter119-, P4(APC, Y축) 세포와 SSC-A가 선택됩니다(그림 2D). 이 초기 게이팅 전략은 분석할 모든 샘플에 공통적입니다.
백혈병 쥐 모델은 그림 2E-G에서 내피 세포에 대한 게이팅을 설명하는 데 사용됩니다. 그림 2E는 CD31 양성(Pe-Cy7, Y축)과 비교를 보여줍니다. 비암 대조군 마우스와 백혈병 마우스의 SSC-A 세포는 P4를 통해 게이트됩니다. CD31로 양성으로 표지된 세포는 내피 세포인 P5입니다. 그림 2F에서, P5를 통해 게이트(gateated)된 세동맥 내피 세포는 CD45-Ter119-CD31+Sca1+, P6로 식별되고, 정현파 내피 세포는 CD45-Ter119-CD31+Sca1-, P7(BV421, Y축)로 식별된다. SSC-A입니다.
이 분석은 비백혈병 골수 미세환경 세포에 초점을 맞추고 있지만, 종양 부담을 결정하는 데에도 도움이 됩니다. 이는 실험을 시작하기 전에 분해되지 않은/고갈되지 않은 샘플의 작은 부분으로 수행할 수 있습니다. 이 실험 대조군(점선) 그림 2G에서 P8은 샘플의 종양 부담을 나타내고 P9는 비암성 세포를 나타냅니다.
MDS 쥐 모델은 그림 2H-J의 중간엽 기질 세포 분석을 설명하는 데 사용됩니다. 그림 2H는 CD31 음성(Pe-Cy7, Y축)과 비교를 나타냅니다. P4를 통해 게이트된 SSC-A 세포. 야생형 대조군 마우스와 MDS 마우스의 중간엽 기질 세포 집단은 그림 2I에 나와 있습니다. P10을 통해 게이트된 중간엽 기질 세포는 CD45-Ter119-CD31-CD51+CD140a+, P113(Pe, Y축; Pe-Cy5, X축). 실험 대조군(점선)인 그림 2J는 그림 2I의 실험 샘플에 표시된 MSC를 게이트하는 데 사용되는 단색 게이팅 대조군, CD51 단일 염색 및 CD140a 단일 염색의 예를 보여줍니다.
이 데이터는 세동맥 내피 세포가 AML 미세환경에서 현저하게 증식하고, 정현파 내피 집단에서 수반되는 손실이 발생한다는 것을 나타내며(그림 2F), 이는 면역 결핍 마우스에서 환자 유래 이종이식편을 사용한 이전 연구와 일치한다28. 생후 8주에 NHD13 마우스에서 볼 수 있는 중간엽 기질 세포의 작은 확장(그림 2I)은 이들 마우스가 MDS25의 특성을 나타내기 시작하는 16-20주에 증가할 수 있습니다. 내피 세포 집단을 설명하기 위해 백혈병 모델만 사용되고 중간엽 기질 세포 집단을 설명하기 위해 MDS 쥐 모델만 사용되지만, 유사한 염색 및 게이팅 전략을 사용하여 이러한 모델 중 하나에서 또는 실제로 관심 있는 유전자 조작 쥐 모델에서 다양한 미세환경 집단을 분석할 수 있습니다.
그림 1: 골수 기질 세포의 분리. 개략도는 대조군 및 백혈병 마우스에서 비조혈성 골수 기질 세포를 분리하는 과정을 보여줍니다. 간단히 말해서, 뼈 뾰족뾰족한 부분과 골수를 따로 소화한 다음 합쳐집니다. CD45-Ter119- 집단은 자기 분류에 의해 농축되고 중간엽 기질 세포 및 내피 세포와 같은 관심 집단에 대한 항체 패널로 염색됩니다. 그런 다음 세포는 유세포 분석으로 분석됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 비조혈 골수 및 기질 세포에 대한 게이팅 전략. (A-D) 백혈병 및 MDS 쥐 모델 모두에서 소화된 CD45-/Ter119-, 비조혈 집단(P4)을 선택하는 데 사용되는 유세포 분석 게이팅 전략. (E) 백혈병 골수 내피 세포(P5, CD31+)는 (F) Sca1+ 세동맥(P6) 또는 Sca1- 정현파 내피 세포(P7)로 세분될 수 있습니다. (G) AML 샘플의 백혈병 생착, P8은 생착을 나타내고 P9는 비암세포를 나타냅니다. 점선은 이 그림이 실험 대조군임을 나타냅니다. (H) P4, MDS 골수 CD31- 세포, P10 (I) 중간엽 기질 세포(CD51+/CD140a+, P11)를 통해 게이트. (J) (I)의 중간엽 기질 세포에 대한 게이트를 결정하는 데 사용되는 단일 컬러 게이팅 제어의 예, CD51(왼쪽) 및 CD140a(오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 용액 | 시약 | 농도 | 추가할 금액 |
| FACS 버퍼 | HBSS(HBSS) | 10배 | 100mL |
| 증권 시세 표시기 | 0.5 미터 | 4mL | |
| 소 태아 세럼 | - | 50 mL | |
| 물 | - | 848 mL | |
| 골수 소화 혼합물 | HBSS(HBSS) | 1배 | 2mL |
| DNase 1 (디나제) | 1x DPBS에서 1μg/mL | 20 μL | |
| 디스파제 II 파우더 | - | 4의 mg의 | |
| 콜라겐분해효소 IV형 | - | 2의 mg의 | |
| 뼈 미세 소화 혼합물 | (주)디피에스 | 1배 | 320 mL |
| 콜라겐 분해 효소 유형 1 | - | 1 지 | |
| 소 태아 세럼 | - | 80 mL | |
| MAC 버퍼 | 증권 시세 표시기 | 66 g / 몰 | 5 지 |
| (주)디피에스 | 10배 | 100mL | |
| 증권 시세 표시기 | 0.5 미터 | 4mL | |
| 물 | - | 896 패 |
표 1: 본 연구에 사용된 용액 및 완충액의 구성.
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Discussion
쥐 백혈병 모델은 공격적인 골수성 백혈병 진행을 촉진하는 세포 고유 및 틈새 유도 신호를 식별하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다 6,19,21. 여기에서는 MDS 및 AML의 쥐 모델에서 골수 미세환경의 세포 조성을 정의하기 위한 포괄적인 유세포 분석 기반 프로토콜을 제시합니다.
실험 샘플에서 유세포 분석 데이터를 획득하기 전에 형광 중첩을 신중하게 보정하는 것이 중요합니다. 또한 모든 적절한 염색 및 게이팅 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 이러한 단계를 통해 실험자는 양성 또는 음성 항체 염색이 관심 세포 마커의 정확한 발현을 나타내며 형광 스펙트럼 중첩 또는 자가형광의 인공물이 아님을 확인할 수 있습니다. 이 프로토콜은 선택된 세포 표면 마커를 설명하지만, 항체 패널은 실험적 필요에 따라 확장될 수 있습니다. 예를 들어, CD144(Ve-Cadherin)는 마우스를 수확하기 전에 생체내에서 투여될 수 있고, 내피 세포(5,29)의 추가적인 특이적 마커로서 작용할 수 있다. 여기에 표시된 형광단 및 항체 클론은 변경할 수 있지만, 이상적인 희석을 결정하기 위해 적정을 수행해야 합니다. 골수 틈새의 모든 세포 집단을 범주적으로 정의하기 위해, 단일 세포 RNA-시퀀싱을 사용하여 MDS/AML 개시 및 진행 동안 골수 틈새 환경을 설정할 수 있습니다 23,24,30.
이 프로토콜에 설명된 단계에 따라 샘플을 신중하게 준비하는 것이 중요합니다. 뼈를 균질화할 때 절구와 유봉을 식히고 세포 사멸을 방지하고 높은 세포 회수율을 보장하기 위해 모든 단계를 얼음 위에서 수행하는 것이 중요합니다. 원하지 않는 다른 세포 유형의 오염을 방지하기 위해 균질화하기 전에 뼈를 둘러싼 모든 조직을 제거하는 것이 매우 중요합니다. 적혈구 용해 및 분해 중에 적절한 양의 FACS 완충액으로 효소 반응을 중지하고 신선한 완충액에 완전히 재현탁하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 세포가 계속 소화되어 결국 죽게 됩니다.
뼈 조각과 골수 분획을 분리하는 것은 뼈 스피큘이 소화 완충액을 위해 다른 효소 혼합물을 필요로 하고 소화하는 데 더 오랜 시간이 필요하기 때문에 필수적입니다. 뼈 소화에서 콜라겐 분해 효소 1형은 세포외 기질과 콜라겐 섬유에서 흔히 발견되는 콜라겐 분해 효소 섬유를 소화하는 데 유용하다31. 또한 내관 가까이에 위치한 일부 골수 세포는 균질화 후에도 뼈에 부착된 상태로 유지되며 효소 소화에 의해서만 방출됩니다. 골수를 소화할 때, 콜라겐분해효소 IV형은 골수(32) 내의 상피 및 내피 세포의 기저막을 소화하는 데 사용되는 반면, 디스파제는 주로 피브로넥틴(31)을 절단한다. 골수는 세포와 기질 사이의 결합이 약하기 때문에 소화하는 데 더 적은 시간이 필요합니다. 유사한 조건에서 골수 분획을 배양하면 관심 개체군이 손상될 수 있습니다. 두 개의 서로 다른 분해 완충액을 사용하면 검출할 수 있는 장루 집단의 수가 크게 증가하여 분석할 수 있는 더 큰 데이터 세트를 얻을 수 있습니다.
쥐 골수 미세환경 집단을 분석하기 위해 이용 가능한 대부분의 프로토콜은 주사기를 사용하여 긴 뼈에서만 골수를 씻어낸다13,24. 뼈를 분쇄하는 현재의 방법은 골반과 같은 다른 뼈에서 데이터를 수집할 수 있는 기능을 제공하고, 샘플 준비 시간을 크게 단축하며, 날카로운 바늘로 인한 부상 가능성을 완화합니다. 뼈가 성숙한 조골세포와 정상 및 악성 조혈 세포를 지원할 수 있는 다른 세포 집단으로 구성되어 있다는 점을 감안할 때, 뼈 스피큘의 세포를 포함하는 이 방법은 샘플에서 골수 미세환경을 보다 정확하게 표현할 수 있습니다. 이전의 한 연구에서는 골수와 뼈 스피큘을 분리하여11 소화했지만, 동일한 샘플에서 골선과 내피세포의 염색을 입증하지 못했다. 두 번째 연구에서는 상업적으로 이용 가능한 독점적인 효소 혼합물을 사용하여 골수와 뼈 스피큘을 소화하고(23) 훨씬 더 비싼 단일 세포 RNA 시퀀싱 기술을 사용하여 데이터를 분석했습니다. CD45-/Ter119- 세포에 대한 이 농축 방법은 관심 세포를 선택하고 유세포 분석기에서 데이터를 획득하는 데 필요한 시간을 크게 줄여줍니다. 따라서, 단일-세포 RNA 시퀀싱과 같은 다른 최첨단 방법과 비교하여, 이러한 유세포분석-기반 방법은 보다 접근하기 쉽고, 비용 효율적이며, 훈련된 생물정보학자에 의한 정교한 분석을 필요로 하지 않는다 23,24,30.
이 프로토콜은 MDS 및 AML의 사용 가능한 쥐 모델뿐만 아니라 모든 유전적 마우스 모델의 골수 미세환경을 특성화하는 데 사용할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 유사한 방법은 환자 유래 이종이식(PDX) 모델의 쥐 골수 틈새의 변화를 분석하는 데에도 효과적일 수 있습니다. 이러한 방법은 MDS/AML이 골수 틈새에 영향을 미치는 메커니즘을 결정하기 위한 연구에 유용할 수 있습니다. 인간 환자로부터 대량의 골수를 채취하는 것과 관련된 기술적 문제를 감안할 때, 이러한 쥐 모델 분석은 악성 골수 미세환경에 대한 이해를 높이고 질병 진행에서 그 역할을 정의하는 데 효과적인 도구입니다.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
URMC 유세포 분석 코어에 감사드립니다. 이 연구는 미국 혈액학회 학술상, 백혈병 연구 재단 상, NIH 보조금 R01DK133131 및 J.B.에 수여된 R01CA266617의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors - sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
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