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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

सीएमओएस-एकीकृत उच्च घनत्व माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी पर मल्टीमॉडल बड़े पैमाने पर न्यूरोनल पहनावा गतिशीलता की रिकॉर्डिंग और विश्लेषण

Published: March 8, 2024 doi: 10.3791/66473
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2,3
1Group of "Biohybrid Neuroelectronics (BIONICS)", German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Faculty of Medicine Carl Gustav Carus, Technical University Dresden, 3Dresden Center for Intelligent Materials (DCIM), Technical University Dresden
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एचडी-एमईए को बड़े पैमाने पर न्यूरोनल पहनावा की कम्प्यूटेशनल गतिशीलता में तल्लीन करने के लिए नियोजित करते हैं, विशेष रूप से हिप्पोकैम्पल, घ्राण बल्ब सर्किट और मानव न्यूरोनल नेटवर्क में। कम्प्यूटेशनल टूल के साथ संयुक्त स्पैटिओटेम्पोरल गतिविधि को कैप्चर करना, न्यूरोनल पहनावा जटिलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। विधि मस्तिष्क कार्यों की समझ को बढ़ाती है, संभावित रूप से बायोमार्कर की पहचान करती है और न्यूरोलॉजिकल विकारों के लिए उपचार करती है।

Abstract

बड़े पैमाने पर न्यूरोनल नेटवर्क और उनके जटिल वितरित माइक्रोक्रिकिट धारणा, अनुभूति और व्यवहार उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हैं जो स्पैटिओटेम्पोरल न्यूरोनल गतिविधि के पैटर्न से उभरते हैं। परस्पर जुड़े न्यूरोनल पहनावा के कार्यात्मक समूहों से उभरने वाले ये गतिशील पैटर्न मल्टीस्केल तंत्रिका जानकारी को संसाधित करने और कोडिंग के लिए सटीक गणना की सुविधा प्रदान करते हैं, जिससे उच्च मस्तिष्क कार्यों को चलाया जाता है। इस जटिलता को अंतर्निहित तंत्रिका गतिशीलता के कम्प्यूटेशनल सिद्धांतों की जांच करने और स्वास्थ्य और बीमारी में जैविक प्रक्रियाओं के बहुस्तरीय प्रभाव की जांच करने के लिए, बड़े पैमाने पर एक साथ रिकॉर्डिंग सहायक बन गई है। यहां, एक उच्च घनत्व माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (एचडी-एमईए) तंत्रिका गतिशीलता के दो तौर-तरीकों का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जाता है - पूर्व विवो माउस मस्तिष्क स्लाइस से हिप्पोकैम्पस और घ्राण बल्ब सर्किट और मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (आईपीएससी) के इन-विट्रो सेल संस्कृतियों से न्यूरोनल नेटवर्क। एचडी-एमईए प्लेटफॉर्म, 4096 माइक्रोइलेक्ट्रोड के साथ, उच्च स्थानिक संकल्प पर एक साथ हजारों न्यूरोनल पहनावा से बाह्य फायरिंग पैटर्न की गैर-आक्रामक, बहु-साइट, लेबल-मुक्त रिकॉर्डिंग को सक्षम बनाता है। यह दृष्टिकोण कई इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल नेटवर्क-वाइड विशेषताओं के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, जिसमें सिंगल/-मल्टी-यूनिट स्पाइकिंग गतिविधि पैटर्न और स्थानीय क्षेत्र संभावित दोलन शामिल हैं। इन बहुआयामी तंत्रिका डेटा की जांच करने के लिए, हमने मशीन लर्निंग एल्गोरिदम, स्वचालित घटना का पता लगाने और वर्गीकरण, ग्राफ सिद्धांत और अन्य उन्नत विश्लेषणों को शामिल करते हुए कई कम्प्यूटेशनल उपकरण विकसित किए हैं। इस मंच के साथ इन कम्प्यूटेशनल पाइपलाइनों को पूरक करके, हम सेल असेंबली से नेटवर्क तक बड़े, मल्टीस्केल और मल्टीमॉडल गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक पद्धति प्रदान करते हैं। यह संभावित रूप से स्वास्थ्य और बीमारी में जटिल मस्तिष्क कार्यों और संज्ञानात्मक प्रक्रियाओं की हमारी समझ को आगे बढ़ा सकता है। खुले विज्ञान और बड़े पैमाने पर कम्प्यूटेशनल तंत्रिका गतिशीलता में अंतर्दृष्टि के प्रति प्रतिबद्धता मस्तिष्क से प्रेरित मॉडलिंग, न्यूरोमोर्फिक कंप्यूटिंग और तंत्रिका सीखने के एल्गोरिदम को बढ़ा सकती है। इसके अलावा, बिगड़ा हुआ बड़े पैमाने पर तंत्रिका संगणना और उनके परस्पर जुड़े माइक्रोक्रिकिट गतिशीलता के अंतर्निहित तंत्र को समझने से विशिष्ट बायोमार्कर की पहचान हो सकती है, जिससे न्यूरोलॉजिकल विकारों के लिए अधिक सटीक नैदानिक उपकरण और लक्षित उपचार का मार्ग प्रशस्त हो सकता है।

Introduction

न्यूरोनल पहनावा, अक्सर सेल विधानसभाओं कहा जाता है, तंत्रिका कोडिंग में महत्वपूर्ण हैं, मल्टीस्केल तंत्रिका जानकारी 1,2,3 प्रसंस्करण के लिए जटिल गणना की सुविधा. ये पहनावा विशाल न्यूरोनल नेटवर्क और उनके सूक्ष्म माइक्रोक्रिकिट्स के गठन को रेखांकित करतेहैं 4. इस तरह के नेटवर्क और उनके दोलन पैटर्न धारणा और अनुभूति सहित उन्नत मस्तिष्क कार्यों को संचालित करते हैं। जबकि व्यापक शोध ने विशिष्ट न्यूरोनल प्रकारों और सिनैप्टिक मार्गों का पता लगाया है, न्यूरॉन्स सहयोगी रूप से सेल असेंबली कैसे बनाते हैं और सर्किट और नेटवर्क में स्थानिक सूचना प्रसंस्करण को प्रभावित करते हैं, इसकी गहरी समझ मायावीबनी हुई है 5.

तीव्र, पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस बरकरार तंत्रिका सर्किट का अध्ययन करने के लिए निर्णायक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल उपकरण हैं, जो औषधीय परीक्षण और रोग मॉडलिंग 6,7,8में निहितार्थ के साथ तंत्रिका समारोह, सिनैप्टिक ट्रांसमिशन और कनेक्टिविटी के दोलन गतिविधि पैटर्न की जांच के लिए एक नियंत्रित सेटिंग की पेशकश करते हैं। यह अध्ययन प्रोटोकॉल दो प्रमुख मस्तिष्क सर्किट पर प्रकाश डाला गया है - हिप्पोकैम्पस-कॉर्टिकल (एचसी) सीखने और स्मृति प्रक्रियाओं 9,10 में शामिल है, और घ्राण बल्ब (ओबी) गंध भेदभाव 11,12,13के लिए जिम्मेदार है। इन दो क्षेत्रों में, नए कार्यात्मक न्यूरॉन्स लगातार स्तनधारी दिमाग14 में जीवन भर वयस्क neurogenesis द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. दोनों सर्किट बहुआयामी गतिशील तंत्रिका गतिविधि पैटर्न और निहित प्लास्टिसिटी प्रदर्शित करते हैं जो मौजूदा तंत्रिका नेटवर्क को फिर से वायर करने में भाग लेते हैं और15,16 की आवश्यकता होने पर वैकल्पिक सूचना प्रसंस्करण रणनीतियों की सुविधा प्रदान करते हैं।

तीव्र, पूर्व-विवो मस्तिष्क टुकड़ा मॉडल मस्तिष्क की कार्यक्षमता में तल्लीन करने और माइक्रोक्रिकिट स्तर पर रोग तंत्र को समझने के लिए अपरिहार्य हैं। हालांकि, मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) न्यूरोनल नेटवर्क से व्युत्पन्न इन-विट्रो सेल संस्कृतियों अनुवाद अनुसंधान का एक आशाजनक एवेन्यू प्रदान करते हैं, मूल रूप से संभावित मानव नैदानिक उपचार17,18के लिए पशु प्रयोगों से निष्कर्षों को जोड़ने. ये मानव-केंद्रित इन-विट्रो परख औषधीय विषाक्तता का आकलन करने, सटीक दवा स्क्रीनिंग को सक्षम करने और अभिनव सेल-आधारित चिकित्सीय रणनीतियों 19,20में अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए एक विश्वसनीय मंच के रूप में कार्य करते हैं। आईपीएससी न्यूरोनल मॉडल की निर्णायक भूमिका को पहचानते हुए, हमने इस प्रोटोकॉल अध्ययन के तीसरे मॉड्यूल को अपने व्युत्पन्न नेटवर्क की कार्यात्मक विशेषताओं की पूरी तरह से जांच करने और संबंधित सेल संस्कृति प्रोटोकॉल को ठीक करने के लिए समर्पित किया है।

इन इलेक्ट्रोजेनिक तंत्रिका मॉड्यूल का अध्ययन आमतौर पर कैल्शियम (सीए2 + इमेजिंग), पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग और कम घनत्व वाले माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियों (एलडी-एमईए) जैसी तकनीकों का उपयोग करके किया गया है। सीए2 + इमेजिंग एकल सेल गतिविधि मानचित्रण प्रदान करता है, यह एक सेल लेबलिंग आधारित विधि अपने कम अस्थायी संकल्प और लंबी अवधि की रिकॉर्डिंग में चुनौतियों से बाधा है. एलडी-एमईए में स्थानिक परिशुद्धता की कमी होती है, जबकि पैच-क्लैंप, एक आक्रामक एकल-साइट तकनीक और श्रमसाध्य होने के नाते, अक्सर कम सफलता दर 21,22,23पैदा करता है। इन चुनौतियों का समाधान करने और प्रभावी ढंग से नेटवर्क-व्यापी गतिविधि की जांच करने के लिए, बड़े पैमाने पर एक साथ तंत्रिका रिकॉर्डिंग मस्तिष्क जटिलता अंतर्निहित तंत्रिका गतिशीलता के कम्प्यूटेशनल सिद्धांतों और स्वास्थ्य और रोग 24,25में उनके निहितार्थ को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण के रूप में उभरा है।

इस JoVE प्रोटोकॉल में, हम पूर्व विवो माउस मस्तिष्क तीव्र स्लाइस (आंकड़े 1A-C) और में इन विट्रो मानव IPSC व्युत्पन्न न्यूरोनल नेटवर्क (आंकड़े 1D-E) से हिप्पोकैम्पस और घ्राण बल्ब सर्किट सहित, विभिन्न मस्तिष्क तौर-तरीकों में spatiotemporal न्यूरोनल गतिविधि पर कब्जा करने के लिए उच्च घनत्व MEA (HD विदेश मंत्रालय) पर आधारित एक बड़े पैमाने पर तंत्रिका रिकॉर्डिंग विधि का प्रदर्शन, पहले हमारे समूह और अन्य सहयोगियों26 द्वारा रिपोर्ट,27,28,29,30,31,32,33,34,35. एचडी-एमईए, पूरक-धातु-ऑक्साइड-अर्धचालक (सीएमओएस) तकनीक पर बनाया गया है, ऑन-चिप सर्किटरी और प्रवर्धन का दावा करता है, जिससे 7 मिमी2 सरणी आकार36 में उप-मिलीसेकंड रिकॉर्डिंग की अनुमति मिलती है। यह गैर-इनवेसिव दृष्टिकोण स्थानीय क्षेत्र क्षमता (एलएफपी) और मल्टीयूनिट स्पाइकिंग गतिविधि (एमयूए)26,29की जटिल गतिशीलता को प्रकट करते हुए, एक उच्च स्थानिक अस्थायी संकल्प पर 4096 माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग करके हजारों न्यूरोनल पहनावा से बहु-साइट, लेबल-मुक्त बाह्य फायरिंग पैटर्न को पकड़ता है।

इस पद्धति द्वारा उत्पन्न डेटा की विशालता को देखते हुए, एक परिष्कृत विश्लेषणात्मक ढांचा आवश्यक है, फिर भीचुनौतियां 37 हैं। हमने कम्प्यूटेशनल टूल विकसित किए हैं जो स्वचालित घटना का पता लगाने, वर्गीकरण, ग्राफ सिद्धांत, मशीन सीखने और अन्य उन्नत तकनीकों (चित्रा 1 एफ)26,29,38,39को शामिल करते हैं। इन विश्लेषणात्मक उपकरणों के साथ एचडी-एमईए को एकीकृत करते हुए, विभिन्न तंत्रिका तौर-तरीकों में व्यापक तंत्रिका नेटवर्क के लिए व्यक्तिगत सेल विधानसभाओं से जटिल गतिशीलता की जांच करने के लिए एक समग्र दृष्टिकोण तैयार किया गया है। यह संयुक्त दृष्टिकोण सामान्य मस्तिष्क कार्यों में कम्प्यूटेशनल गतिशीलता की हमारी समझ को गहरा करता है और रोग स्थितियों28 में मौजूद विसंगतियों में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण से अंतर्दृष्टि मस्तिष्क से प्रेरित मॉडलिंग, न्यूरोमोर्फिक कंप्यूटिंग और तंत्रिका सीखने के एल्गोरिदम में प्रगति को प्रेरित कर सकती है। अंततः, यह विधि तंत्रिका नेटवर्क व्यवधानों के पीछे मुख्य तंत्र को उजागर करने, संभावित रूप से बायोमार्कर की पहचान करने और न्यूरोलॉजिकल स्थितियों के लिए सटीक नैदानिक उपकरण और लक्षित उपचार के निर्माण का मार्गदर्शन करने का वादा करती है।

Protocol

सभी प्रयोगों को लागू यूरोपीय और राष्ट्रीय नियमों (Tierschutzgesetz) के अनुसार किया गया था और स्थानीय प्राधिकरण (Landesdirektion Sachsen; 25-5131 / 476/14) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. एचडी-एमईए पर हिप्पोकैम्पस-कॉर्टिकल और घ्राण बल्ब सर्किट से पूर्व-विवो मस्तिष्क स्लाइस

  1. प्रयोगात्मक काटने और रिकॉर्डिंग समाधान की तैयारी (चित्रा 2 ए)
    1. प्रयोगात्मक दिन पर, उच्च सुक्रोज काटने समाधान के 0.5 एल और कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (एसीएसएफ) रिकॉर्डिंग समाधान (तालिका 1 ए, बी) के 1 एल तैयार करते हैं।
      1. एक सूखी वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में सभी ठोस रसायनों को जोड़ें, फिर डबल डिस्टिल्ड (डीडी) पानी के साथ रास्ते का हिस्सा भरें।
      2. 1 एम स्टॉक समाधान से एमजीसीएल2 और सीएसीएल2 जोड़ें, फिर शेष डीडी पानी से भरें। एक चुंबकीय उत्तेजक के साथ लगातार सरगर्मी शुरू करें जब तक कि दृश्यमान ठोस ~ 5 मिनट भंग न हो जाएं।
    2. उच्च सुक्रोज काटने के समाधान के लिए 350-360 mOsm और aCSF रिकॉर्डिंग समाधान के लिए 315-325 mOsm के बीच परासरण को मान्य करने के लिए एक हिमांक ऑस्मोमीटर का उपयोग करें।
    3. उच्च सुक्रोज काटने समाधान के लिए 7.3-7.4 और एसीएसएफ रिकॉर्डिंग समाधान के लिए 7.25-7.35 के बीच पीएच को मान्य करने के लिए पीएच मीटर का उपयोग करें। 95% ओ2 और 5% सीओ2 के साथ लगातार बुदबुदाती शुरू करें।
    4. टुकड़ा करने की क्रिया से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए बर्फ पर उच्च सुक्रोज काटने के समाधान रखें और 95% ओ2 और 5% सीओ2 के साथ लगातार बुदबुदाती शुरू.
    5. कार्बोजेनेशन के 10 मिनट के बाद, 30 एमएल काटने के समाधान के साथ 50 एमएल बीकर भरें और इसे 20-30 मिनट के लिए फ्रीजर (-20 डिग्री सेल्सियस) में या आंशिक रूप से जमे हुए तक स्टोर करें।
      नोट: सभी समाधान प्रत्येक प्रयोग के लिए नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए. यहां उपयोग किया जाने वाला डीडी पानी कमरे के तापमान (आरटी) पर संग्रहीत अल्ट्राप्योर पानी है। तैयार किए गए समाधान की मात्रा विशिष्ट अध्ययन प्रश्न के अनुरूप होनी चाहिए।
  2. मस्तिष्क टुकड़ा कार्यक्षेत्र क्षेत्रों की तैयारी (चित्रा 2 ए)
    1. प्रयोगात्मक कमरे में जानवर लाओ.
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, 8-16 सप्ताह की आयु के C57BL/J6 मादा चूहों का उपयोग पहले 26,29,32के रूप में किया गया था। पशु परिवहन के बाद कम से कम 30 मिनट के लिए acclimate करने के लिए अनुमति दी जानी चाहिए. लंबी दूरी के स्थानान्तरण (यानी, अंतर-संस्थान) को प्रयोग के रूप में उसी दिन टाला जाना चाहिए। पशु की उम्र, लिंग और तनाव को विशिष्ट अध्ययन प्रश्न के आधार पर निर्धारित किया जाना है।
    2. जबकि जानवर अनुकूलन कर रहा है और उच्च-सुक्रोज समाधान ठंडा हो रहा है, प्रत्येक निर्दिष्ट कार्यक्षेत्र में आवश्यक उपकरण रखें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    3. मस्तिष्क टुकड़ा वसूली और रखरखाव कार्यक्षेत्र तैयार करें. कार्बोजेनेटेड एसीएसएफ रिकॉर्डिंग समाधान के साथ टुकड़ा वसूली कक्ष भरें और चैम्बर को 32 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी के स्नान में रखें। प्रयोग भर में निरंतर carbogenation बनाए रखें.
    4. मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी कार्यक्षेत्र तैयार करें. वाइब्रेटोम सेटअप करें - ब्लेड को वाइब्रेटोम ब्लेड होल्डर में रखें और वाइब्रेटोम को सही सेटिंग्स (ब्लेड यात्रा की गति: 0.20 मिमी/सेकंड, ऊंचाई आयाम: 95 माइक्रोन, ब्लेड कोण: 45°) पर कैलिब्रेट करें। वाइब्रेटोम आइस ट्रे को बर्फ से भरें और बफर ट्रे को उच्च-सुक्रोज कटिंग सॉल्यूशन से भरें और बफर ट्रे में घोल को कार्बोजेनेट करना शुरू करें।
    5. मस्तिष्क की तैयारी कार्यक्षेत्र तैयार करें। बर्फ के साथ 150 मिमी ग्लास पेट्री डिश भरें और अंदर फिल्टर पेपर के साथ एक 90 मिमी प्लास्टिक संस्कृति पकवान जगह है. प्लास्टिक कल्चर डिश को उच्च-सुक्रोज कटिंग सॉल्यूशन से भरें और कार्बोजेनेटिंग शुरू करें। ठंडा नमूना प्लेट में सुपर गोंद की एक बूंद जोड़ें और अगारोज मोल्ड संलग्न करें।
      नोट: Agarose मोल्ड एक कस्टम माउस मस्तिष्क मोल्ड में पानी में 3% agarose के साथ कम से कम दिन पहले तैयार किया जाता है.
    6. अंत में, मस्तिष्क निष्कर्षण कार्यक्षेत्र तैयार करें। टिशू पेपर के साथ एल्यूमीनियम पन्नी को कवर करें, उच्च सुक्रोज काटने समाधान कीचड़ युक्त 50 एमएल बीकर पुनः प्राप्त करें, और संज्ञाहरण कक्ष में आइसोफ्लुरेन जोड़ें।
      नोट: संज्ञाहरण पशु नियुक्ति से पहले ~ 1 मिनट संज्ञाहरण कक्ष में जोड़ा जाएगा। उच्च सुक्रोज काटने समाधान कीचड़ के 30 एमएल के साथ एक 50 एमएल बीकर -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर ~ 2 मिनट से पहले हटा दिया जाएगा।
  3. निष्कर्षण और माउस मस्तिष्क के टुकड़ा करने की क्रिया
    नोट: मस्तिष्क को ऑक्सीजन की कमी से बचने के लिए इस पूरी प्रक्रिया को जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए। मस्तिष्क हटाने केवल उच्च सुक्रोज काटने समाधान कीचड़ में विसर्जन के लिए सिर काटना से 1-2 मिनट ले जाना चाहिए.
    1. आइसोफ्लुरेन (0.5 एमएल/1 एल एनेस्थीसिया चैंबर) की उचित खुराक के साथ जानवर को एनेस्थेटाइज करें। एक पंजा चुटकी के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई का निर्धारण; आगे बढ़ने से पहले PAW निकासी पलटा की कमी की पुष्टि करें।
    2. मस्तिष्क निष्कर्षण कार्यक्षेत्र में टिशू पेपर के लिए पशु स्थानांतरण और सर्जिकल कैंची के साथ यह सिर काट.
    3. मस्तिष्क स्टेम में आईरिस कैंची डालें और नीचे कैंची कैल्वरिया के साथ फ्लश रखें. कोरोनल सिवनी तक पहुंचने तक धनु सिवनी के साथ काटें। आंखों के सॉकेट में आईरिस कैंची रखें और मेटोपिक सिवनी के माध्यम से काट लें। पूरे मस्तिष्क को उजागर करते हुए, कैल्वरिया के किनारों को नीचे ले जाने के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करें।
      नोट: दोनों परितारिका कैंची और संदंश के साथ सावधान रहें मस्तिष्क पंचर नहीं जबकि टांके के माध्यम से काटने.
    4. उच्च सुक्रोज काटने समाधान कीचड़ के 30 एमएल के साथ 50 एमएल बीकर में घुमावदार संदंश के कुंद किनारे के साथ मस्तिष्क स्लाइड. इसे 1 मिनट तक रहने दें।
    5. मस्तिष्क तैयारी कार्यक्षेत्र में ठंडा कार्बोजेनेटेड काटने समाधान के साथ 90 मिमी प्लास्टिक संस्कृति पकवान के लिए मस्तिष्क स्थानांतरण. agarose मोल्ड में स्थिति के लिए मस्तिष्क ओरिएंट.
    6. अगारोज मोल्ड के रोस्ट्रल एंड में सुपर ग्लू का एक छोटा बिंदु जोड़ें। स्पैटुला के साथ मोल्ड में मस्तिष्क रखें। सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क क्षैतिज टुकड़ा करने की क्रिया के लिए पृष्ठीय पक्ष नीचे के साथ रखा गया है.
      नोट: मोल्ड में गोंद का स्थान ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) के आधार पर बदल जाएगा। हिप्पोकैम्पस-कॉर्टिकल (एचसी) और घ्राण बल्ब (ओबी) स्लाइस के लिए, सुनिश्चित करें कि ओबी स्थिर है और मस्तिष्क के किनारे गोंद से मुक्त रहते हैं। बहुत अधिक गोंद स्लाइसिंग गुणवत्ता को प्रभावित करेगा और वाइब्रेटोम स्लाइसिंग के दौरान आँसू पैदा करेगा।
    7. बफर ट्रे में नमूना प्लेट ले जाएँ, सही कोण के साथ स्थिति में ब्लेड ले जाएँ, और मस्तिष्क के लिए संभव के रूप में करीब ब्लेड लाने के लिए बफर ट्रे ऊंचाई में वृद्धि.
    8. एचसी और ओबी ऊतकों के 0.20 मिमी / एस गति 300 माइक्रोन अंतराल पर टुकड़ा, तो एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ प्रत्येक टुकड़ा करने की क्रिया दौर के बाद उन्हें इकट्ठा.
    9. 45 मिनट के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एसीएसएफ से भरे वसूली कक्ष में स्लाइस छोड़ दें, इसके बाद आरटी पर 1 घंटे सुनिश्चित करें कि स्लाइस ओवरलैप नहीं करते हैं और पूरी तरह से कार्बोजेनेटेड समाधान के संपर्क में हैं।
      नोट: सभी समाधानों और समाधान युक्त किसी भी कक्ष के निरंतर कार्बोजनेशन को बनाए रखना सुनिश्चित करें। लगातार कार्बोजेनेशन को बनाए रखने के लिए एक दबाव नियामक का उपयोग किया जा सकता है।

2. एचडी-एमईए पर इन-विट्रो मानव आईपीएससी-आधारित न्यूरोनल नेटवर्क

नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सभी आईपीएससी न्यूरॉन्स व्यावसायिक रूप से प्राप्त किए जाते हैं ( सामग्री की तालिकादेखें)। ये मानव कोशिकाएं स्थिर आईपीएस सेल लाइनों से अलग थीं जो मानव परिधीय रक्त या फाइब्रोब्लास्ट से प्राप्त हुई थीं।

  1. इन-विट्रो मानव आईपीएससी सेल संस्कृतियों (चित्रा 2 बी) के लिए एचडी-एमईए चिप्स की कोटिंग
    1. अधिग्रहण रिकॉर्डिंग प्लेटफॉर्म पर एचडी-एमईए चिप रखें, जलाशय को पीबीएस से भरें, और कोटिंग से पहले चिप का परीक्षण करें। Brainwave सॉफ्टवेयर शुरू करो. फ़ाइल > नया रिकॉर्डिंग सत्र चुनें। रिकॉर्डिंग पैरामीटर को 50 हर्ट्ज की रिकॉर्डिंग आवृत्ति और 18 किलोहर्ट्ज़/इलेक्ट्रोड की नमूना आवृत्ति के लिए सेट करें। चिप को कैलिब्रेट करने के लिए एम्पलीफायर ऑफसेट बदलें। समस्या निवारण युक्तियों के लिए तालिका 2 देखें।
      नोट: रिकॉर्डिंग आवृत्ति और नमूना आवृत्ति पैरामीटर डेटा प्रकार और व्यक्तिगत सिस्टम आवश्यकताओं पर निर्भर करेगा।
    2. स्टरलाइज़ और प्री-कंडीशन एचडी-एमईए।
      1. हुड के तहत, चिप और 96% इथेनॉल (EtOH) के साथ सिक्त ऊतक के साथ कांच की अंगूठी पोंछ, तो एक बाँझ 100 मिमी एक्स 20 मिमी पेट्री डिश में प्रत्येक डिवाइस जगह और 20 मिनट के लिए 70% EtOH के साथ विदेश मंत्रालय जलाशय भरें.
      2. EtOH महाप्राण और बाँझ, फ़िल्टर्ड dd-पानी के साथ जलाशय धो 3 बार. पूर्व कंडीशनिंग मीडिया के 1 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रातोंरात सेते हैं।
        नोट: एचडी-एमईए सतह को अधिक हाइड्रोफिलिक बनाने के लिए प्री-कंडीशनिंग मीडिया को नमक-आधारित समाधान होना चाहिए। इसमें पहले से तैयार ब्रेनफिस (बीपी) पूरा मीडिया (>3 महीने पुराना नहीं) (टेबल्स 1 सी) शामिल हो सकते हैं।
    3. कोट एचडी-एमईए। अगले दिन, पूर्व-कंडीशनिंग मीडिया को एस्पिरेट करें। पूरे सक्रिय क्षेत्र को कोट करने के लिए 0.1 मिलीग्राम/एमएल पॉली-डीएल-ऑर्निथिन (पीडीएलओ) का 1 एमएल जोड़ें। एक इनक्यूबेटर में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    4. आरटी के लिए मीडिया तैयार करें और गर्म करें। प्रोटोकॉल यहाँ दो वाणिज्यिक स्रोतों से कार्यात्मक मानव IPSC न्यूरॉन्स शोषण; इस प्रकार, मीडिया घटक प्रत्येक आपूर्तिकर्ता के लिए भिन्न होते हैं। एक प्रोटोकॉल (टेबल्स 1 सी, डी) में वर्णित है।
    5. एस्पिरेट पीडीएलओ, डीडी-पानी से 3 बार धो लें और चिप्स को 10 मिनट के लिए हुड के नीचे सूखने दें।
    6. बाँझ, फ़िल्टर किए गए डीडी-पानी के साथ एक 35 मिमी x 10 मिमी पेट्री डिश भरें और इसे चिप के बगल में रखें ताकि उचित आर्द्रता बनाए रखी जा सके और अगले चरणों में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के वाष्पीकरण से बचा जा सके।
  2. एचडी-एमईएएस में मानव आईपीएससी न्यूरॉन्स का चढ़ाना और रखरखाव(चित्रा 2बी)
    1. पिघलना और माइक्रोलीटर एकाग्रता प्रति वांछित कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं को पतला (यानी, एचडी-एमईए पर 50 माइक्रोन ड्रॉप में 50,000 सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए 1000 कोशिकाओं /
    2. पिपेट उच्च लैमिनिन डॉटिंग मीडिया(तालिका 1डी)का उपयोग करके चिप सक्रिय क्षेत्र की सतह पर सेल निलंबन।
    3. 45-60 मिनट के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    4. धीरे-धीरे एचडी-एमईए जलाशय(तालिका 1सी)में मीडिया के 2 एमएल भरें।
    5. आरटी मीडिया (तालिका 1 सी) का उपयोग कर 1 दिन (डीआईवी 1) पोस्ट-सीडिंग पर 100% मीडिया परिवर्तन करें। हर 3-4 दिनों में 50% मीडिया बदलें। एचडी-एमईए को प्रयोग के दौरान 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट रखें।
      नोट: कोशिकाओं को उखाड़ने से बचने के लिए धीरे से पिपेट। किसी भी संदूषण के लिए मीडिया के रंग की जाँच करें। मीडिया परिवर्तन का अंतराल और मात्रा व्यक्तिगत अध्ययन प्रश्नों या सेल की जरूरतों / विनिर्देशों द्वारा निर्धारित की जा सकती है।
    6. वैकल्पिक: >70% EtOH के साथ मंच की सफाई के बाद एक ईमानदार अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोप के तहत DIV4-DIV8 के बीच सेल संस्कृति विकास की प्रगति की जाँच करें।

3. एचडी-एमईए के साथ पूर्व-विवो और इन-विट्रो बड़े पैमाने पर तंत्रिका रिकॉर्डिंग

  1. मस्तिष्क टुकड़ा रिकॉर्डिंग कार्यक्षेत्र की तैयारी (चित्रा 2 ए)
    1. जबकि मस्तिष्क स्लाइस ठीक हो रहे हैं, प्रत्येक नामित कार्यक्षेत्र में आवश्यक उपकरण रखें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
      नोट: मुख्य प्रणाली सेटअप अनुकूलित किया जाना चाहिए और मस्तिष्क टुकड़ा प्रयोगात्मक दिन से पहले अच्छी तरह से परीक्षण किया. छिड़काव प्रणाली (इनलेट लाइनों, पंप आउटलेट लाइनों, टयूबिंग, और ग्राउंडिंग) पीबीएस या एसीएसएफ और रिकॉर्डिंग मंच पर एक HD-MEA के साथ परीक्षण किया जा करने के लिए एक स्वच्छ संकेत सुनिश्चित करने की जरूरत है, वृद्धि संकेत शोर अनुपात, और छिड़काव शोर की कमी.
    2. ऊतक-चिप युग्मन को बढ़ाने के लिए पीडीएलओ के 0.1 मिलीग्राम/एमएल के साथ एचडी-एमईए चिप को कोट करें और 20 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. चिप इनक्यूबेशन के दौरान, गुरुत्वाकर्षण आधारित छिड़काव प्रणाली और रिकॉर्डिंग aCSF के साथ लाइनों को भरें. छिड़काव प्रणाली के निरंतर कार्बोजेनेशन सुनिश्चित करें। 4.5 एमएल / मिनट की प्रवाह दर और 37 डिग्री सेल्सियस का तापमान निर्धारित करें।
    4. अधिग्रहण रिकॉर्डिंग प्लेटफॉर्म पर एचडी-एमईए चिप रखें, जलाशय को एसीएसएफ से भरें, छिड़काव प्रणाली का परीक्षण करें, और किसी भी शेष सिस्टम शोर का निवारण करें।
      1. Brainwave सॉफ्टवेयर शुरू करो. फ़ाइल > नया रिकॉर्डिंग सत्र चुनें। रिकॉर्डिंग मापदंडों को 1 हर्ट्ज की रिकॉर्डिंग आवृत्ति और 14 किलोहर्ट्ज़/ इलेक्ट्रोड की नमूना आवृत्ति के लिए सेट करें। चिप को कैलिब्रेट करने के लिए एम्पलीफायर ऑफसेट बदलें। समस्या निवारण युक्तियों के लिए तालिका 2 देखें।
        नोट: रिकॉर्डिंग आवृत्ति और नमूना आवृत्ति पैरामीटर डेटा प्रकार और व्यक्तिगत सिस्टम आवश्यकताओं पर निर्भर करेगा।
    5. सुनिश्चित करें कि रिकॉर्डिंग क्षेत्र एक कमरे की रोशनी व्यवस्था या ऑप्टिकल टेबल पर एक छायांकित पिंजरे के माध्यम से अंधेरा है।
    6. छवि अधिग्रहण के लिए एचडी-एमईए चिप जलाशय और सक्रिय क्षेत्र के साथ स्टीरियोमाइक्रोस्कोप को संरेखित करें।
    7. संतुलन के लिए चिप जलाशय में लंगर रखें.
      नोट: एंकर ऑक्सीजन को बढ़ावा देने के लिए न्यूनतम तारों के साथ एक कस्टम-निर्मित प्लैटिनम वीणा है; हालाँकि, कुछ वाणिज्यिक उपलब्ध हैं।
    8. उचित छिड़काव ट्यूबों के लिए औषधीय यौगिकों जोड़ें.
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, दोनों सहज और 100 माइक्रोन 4-एमिनोपाइरीडिन (4-एपी) औषधीय रूप से प्रेरित रिकॉर्डिंग पहले वर्णित के रूप में प्राप्त किए गए थे। औषधीय यौगिकों को विशिष्ट अध्ययन प्रश्न के अनुरूप बनाया जा सकता है।
    9. मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी कार्यक्षेत्र में, एक 150 मिमी गिलास पेट्री डिश में एक नया 90 मिमी प्लास्टिक संस्कृति पकवान जगह है. एसीएसएफ जोड़ें और कार्बोजेनेटिंग शुरू करें।
  2. HD-MEAs का उपयोग कर HC और OB स्लाइस से सर्किट-वाइड रिकॉर्डिंग
    नोट: स्लाइस युग्मन को ऑक्सीजन की कमी से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके प्रदर्शन किया जाना चाहिए। युग्मन केवल अंतिम छिड़काव प्रणाली स्टार्टअप के लिए चिप सक्रिय क्षेत्र पर microdissected टुकड़ा के प्रारंभिक प्लेसमेंट से ~ 1 मिनट ले जाना चाहिए.
    1. एक गिलास विंदुक के साथ मस्तिष्क टुकड़ा वसूली कक्ष से टुकड़ा निकालें और निरंतर carbogenation के साथ एक 90 मिमी प्लास्टिक संस्कृति पकवान में जगह है. एक microdissection उपकरण का प्रयोग, आसपास के मस्तिष्क टुकड़ा ऊतक से एचसी या ओबी अलग.
    2. एचडी-एमईए जलाशय में एक गिलास विंदुक के साथ पृथक एचसी या ओबी तीव्र स्लाइस ले जाएँ. धीरे एक ठीक ब्रश के साथ विदेश मंत्रालय सक्रिय क्षेत्र पर टुकड़ा संरेखित करें। एचडी-एमईए चिप से सभी समाधानों को एक आकांक्षा प्रणाली के साथ अच्छी तरह से चूसो।
    3. लंगर धीरे टुकड़ा के शीर्ष पर संदंश का उपयोग प्लेस.
      नोट: लंगर टुकड़ा आंदोलन के बिना रखा जाना चाहिए युग्मन के नुकसान से बचने के लिए.
    4. धीरे चिप जलाशय के लिए समाधान जोड़ने के लिए और छिड़काव प्रणाली शुरू.
      नोट: इष्टतम रिकॉर्डिंग मापदंडों के लिए छिड़काव इनलेट और पंप आउटलेट से लामिना का प्रवाह सुनिश्चित करें।
    5. सुनिश्चित करें कि रिकॉर्डिंग क्षेत्र कमरे की रोशनी व्यवस्था के माध्यम से या ऑप्टिकल टेबल सेटअप पर छायांकित पिंजरे के साथ पर्याप्त रूप से मंद है।
    6. रिकॉर्डिंग या अतिरिक्त औषधीय मॉडुलन शुरू करने से पहले 10 मिनट के लिए टुकड़ा acclimate करने के लिए अनुमति दें.
    7. Brainwave सॉफ्टवेयर शुरू करो. फ़ाइल > नया रिकॉर्डिंग सत्र चुनें। रिकॉर्डिंग मापदंडों को 1 हर्ट्ज की रिकॉर्डिंग आवृत्ति और 14 किलोहर्ट्ज़/ इलेक्ट्रोड की नमूना आवृत्ति के लिए सेट करें। चिप को कैलिब्रेट करने के लिए एम्पलीफायर ऑफसेट बदलें।
      नोट: जैसा कि पहले खंड 3.1.4.1 में दर्शाया गया है, सिस्टम परीक्षण करते समय, इन समान रिकॉर्डिंग मापदंडों को लागू करना सुनिश्चित करें।
    8. प्रेस रिकॉर्ड पूर्व निर्धारित प्रयोगात्मक शर्तों के साथ अधिग्रहण शुरू करने के लिए.
    9. इसके तुरंत बाद अंतिम रिकॉर्डिंग, तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा की प्रकाश इमेजिंग पर कब्जा. स्लाइस रिकवरी चैंबर में वापस ले जाएं, ब्रश के साथ चिप के साथ युग्मित किसी भी कार्बनिक पदार्थ को हटा दें, और अगले स्लाइस के साथ जारी रखें। एचडी-एमईए को साफ करें जैसा कि खंड 3.4 में वर्णित है।
  3. एचडी-एमईए (चित्रा 2 बी) पर मानव आईपीएससी रिकॉर्डिंग कार्यक्षेत्र और नेटवर्क-व्यापी रिकॉर्डिंग की तैयारी
    नोट: रिकॉर्डिंग से पहले दिन या तुरंत मानव आईपीएससी रिकॉर्डिंग(तालिका 1सी)के बाद मीडिया बदलें। कार्यात्मक न्यूरॉन्स का उपयोग अध्ययन में, मीडिया हर 4 दिनों बदल गया था, और 4 पर, 8, 16, और 24 डीआईवी मीडिया तुरंत IPSC रिकॉर्डिंग के बाद बदल दिया है.
    1. HD-MEA अधिग्रहण प्लेटफॉर्म को >70% EtOH के साथ साफ करके एक बाँझ कार्य वातावरण सुनिश्चित करें।
    2. हुड के नीचे एचडी-एमईए रिंग पर संदर्भ के साथ धीरे-धीरे पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) -बेस कैप रखें। HD-MEA चिप को IPSC रिकॉर्डिंग कार्यक्षेत्र में ले जाएँ और HD-MEA चिप को अधिग्रहण प्लेटफ़ॉर्म से संलग्न करें।
    3. सुनिश्चित करें कि रिकॉर्डिंग क्षेत्र एक कमरे की रोशनी प्रणाली या ऑप्टिकल टेबल पर छायांकित पिंजरे के माध्यम से पर्याप्त रूप से मंद है।
    4. एचडी-विदेश मंत्रालय चिप रिकॉर्डिंग या अतिरिक्त औषधीय मॉडुलन शुरू करने से पहले 10 मिनट के लिए संतुलन करने के लिए अनुमति दें.
    5. Brainwave सॉफ्टवेयर शुरू करो. फ़ाइल > नया रिकॉर्डिंग सत्र चुनें। रिकॉर्डिंग पैरामीटर को 50 हर्ट्ज की रिकॉर्डिंग आवृत्ति और 18 किलोहर्ट्ज़/इलेक्ट्रोड की नमूना आवृत्ति के लिए सेट करें। चिप को कैलिब्रेट करने के लिए एम्पलीफायर ऑफसेट बदलें।
      नोट: जैसा कि पहले खंड 2.1.1 में दर्शाया गया है, कोटिंग और चढ़ाना से पहले सिस्टम परीक्षण करते समय, इन समान रिकॉर्डिंग मापदंडों को लागू करना सुनिश्चित करें।
    6. प्रयोगात्मक योजना के प्रत्येक दिन (यानी, 4, 8, 16, 24 DIVs) पर मानव IPSC नेटवर्क से सहज फायरिंग गतिविधि या औषधीय रूप से प्रेरित प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करें।
      नोट: चिप को स्थिर तापमान और आर्द्रता बनाए रखने और कोशिकाओं को किसी भी तापमान झटके को रोकने के लिए >30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर के बाहर न रहने दें।
    7. प्रयोग के दौरान 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एचडी-एमईए इनक्यूबेट करें।
    8. प्रयोग पूरा होने के बाद, चिप्स पर न्यूरोनल नेटवर्क को ठीक करें और आगे ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए दाग दें या एचडी-एमईए को सीधे साफ करें, जैसा कि चरण 3.4 में वर्णित है।
  4. एचडी-एमईए चिप्स की सफाई
    1. प्रयोग के बाद, उचित अपशिष्ट निपटान के अनुसार समाधान त्यागें और डीडी-पानी से कुल्ला।
    2. पसंद का डिटर्जेंट जोड़ें, सक्रिय क्षेत्र और पूरे जलाशय को क्यू-टिप से साफ करें और डिटर्जेंट को त्याग दें। डिटर्जेंट के साथ फिर से भरना, 20 मिनट के लिए सेते हैं, तो डिटर्जेंट त्यागें.
    3. प्रयोगशाला ग्रेड पानी के साथ अच्छी तरह से कुल्ला। फिर, डीडी-पानी के साथ 3-4 बार कुल्ला।
    4. एचडी-एमईए चिप को अच्छी तरह से सुखाने के लिए हवा के दबाव का प्रयोग करें।

4. एचडी-एमईए से बड़े पैमाने पर तंत्रिका रिकॉर्डिंग का विश्लेषण

नोट: जबकि चरण 4.1 ब्रेनवेव सॉफ्टवेयर विशिष्ट है, चरण 4.2 को प्रत्येक उपयोगकर्ता के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एचडी-एमईए डिवाइस प्रकार के आधार पर संशोधित किया जा सकता है।

  1. कच्चे डेटा प्रीप्रोसेसिंग और इवेंट डिटेक्शन
    1. Brainwave सॉफ्टवेयर में एक दर्ज कच्चे डेटा फ़ाइल (.brw) खोलें. विश्लेषण > LFP डिटेक्शन या स्पाइक डिटेक्शन चुनें।
      नोट: LFP डिटेक्शन कम पास 4वें ऑर्डर बटरवर्थ फिल्टर (1-100 हर्ट्ज) के साथ IIR फ़िल्टरिंग को नियोजित करता है। हार्ड थ्रेशोल्ड एल्गोरिदम में 150 μV की उच्च दहलीज, -150 μV की कम दहलीज, 70-120 एमएस के बीच एक ऊर्जा खिड़की, 10 एमएस की दुर्दम्य अवधि और 1 एस की अधिकतम घटना अवधि शामिल है। सिंगल और एमयूए स्पाइक डिटेक्शन आईआईआर फ़िल्टरिंग को उच्च पास 4वें ऑर्डर बटरवर्थ फ़िल्टर (300-3500 हर्ट्ज) के साथ नियोजित करता है। एक PTSD एल्गोरिथ्म 8 के मानक विचलन कारक, 2 एमएस की चरम जीवनकाल अवधि और 1 एमएस की दुर्दम्य अवधि के साथ लागू किया जाता है।
    2. HC और OB सर्किट रिकॉर्डिंग के लिए, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप से कैप्चर की गई संरचनात्मक प्रकाश छवि को आयात करने के लिए पता लगाई गई इवेंट फ़ाइल (.bxr) में उन्नत कार्यस्थान विकल्प जोड़ें। बड़े पैमाने पर एचसी सर्किटरी की जांच करते समय, डेंटेट गाइरस (डीजी), हिलस, कॉर्नू अमोनिस 1 (सीए 1), कॉर्नू अमोनिस 3 (सीए 3), एंटोरहिनल कॉर्टेक्स (ईसी), और पेरिहिनल कॉर्टेक्स (पीसी) युक्त संरचनात्मक परतें बनाएं। बड़े पैमाने पर ओबी सर्किटरी की जांच करते समय, घ्राण तंत्रिका परत (ओएनएल), ग्लोमेरुलर परत (जीएल), बाहरी प्लेक्सिफॉर्म परत (ईपीएल), माइट्रल सेल परत (एमसीएल), और ग्रेन्युल सेल परत (जीसीएल) युक्त संरचनात्मक परतें बनाएं। ईपीएल और एमसीएल को प्रक्षेपण परत (पीएल) के रूप में मानें, जिसमें घ्राण प्रांतस्था (ओसीएक्स) शामिल है।
  2. एक कस्टम पायथन कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन के साथ डेटा प्रोसेसिंग
    1. निरूपण
      1. कस्टम-लिखित पायथन स्क्रिप्ट 26,29,32 और h5py 3.6.0 पायथन पैकेज का उपयोग करके .bxr फ़ाइल पढ़ें।
      2. एचसी और ओबी ब्रेन स्लाइस सर्किट रिकॉर्डिंग से संबंधित आईपीएससी नेटवर्क रिकॉर्डिंग और एलएफपी इवेंट ट्रेनों से संबंधित स्पाइक ट्रेनें निकालें।
      3. सक्रिय इलेक्ट्रोड की कुल संख्या के साथ घटनाओं को चिह्नित करें, औसत घटना प्रति औसत सक्रिय इलेक्ट्रोड का 0.1% या 10% से कम या यादृच्छिक घटनाओं के रूप में सांख्यिकीय रूप से उचित फायरिंग दर सीमा के बाहर गिरने वाली घटनाओं का पता लगाएं और उन्हें हटा दें। इसके अतिरिक्त, आयाम और घटना अवधि थ्रेशोल्ड मान लागू करें।
        नोट: फायरिंग दर सीमा के लिए, 0.1-15 स्पाइक्स/एस और 0.1-60 एलएफपी घटनाओं/मिनट पर विचार किया जाता है। ये विश्लेषण किए गए डेटासेट के लिए उपयोग किए जाने वाले उदाहरण दर थ्रेशोल्ड मान हैं। दर, आयाम और अवधि थ्रेशोल्ड व्यक्तिगत डेटा पर निर्भर करेगा।
      4. परिणामी घटना ट्रेन डेटा को .npy फ़ाइल प्रारूप में साथ में spatiotemporal जानकारी के साथ सहेजें।
    2. रेखापुंज
      1. फ़िल्टर की गई ईवेंट .npy और .bxr फ़ाइलें पढ़ें और Matplotlib pyplot फ़ंक्शन (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html) का उपयोग करके एक रेखापुंज प्लॉट उत्पन्न करें।
      2. इसके अतिरिक्त, परत विशिष्टता के साथ मस्तिष्क टुकड़ा रिकॉर्डिंग के लिए, प्रकार और समूह कदम 4.1.2 में उत्पादित परतों के आधार पर इलेक्ट्रोड आईडी.
    3. मीन फायरिंग गतिविधि
      1. .bxr फ़ाइल से समय श्रृंखला डेटा को संसाधित करें, प्रत्येक इलेक्ट्रोड की औसत फायरिंग दर (घटनाओं की संख्या/रिकॉर्डिंग समय) की गणना करें।
      2. एक डेटा मैट्रिक्स का निर्माण करें जहां पंक्तियां और कॉलम एचडी-एमईए 64 x 64 सरणी में इलेक्ट्रोड के निर्देशांक का प्रतिनिधित्व करते हैं, जहां प्रत्येक मैट्रिक्स मान औसत फायरिंग दर को दर्शाता है।
      3. पायथन में मैटप्लोटलिब के इम्शो या सीबॉर्न के हीटमैप फ़ंक्शंस जैसे प्लॉटिंग लाइब्रेरी को नियोजित करें।
      4. यहां 'हॉट' रंग मानचित्र को नियोजित करें, एक सूचनात्मक हीटमैप बनाएं जो इलेक्ट्रोड सरणी में औसत फायरिंग दरों के स्थानिक वितरण को नेत्रहीन रूप से समाहित करता है।
    4. प्रतिनिधि तरंग निशान
      1. .brw फ़ाइल से समय श्रृंखला डेटा पढ़ें और Matplotlib pyplot फ़ंक्शन का उपयोग करके एक तरंग ट्रेस उत्पन्न करें। (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html)।
      2. इनपुट वांछित इलेक्ट्रोड आईडी, समय बिन, और एक प्रतिनिधि तरंग ट्रेस के लिए आवृत्ति बैंड. इन विश्लेषणों में परिभाषित फ़्रीक्वेंसी बैंड में कम आवृत्ति वाले LFP दोलन (1-100 हर्ट्ज) शामिल हैं जिनमें बैंडपास फ़िल्टर्ड δ, θ, β और γ फ़्रीक्वेंसी बैंड हैं; तीव्र लहर तरंगें (एसडब्ल्यूआर) (140-220 हर्ट्ज); और उच्च आवृत्ति एकल और एमयूए (300-3500 हर्ट्ज)। आवृत्ति बैंड δ, θ, β और γ क्रमशः 1-4 Hz, 5-12 Hz, 13-35 Hz और 35-100 Hz हैं।
    5. शक्ति वर्णक्रमीय घनत्व
      1. .brw फ़ाइल से समय श्रृंखला डेटा पढ़ें और प्रत्येक समय श्रृंखला के भीतर दोलन गतिविधि अंतर्निहित प्रमुख आवृत्तियों को समझने के लिए पीरियोडोग्राम की गणना करें।
      2. आवृत्ति-समय गतिशीलता के छद्म रंग स्पेक्ट्रोग्राम का निर्माण करें।
        नोट: स्पेक्ट्रा वर्णक्रमीय शक्ति घनत्व41 का अनुमान लगाने के लिए दर्ज LFPs के फास्ट फूरियर परिवर्तन का उपयोग करके वेल्च की विधि का उपयोग कर गणना कर रहे हैं.
      3. एक वर्णक्रमीय घनत्व मानचित्र के लिए वांछित इलेक्ट्रोड आईडी, समय बिन और आवृत्ति बैंड इनपुट करें। इन विश्लेषणों में परिभाषित आवृत्ति बैंड में चरण 4.2.4 में वर्णित शामिल हैं।
    6. कार्यात्मक कनेक्टिविटी
      1. मस्तिष्क टुकड़ा सर्किट रिकॉर्डिंग के लिए, 4.2.6.2-4.2.6.4 चरणों का पालन करें.
      2. .brw फ़ाइल से समय श्रृंखला डेटा पढ़ें और पियर्सन के सहसंबंध गुणांक (पीसीसी)42को नियोजित करने वाले 64 x 64 सरणी में सक्रिय इलेक्ट्रोड के जोड़े के बीच क्रॉस-सहप्रसरण की गणना करें।
      3. एक वेक्टर ऑटोरेग्रेसिव मॉडल को दूसरे पर एक समय श्रृंखला के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए बहुभिन्नरूपी ग्रेंजर कार्य-कारण का उपयोग करके समय श्रृंखला में फिट करें।
      4. सहसंबद्ध लिंक के भीतर दिशात्मक सूचना प्रवाह का आकलन करने के लिए निर्देशित स्थानांतरण फ़ंक्शन (डीटीएफ) लागू करें।
        नोट: बहुस्तरीय नेटवर्क में कार्यात्मक कनेक्टिविटी माध्य और सभी पार सहप्रसरण मूल्यों43,44 के दो मानक विचलन के आधार पर एक सहसंबंध मूल्य सीमा निर्धारित करके स्थापित की है.
      5. IPSC रिकॉर्डिंग के लिए, चरणों 4.2.6.6-4.2.6.8 का पालन करें.
      6. .bxr फ़ाइल से स्पाइकट्रेन डेटा पढ़ें और spike_train_correlation फ़ंक्शंस (https://elephant.readthedocs.io/en/v0.7.0/reference/spike_train_correlation.html) का उपयोग करके बिनड स्पाइक ट्रेनों के सभी संयोजनों के बीच पीसीसी सहसंबंध गुणांक के 64x64 मैट्रिक्स की गणना करें।
        नोट: बहुस्तरीय नेटवर्क में कार्यात्मक कनेक्टिविटी सभी क्रॉस-सहप्रसरण मूल्यों के माध्य और दो मानक विचलन के आधार पर एक सहसंबंध मूल्य सीमा निर्धारित करके स्थापित की जाती है।
      7. इसके अलावा, अधिकतम प्रसार वेग (400 मिमी/एस पर सेट)45से अधिक संभावित युग्मित कनेक्शन को खत्म करने के लिए कनेक्टिविटी मैट्रिक्स पर स्थानिक-लौकिक फिल्टर (एसटीएफ) और दूरी-निर्भर विलंबता थ्रेसहोल्ड (डीडीएलटी) फ़िल्टरिंग प्रक्रियाओं को लागू करें।
      8. फ़िल्टरिंग और थ्रेसहोल्डिंग संचालन के साथ परिणामी क्रॉस-सहसंबंध मैट्रिसेस से नकारात्मक चोटियों को निकालें ताकि फ़िल्टर्ड और सामान्यीकृत क्रॉस-सहसंबंध हिस्टोग्राम (एफएनसीसीएच) एल्गोरिथ्म45 का उपयोग करके निरोधात्मक कनेक्शन की पहचान की जा सके।
      9. प्रत्येक कनेक्टिविटी मैट्रिक्स को डायनेमिक ग्राफ़ (.gexf) फ़ाइल में रूपांतरित करें.
    7. नेटवर्क कनेक्टिविटी मानचित्र
      1. विशिष्ट समय डिब्बे प्लॉट करने के लिए गतिशील ग्राफ के लिए गेफी प्रोग्राम 9.2 संस्करण (https://gephi.org) में डेटा प्रयोगशाला खोलें।
      2. स्थानिक मानचित्रण के लिए लेआउट विंडो में जियो लेआउट लागू करें।
      3. तुलना के लिए डिग्री रेंज और एज वेट पर पैरामीटर बाधाएं रखें।
      4. बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए नोडल रंग, किनारे का आकार और डिग्री आकार असाइन करें।

Representative Results

मल्टीमॉडल स्पैटिओटेम्पोरल मैपिंग और ऑसिलेटरी फायरिंग सुविधाओं का निष्कर्षण
नेटवर्क-वाइड एलएफपी और स्पाइक घटनाओं को निर्धारित करने के लिए जो गतिशील न्यूरोनल पहनावा से उभरे, हमने एचसी और ओबी सर्किट और मानव आईपीएससी नेटवर्क में तुल्यकालिक बड़े पैमाने पर फायरिंग पैटर्न की जांच की। चरण 3.2 से रिकॉर्ड किए गए मस्तिष्क टुकड़ा सर्किट और चरण 3.3 से आईपीएससी नेटवर्क रिकॉर्ड प्रोटोकॉल के 4.1-4.2 चरणों के अनुसार विश्लेषण किया गया। सबसे पहले, घटना का पता लगाने और denoising सभी दर्ज डेटासेट के लिए प्रदर्शन किया गया और क्षेत्रीय सर्किट विनिर्देशों के अनुसार हल किया गया. इसके बाद, मतलब बड़े पैमाने पर एलएफपी और स्पाइक फायरिंग पैटर्न, पता चला घटनाओं के रास्टरग्राम, और फ़िल्टर्ड तरंगों के प्रतिनिधि 5-एस निशान (आंकड़े 3 ए-आई) के स्थलाकृतिक छद्म रंग स्थानिक मानचित्रण प्लॉट किए गए थे। बड़े पैमाने पर एलएफपी और स्पाइक फायरिंग दर पैटर्न की स्थलाकृतिक छद्म रंग मानचित्रण एचसी (चित्रा 3ए), ओबी(चित्रा 3बी)और मानव आईपीएससी न्यूरोनल नेटवर्क(चित्रा 3सी)की संबंधित माइक्रोस्कोप-कैप्चर ऑप्टिकल छवियों पर मढ़ा गया था। यह व्यक्तिगत सर्किट और नेटवर्क-आधारित दोलन पैटर्न और प्रतिक्रियाओं की जांच की अनुमति देता है। HC और OB रास्टरग्राम में HC सर्किट की DG, Hilus, CA3, CA1, EC, और PC परतों और OB नेटवर्क की ONL, OCx, GL, PL, और GCL परतों पर 60-s समय बिन (आंकड़े 3D, E) पर क्रमबद्ध LFP इवेंट काउंट का पता लगाया गया है। मानव आईपीएससी रेखापुंज एक 20 एस समय बिन (चित्रा 3 जी) से अधिक परस्पर जुड़े सुसंस्कृत नेटवर्क के तुल्यकालिक पता लगाया स्पाइक घटनाओं को प्रदर्शित करता है. अगला, बड़े पैमाने पर HD-MEA रिकॉर्डिंग साइटों से 5s प्रतिनिधि घटना निशान एचसी में दर्ज दोलन आवृत्तियों की एक श्रृंखला दिखाने (यानी, सीए 3 में चयनित इलेक्ट्रोड) (चित्रा 3 जी) और ओबी (यानी, जीएल में चयनित इलेक्ट्रोड) (चित्रा 3एच) सर्किट और सरणी में चार चयनित सक्रिय इलेक्ट्रोड से मानव आईपीएससी नेटवर्क में multiunit स्पाइक फटने गतिविधि (चित्रा 3I)). ये अनुकरणीय संकेत बायोसिग्नल हस्ताक्षर दिखाते हैं, जिसमें कम आवृत्ति वाले LFP दोलन (1-100 हर्ट्ज) शामिल हैं, जिसमें बैंडपास फ़िल्टर्ड δ, θ, β और γ फ़्रीक्वेंसी बैंड शामिल हैं; तीव्र लहर तरंगें (एसडब्ल्यूआर) (140-220 हर्ट्ज); और उच्च आवृत्ति एकल और एमयूए (300-3500 हर्ट्ज)। अंत में, पावर स्पेक्ट्रल घनत्व (पीएसडी) विश्लेषण को एचडी-एमईए (आंकड़े 3 जे, के) से दर्ज किए गए परस्पर एचसी और ओबी सर्किट में एक विशिष्ट दोलन बैंड की शक्ति परिमाण को एक साथ निर्धारित करने के लिए नियोजित किया गया था।

मल्टीमॉडल नेटवर्क-वाइड फंक्शनल कनेक्टोम
समवर्ती सक्रिय न्यूरोनल पहनावा के एक साथ फायरिंग पैटर्न से बहुस्तरीय तंत्रिका नेटवर्क की बड़े पैमाने पर कनेक्टिविटी का अनुमान लगाने के लिए, पता चला घटनाओं में सक्रिय इलेक्ट्रोड के जोड़े के बीच पार सहप्रसरण प्रोटोकॉल के कदम 4.2.6 के अनुसार गणना की गई थी. यहाँ, सहसंबंध गुणांक एचसी और ओबी सर्किट में परतों के आधार पर क्रमबद्ध या IPSC नेटवर्क में unsorted और फिर एक सममित मैट्रिक्स में संग्रहीत किया गया था. एचसी और ओबी सर्किटरी के कार्यात्मक कनेक्टोम को बहुभिन्नरूपी ग्रेंजर कार्य-कारण और निर्देशित हस्तांतरण फ़ंक्शन (डीटीएफ) को लागू करके उत्पन्न किया गया था ताकि दूसरे पर एक समय श्रृंखला के प्रभाव को निर्धारित किया जा सके और अलग-अलग नेटवर्क में सहसंबद्ध लिंक के भीतर दिशात्मक सूचना प्रवाह का आकलन किया जा सके। एचसी (चित्रा 4 ए) और ओबी (चित्रा 4 बी) और नेटवर्क विज़ुअलाइज़ेशन के कनेक्टोम मैपिंग को गेफी प्रोग्राम 9.2 संस्करण (https://gephi.org) का उपयोग करके किया गया था। इसी तरह पैरामीटर बाधाओं एचसी और ओबी मस्तिष्क टुकड़ा सर्किट की तुलना करने के लिए कार्यात्मक लिंक पर रखा गया था और पता चला LFP घटनाओं के कार्यात्मक कनेक्टिविटी के 100 एस सचित्र. नोड्स को नोडल रंग के साथ डिग्री ताकत के अनुसार बढ़ाया जाता है जो परत और लिंक रंग को दर्शाता है जो इंट्रा- और इंटर-लेयर कनेक्शन की पहचान करता है। मानव आईपीएससी नेटवर्क के कार्यात्मक कनेक्टोम स्थानिक-लौकिक फिल्टर (एसटीएफ) और दूरी-निर्भर विलंबता थ्रेसहोल्ड (डीडीएलटी) को लागू करके उत्पन्न किए गए थे ताकि महत्वपूर्ण लिंक के चयन को बढ़ाया जा सके और फ़िल्टर्ड और सामान्यीकृत क्रॉस-सहसंबंध हिस्टोग्राम (एफएनसीसीएच) विश्लेषण लागू करके सार्थक कनेक्शन की पहचान को परिष्कृत किया जा सके। पूरे एचडी-एमईए चिप (चित्रा 4 सी) दृश्य Gephi का उपयोग कर प्रदर्शन पर मानव आईपीएससी नेटवर्क के कनेक्टोम मानचित्रण. नोडल रंग उत्तेजक या निरोधात्मक इनपुट को इंगित करता है, और लिंक रंग कनेक्शन की पहचान करता है।

Figure 1
चित्रा 1: बड़े पैमाने पर एचडी-एमईए पर प्रयोगात्मक और कम्प्यूटेशनल प्लेटफॉर्म का अवलोकन। (ए) एचसी, ओबी, और मानव आईपीएससी न्यूरोनल सर्किट और नेटवर्क से तंत्रिका गतिशीलता को पकड़ने के लिए सीएमओएस-आधारित एचडी-एमईए के साथ महसूस किए गए हमारे मल्टीमॉडल बायोहाइब्रिड न्यूरोइलेक्ट्रॉनिक प्लेटफार्मों का आइसोमेट्रिक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) एचसी और ओबी स्लाइस प्राप्त करने के लिए माउस मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया और उसके workscape के लिए योजनाबद्ध कार्यप्रवाह. (सी) पूरे एचसी और ओबी स्लाइस से एक साथ दर्ज किए गए बड़े पैमाने पर फायरिंग पैटर्न के स्थलाकृतिक अभ्यावेदन स्लाइस ऑप्टिकल छवियों के लिए निकाले गए बाह्य तरंगों के साथ आरोपित हैं। (डी)मनुष्यों से प्राप्त आईपीएससी न्यूरोनल नेटवर्क का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ई) एचडी-एमईए चिप (बाएं) पर पूरे मानव न्यूरोनल नेटवर्क के सेलुलर सी-फॉस और दैहिक/डेंड्राइटिक एमएपी -2 दिखाने वाले प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ पूरे औसत फायरिंग गतिविधि मानचित्र (दाएं) के साथ मेल खाते हैं। (एफ) एचडी-एमईए पर बड़े पैमाने पर रिकॉर्डिंग से प्राप्त बहुआयामी तंत्रिका डेटा का विश्लेषण करने के लिए उन्नत डेटा विश्लेषण, कनेक्टिविटी मैपिंग और एआई-मशीन लर्निंग टूल सहित कम्प्यूटेशनल फ्रेमवर्क। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पूर्व विवो मस्तिष्क टुकड़ा और में इन विट्रो मानव IPSC संस्कृति तैयारी और रिकॉर्डिंग कार्यस्थानों के लिए लेआउट. (ए) योजनाबद्ध कार्यप्रवाह एचसी और ओबी स्लाइस तैयार करने के लिए सेटअप illustrating, प्रत्येक कार्यक्षेत्र में आवश्यक उपकरण और उपकरणों की विशेषता. (बी) आवश्यक उपकरण और उपकरणों सहित मानव आईपीएससी संस्कृति की तैयारी के लिए योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। सामग्री की एक पूरी सूची चरण 1.2.2, 2.1, 2.2, 3.1.1, 3.3 और सामग्री की तालिका में शामिल है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: मानचित्रण और नेटवर्क गतिशीलता के spatiotemporal पैटर्न निकालने. (एसी) मतलब LFP और स्पाइक दर स्थानिक नक्शे, पांच मिनट की रिकॉर्डिंग पर गणना, खुर्दबीन प्रकाश छवि पर आरोपित. (डीएफ) रेखापुंज 60-सेकंड डेटा सबसैम्पल में पता लगाए गए, अस्वीकृत एलएफपी घटनाओं को दर्शाते हैं और 20-सेकंड डेटा सबसैंपल में स्पाइक्स करते हैं। (जी-आई) रेखापुंज प्लॉट डेटा सबसैम्पल (रेखापुंज प्लॉट में हाइलाइट किए गए लाल) के 5-सेकंड सेगमेंट से प्रतिनिधि तरंग ट्रेस निष्कर्षण, कच्चे एलएफपी ऑसिलेटरी बैंड (1-100 हर्ट्ज) के रूप में प्रदर्शित; δ (1-4 हर्ट्ज), θ (5-12 हर्ट्ज), β (13-35 हर्ट्ज), और γ (35-100 हर्ट्ज) आवृत्ति बैंड; एसडब्ल्यूआर (140-220 हर्ट्ज); और उच्च आवृत्ति एकल और एमयूए स्पाइकिंग (300-3500 हर्ट्ज)। (जे, के) तेज और धीमी गति से दोलन LFPs (1-100 हर्ट्ज) और SWR (140-220 हर्ट्ज) के पावर वर्णक्रमीय घनत्व मानचित्र। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: मल्टीमॉडल नेटवर्क-वाइड कार्यात्मक कनेक्टोम का संगठन। (ए-सी) नोडल कार्यात्मक कनेक्टिविटी को दर्शाने वाले गेफी मानचित्र, जहां नोड्स उदाहरण रंग बार किंवदंतियों (नीचे) में से एक के अनुरूप हैं, जबकि लिंक (या किनारों) को कनेक्टिंग नोड्स से मेल खाने के लिए छायांकित किया जाता है। (ए) एचसी, (बी) ओबी, और (सी) आईपीएससी परतों के लिए उदाहरण किंवदंतियों को 64 x 64 सरणी पर प्रदर्शित किया जाता है। एचसी और ओबी परतों को 100-एस समय बिन पर प्लॉट किया जाता है ताकि दृश्य उद्देश्यों के लिए दृश्यमान नोड्स और लिंक की संख्या को प्रभावी ढंग से कम किया जा सके। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: आईपीएससी न्यूरोनल संस्कृतियों के लिए मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी और मीडिया के लिए समाधान। (ए) पूर्व विवो मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी के लिए उच्च sucrose काटने समाधान. (बी) पूर्व विवो मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी और रिकॉर्डिंग के लिए एसीएसएफ रिकॉर्डिंग समाधान। (सी-डी) मानव न्यूरोनल आईपीएससी मीडिया प्रोटोकॉल, जहां (सी) ब्रेनफिस पूर्ण मीडिया है जिसका उपयोग सेल विगलन, एचडी-एमईए चिप कोटिंग और सुसंस्कृत एचडी-एमईए रखरखाव के लिए किया जाता है, और (डी) एचडी-एमईए सेल चढ़ाना के लिए उपयोग किया जाने वाला डॉटिंग मीडिया। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: सामान्य HD-MEA रिकॉर्डिंग अधिग्रहण समस्याओं का निवारण करना। सामान्य समस्याओं, उनके संभावित कारणों और एचडी-एमईए चिप्स, रिकॉर्डिंग प्लेटफॉर्म, सिस्टम शोर और सॉफ्टवेयर से संबंधित समस्या निवारण समाधानों की एक सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

स्पैटिओटेम्पोरल न्यूरोनल गतिविधि की जटिल गतिशीलता, परस्पर जुड़े न्यूरोनल पहनावा से उभरती है, लंबे समय से तंत्रिका विज्ञान में साज़िश का विषय रही है। पैच-क्लैंप, मानक एमईए, और सीए2 + इमेजिंग जैसे पारंपरिक तरीकों ने मस्तिष्क की जटिलता में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हालांकि, वे अक्सर व्यापक नेटवर्क-व्यापी कम्प्यूटेशनल गतिशीलता 21,22,23 पर कब्जा करने में कम पड़ जाते हैं। एचडी-एमईए प्लेटफॉर्म का तकनीकी प्रोटोकॉल, जैसा कि इस जोव अध्ययन में विस्तृत है, सेल असेंबली से लेकर विस्तृत नेटवर्क (यानी, तीव्र, पूर्व-विवो माउस मस्तिष्क स्लाइस और इन-विट्रो मानव आईपीएससी नेटवर्क)26,29,30,32तक विभिन्न तौर-तरीकों में तंत्रिका गतिशीलता का मनोरम दृश्य पेश करता है।

तीव्र, पूर्व विवो माउस मस्तिष्क स्लाइस न्यूरोनल अनुसंधान में एक मूलभूत उपकरण किया गया है, आणविक और सर्किट स्तर की जांच 6,7 की सुविधा. हालांकि, ऊतक व्यवहार्यता को बनाए रखने की चुनौती एक लगातार अड़चन रही है। इस अध्ययन में चित्रित प्रोटोकॉल एचडी-एमईए प्लेटफॉर्म पर उनके लाभों का फायदा उठाने के लिए इन स्लाइस की गुणवत्ता और दीर्घायु को अनुकूलित करने के लिए महत्वपूर्ण संशोधनों का परिचय देता है। यह प्रोटोकॉल के महत्व को रेखांकित करता है - i) स्लाइस एकरूपता प्राप्त करना, जिसके लिए एक वाइब्रेटोम का उपयोग ऊतक हेलिकॉप्टर पर इसकी सटीकता और कम से कम ऊतक क्षति के कारण पसंद किया जाता है, लंबे समय तक टुकड़ा करने की क्रिया के व्यापार के बावजूद। ii) ऊतक व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए, निष्कर्षण से रिकॉर्डिंग तक, पूरी प्रक्रिया में निरंतर कार्बोजेनेशन सुनिश्चित करना। iii) तापमान को विनियमित करना और रिकॉर्डिंग से पहले पर्याप्त रिकवरी समय की अनुमति देना। iv) मस्तिष्क को स्थिर करने, फाड़ने से रोकने और गोंद संपर्क को कम करने के लिए एक अगारोज ब्लॉक या मोल्ड का उपयोग करना। v) एचडी-एमईए जलाशय के भीतर कार्बोजेनेटेड एसीएसएफ की इष्टतम प्रवाह दर को बनाए रखना ताकि डिकॉप्लिंग, शोर और बहाव (तालिका 2) जैसे मुद्दों से बचने के दौरान टुकड़ा स्वास्थ्य सुनिश्चित किया जा सके।

माउस मस्तिष्क स्लाइस और मानव आईपीएससी तैयारी दोनों के लिए, इलेक्ट्रोड-ऊतक इंटरफ़ेस युग्मन को बढ़ाना सर्वोपरि 30,46,47है। हमारा प्रोटोकॉल आसंजन-प्रचार अणु पॉली-डीएल-ऑर्निथिन (पीडीएलओ) के उपयोग के महत्व को रेखांकित करता है। यह अणु न केवल विद्युत संकेतों का पता लगाने के लिए सतह क्षेत्र को बढ़ाता है, बल्कि विद्युत चालकताको भी बढ़ाता है। ऐसा करने से, यह सेलुलर आसंजन, विकास और कार्यात्मक नेटवर्क गुणों के विकास को बढ़ावा देता है। इस तरह का अनुकूलन एचडी-एमईए प्लेटफॉर्म की प्रभावकारिता को बढ़ाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह बदले में, सूक्ष्म एक्स-विवो और इन-विट्रो कनेक्टोम और उनके स्थानिक फायरिंग अनुक्रमों का सटीक और सुसंगत विश्लेषण सुनिश्चित करता है। विशेष रूप से, PDLO को न्यूरोनल संस्कृतियों में विद्युत उत्तेजनाओं के लिए सहज फायरिंग गतिविधि और जवाबदेही को बढ़ावा देने में पॉलीथीनमाइन (PEI) और पॉली-एल-ऑर्निथिन (पीएलओ) जैसे अन्य सब्सट्रेट से बेहतर प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, पीडीएलओ एचडी-विदेश मंत्रालय पर सतह functionalization के लिए इस्तेमाल किया गया है और इलेक्ट्रोड टुकड़ा युग्मन इंटरफ़ेस को बढ़ाने और ओबी और एचसी स्लाइस26,29 दोनों में संकेत करने के लिए शोर अनुपात में वृद्धि करने के लिए दिखाया गया है. एक कस्टम-निर्मित प्लैटिनम एंकर के अलावा इलेक्ट्रोड-स्लाइस इंटरफ़ेस युग्मन को और बढ़ाता है, जिससे उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ रिकॉर्डिंग होती है।

पूर्व विवो माउस मस्तिष्क स्लाइस और इन-विट्रो मानव आईपीएससी नेटवर्क दोनों के लिए एचडी-एमईए का उपयोग व्यापक, मल्टीस्केल और मल्टीमॉडल गतिशीलता की खोज में माहिर एक विधि का परिचय देता है। यह अभिनव दृष्टिकोण, तथापि, सामने काफी चुनौतियों लाता है, विशेष रूप से डेटा प्रबंधन 48,49,50,51 में. 18 kHz/इलेक्ट्रोड सैंपलिंग फ़्रीक्वेंसी पर प्राप्त एक एकल HD-MEA रिकॉर्डिंग एक चौंका देने वाला 155 MB/s डेटा उत्पन्न करती है। डेटा वॉल्यूम तेजी से बढ़ता है जब कई स्लाइस, विविध औषधीय स्थितियों, या लंबे समय तक रिकॉर्डिंग अवधि में फैक्टरिंग। सूचना का ऐसा प्रवाह सुव्यवस्थित प्रसंस्करण के लिए मजबूत भंडारण अवसंरचना और उन्नत कम्प्यूटेशनल उपकरणों की मांग करता है। एचडी-एमईए प्लेटफॉर्म की क्षमता एक साथ हजारों न्यूरोनल पहनावा से डेटा इकट्ठा करने के लिए एक वरदान और बाधा दोनों है। यह मस्तिष्क कार्यों की कम्प्यूटेशनल गतिशीलता में सर्वोच्च अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, फिर भी इसे एक परिष्कृत विश्लेषणात्मक ढांचे की भी आवश्यकता होती है। इस जोव प्रोटोकॉल में, हमने कम्प्यूटेशनल रणनीतियों के उदाहरण प्रदान किए हैं, जिनमें बड़े पैमाने पर घटना का पता लगाने, वर्गीकरण, ग्राफ सिद्धांत, आवृत्ति विश्लेषण और मशीन लर्निंग शामिल हैं। ये विधियां जटिल तंत्रिका डेटा के विश्लेषण की चुनौतियों से निपटने के लिए किए गए गहन प्रयासों को रेखांकित करती हैं। बहरहाल, इन बहुआयामी तंत्रिका डेटासेट का विश्लेषण करने के लिए अधिक उन्नत कम्प्यूटेशनल टूल के विकास के लिए अभी भी काफी जगह है। उपयुक्त उपकरणों और पद्धतियों के साथ सशस्त्र, एचडी-एमईए प्लेटफॉर्म की क्षमता को बढ़ाया जाता है, जो स्वस्थ और रोग दोनों स्थितियों में मस्तिष्क कार्यों की पेचीदगियों में गहन अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

संक्षेप में, एचडी-एमईए प्लेटफॉर्म, जब विस्तृत प्रोटोकॉल और कम्प्यूटेशनल टूल के साथ एकीकृत किया जाता है, तो मस्तिष्क के जटिल कामकाज को समझने के लिए एक परिवर्तनकारी दृष्टिकोण प्रदान करता है। बड़े पैमाने पर, मल्टीस्केल और मल्टीमॉडल डायनेमिक्स को कैप्चर करके, यह सीखने, मेमोरी और सूचना प्रसंस्करण जैसी प्रक्रियाओं में अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इसके अलावा, इन-विट्रो मानव आईपीएससी नेटवर्क में इसके आवेदन में दवा स्क्रीनिंग और व्यक्तिगत दवा में क्रांति लाने की क्षमता है। हालांकि, जबकि यह मंच तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है, अंतर्निहित तकनीकी चुनौतियों को स्वीकार करना और उनका समाधान करना महत्वपूर्ण है। चल रहे शोधन और उन्नत कम्प्यूटेशनल उपकरणों के एकीकरण के साथ, एचडी-एमईए प्लेटफॉर्म सटीक नैदानिक उपकरणों, विशिष्ट बायोमार्कर की पहचान और न्यूरोलॉजिकल विकारों के लिए लक्षित उपचारों के एक नए युग की शुरुआत करने के लिए तैयार है।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी या वित्तीय हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस अध्ययन को संस्थागत धन (DZNE), हेल्महोल्ट्ज़ वैलिडेशन फंड (HVF-0102) के भीतर हेल्महोल्ट्ज़ एसोसिएशन और बायोमेडिसिन एंड बायोइंजिनियरिंग (DIGS-BB) के लिए ड्रेसडेन इंटरनेशनल ग्रेजुएट स्कूल द्वारा समर्थित किया गया था। हम उनके समर्थन के लिए DZNE-Dresden (अलेक्जेंडर गार्थे, ऐनी कारासिंस्की, सैंड्रा गुंथर और जेन्स बर्गमैन) में व्यवहार पशु परीक्षण के लिए मंच को भी स्वीकार करना चाहेंगे। हम यह स्वीकार करना चाहेंगे कि चित्र 1 का एक हिस्सा प्लेटफॉर्म BioRender.com का उपयोग करके बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
150 mm Glass Petri Dish generic generic Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
0.22 μm Sterile Filter Unit  Assorted Assorted Assorted
90 mm Plastic Culture Dish TPP 93100 Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Agarose Roth 6351.5 Brain Preparation Workspace
Agarose Mold CUSTOM CUSTOM Brain Preparation Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request
Aluminum Foil generic generic Brain Extraction Workspace
Anesthesia chamber generic generic Brain Extraction Workspace; Assorted Beaker, Bedding etc
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A4544-25G Solution Preparation Workspace
Assorted Beakers generic generic Solution Preparation Workspace; 50 mL
Assorted Luers Cole Parmer 45511-00 Brain Slice Recording Workspace
Assorted Volumetric flasks generic generic Solution Preparation Workspace; 500 mL, 1 L
B27 Supplement Life Technologies 17504-044 BrainXell Commercial Supplier Protocol
BDNF Peprotech 450-02 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Biological Safety Cabinet with UV Lamp Assorted Assorted HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace
BrainPhys Neuronal Medium  STEMCELL Technologies  05790  CDI, and BrainXell Commerical Supplier Protocol
Brainwave Software 3Brain AG Version 4 Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace
BrainXell Glutamatergic Neuron Assay  BrainXell  BX-0300  BrainXell Commercial Supplier Protocol
CaCl2 Sigma Aldrich 21115-100ML Solution Preparation Workspace
Carbogen generic generic All Workspaces; 95%/5% O2 and CO2 mixture
Cell Culture Incubator  Assorted Assorted Assorted
CMOS-based HD-MEA chip 3Brain AG CUSTOM Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace
Conical Tubes, 50 mL, Falcon (Centrifuge Tubes)  STEMCELL Technologies  38010  CDI Commerical Supplier Protocol
Crocodile Clip Grounding Cables JWQIDI B06WGZG17W Brain Slice Recording Workspace
Curved Forceps FST 11052-10 Brain Extraction Workspace
DMEM/F12 Medium Life Technologies  11330-032 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) STEMCELL Technologies  37350  CDI Commerical Supplier Protocol
Filter Paper Macherey-Nagel 531 011 Brain Preparation Workspace
Fine Brush Leonhardy 773 Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Forceps VITLAB 67895 Brain Slice Recording Workspace
GDNF Peprotech 450-10 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Geltrex Life Technologies A1413201 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Glass pasteur pipette Roth 4518 Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Glucose Sigma Aldrich G7021-1KG Solution Preparation Workspace
GlutaMAX Life Technologies 35050-061 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Gravity-based Perfusion System ALA VC3-8xG Brain Slice Recording Workspace
HD-MEA Recording platform 3Brain AG CUSTOM Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace
Heater Warner Instruments TC-324C Brain Slice Recording Workspace
Hemocytometer or Automated Cell Counter Assorted Assorted HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace
Hypo Needles Warner Instruments 641489 Brain Slice Recording Workspace
iCell GlutaNeurons Kit, 01279  CDI R1061  CDI Commerical Supplier Protocol
Iris Scissors Vantage V95-304 Brain Extraction Workspace
Isoflurane Baxter HDG9623 Brain Extraction Workspace
KCl Sigma Aldrich P5405-250G Solution Preparation Workspace
Laminin  Sigma-Aldrich  L2020  CDI Commerical Supplier Protocol
Liquid Nitrogen Storage Unit  Assorted Assorted HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace
Magnetic Stirrer generic generic Solution Preparation Workspace
Metal Screws Thorlabs HW-KIT2/M Brain Slice Recording Workspace
MgCl2 Sigma Aldrich M1028-100ML Solution Preparation Workspace
MgSO4 Sigma Aldrich 63138-250G Solution Preparation Workspace
Microdissection Tool Holder  Braun 4606108V Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Microdissection Tool Needle Braun  9186166 Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Modular Stereomicroscope Leica CUSTOM Brain Slice Recording Workspace; custom specifications and modifications
N2 Supplement Life Technologies 17502-048 CDI, and BrainXell Commercial Supplier Protocol
NaCl Sigma Aldrich S3014-1KG Solution Preparation Workspace
NaH2PO4 Sigma Aldrich S0751-100G Solution Preparation Workspace
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761-500G Solution Preparation Workspace
Neurobasal Medium  Life Technologies 21103-049 BrainXell Commercial Supplier Protocol
Optical Cage System Thorlabs Assorted Brain Slice Recording Workspace
Optical Table w/Breadboard Thorlabs SDA7590 Brain Slice Recording Workspace
PDLO Sigma Aldrich P0671 HD-MEA Coating, Brain Slice Recording Workspace
Penicillin-streptomycin, 100x  Thermo Fisher Scientific  15140-122  CDI Commerical Supplier Protocol
Pipette tips TipONE S1120-8810 Brain Slice Recording Workspace
Pipettors  Assorted Assorted Assorted
Platinum Anchor CUSTOM CUSTOM Brain Slice Recording Workspace
Polyethylene Tubing Assorted Assorted Brain Slice Recording Workspace
Pump MasterFlex 78018-22 Brain Slice Recording Workspace
Razor Blade Apollo 10179960 Brain Preparation Workspace
Reference Electrode Cell Culture Cap CUSTOM CUSTOM Human iPSC Recording Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request
Rubber Pipette Bulb Duran Wheaton Kimble 292000205 Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace
Serological Pipettes, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL Assorted Assorted Assorted
Slice Recovery Chamber CUSTOM CUSTOM Brain Slice Recovery Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request
Spatula ISOLAB 047.06.150 Brain Preparation Workspace
Sucrose Sigma Aldrich 84100-1KG Solution Preparation Workspace
Super Glue UHU 358221 Brain Slice Preparation Workspace
Surgical Scissors Peters Instruments BC 344 Brain Extraction Workspace
Tabletop Centrifuge  Assorted Assorted Assorted
TGF-β1 Peprotech 100-21C BrainXell Commercial Supplier Protocol
Tissue Paper generic generic Brain Extraction Workspace
Trypan Blue STEMCELL Technologies  07050  CDI Commerical Supplier Protocol
Upright Microscope Olympus CUSTOM Imaging Workspace; Custom specifications and modifications
Vacusip Integra 159010 Brain Slice Recording Workspace
Vibratome Leica VT1200s Brain Slice Preparation Workspace; Includes: Specimen plate, buffer tray, ice tray, specimen plate holding tool, vibratome blade adjusting tool
Vibratome Blade Personna N/A Brain Slice Preparation Workspace
Water Bath Lauda L000595 Brain Slice Recovery Workspace

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References

  1. Hebb, D. O. The Organization of Behavior; A Neuropsychological Theory. , Wiley. New York. (1949).
  2. Cossart, R., Garel, S. Step by step: cells with multiple functions in cortical circuit assembly. Nat Rev Neurosci. 23, 395-410 (2022).
  3. Carrillo-Reid, L., Yuste, R. Playing the piano with the cortex: role of neuronal ensembles and pattern completion in perception and behavior. Curr Opin Neurobiol. 64, 89-95 (2020).
  4. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7, 446-451 (2004).
  5. Buzsáki, G. Neural Syntax: Cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68 (3), 362-385 (2010).
  6. Huang, Y., Williams, J. C., Johnson, S. M. Brain slice on a chip: opportunities and challenges of applying microfluidic technology to intact tissues. Lab Chip. 12 (12), 2103-2117 (2012).
  7. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
  8. Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
  9. Anderson, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, L. The Hippocampus Book. , Oxford University Press. New York. (2006).
  10. Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nat Neurosci. 20, 1434-1447 (2017).
  11. Mori, K., Nagao, H., Yoshihara, Y. The olfactory bulb: Coding and processing of odor molecule information. Science. 286 (5440), 711-715 (1999).
  12. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: A molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  13. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  14. Kempermann, G. Why new neurons? Possible functions for adult hippocampal neurogenesis. J Neurosci. 23 (3), 635-638 (2003).
  15. Aimone, J. B., Wiles, J., Gage, F. H. Computational influence of adult neurogenesis on memory encoding. Neuron. 61 (2), 187-202 (2009).
  16. Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 7, 697-709 (2006).
  17. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  18. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
  19. Rajamohan, D., et al. Current status of drug screening and disease modelling in human pluripotent stem cells. Bioessays. 35 (3), 281-298 (2013).
  20. Heilker, R., Traub, S., Reinhardt, P., Schöler, H. R., Sterneckert, J. iPS cell derived neuronal cells for drug discovery. Trends Pharmacol Sci. 35 (10), 510-519 (2014).
  21. Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Vis Exp. (186), e64265 (2022).
  22. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: A limitation of patch-clamp recording. Annu Rev Physiol. 59, 621-631 (1997).
  23. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protoc. 2 (2), 100442 (2021).
  24. Lee, C. H., Park, Y. K., Lee, K. Recent strategies for neural dynamics observation at a larger scale and wider scope. Biosens Bioelectron. 240, 115638 (2023).
  25. Urai, A. E., Doiron, B., Leifer, A. M., Churchland, A. K. Large-scale neural recordings call for new insights to link brain and behavior. Nat Neurosci. 25 (1), 11-19 (2022).
  26. Hu, X., Khanzada, S., Klütsch, D., Calegari, F., Amin, H. Implementation of biohybrid olfactory bulb on a high-density CMOS-chip to reveal large-scale spatiotemporal circuit information. Biosens Bioelectron. 198, 113834 (2022).
  27. Amin, H., Marinaro, F., Tonelli, D. D. P., Berdondini, L. Developmental excitatory-to-inhibitory GABA-polarity switch is disrupted in 22q11.2 deletion syndrome: A potential target for clinical therapeutics. Sci Rep. 7 (1), 15752 (2017).
  28. Amin, H., Nieus, T., Lonardoni, D., Maccione, A., Berdondini, L. High-resolution bioelectrical imaging of Aβ-induced network dysfunction on CMOS-MEAs for neurotoxicity and rescue studies. Sci Rep. 7 (1), 2460 (2017).
  29. Emery, B. A., Hu, X., Khanzada, S., Kempermann, G., Amin, H. High-resolution CMOS-based biosensor for assessing hippocampal circuit dynamics in experience-dependent plasticity. Biosens Bioelectron. 237, 115471 (2023).
  30. Amin, H., et al. Electrical responses and spontaneous activity of human iPS-derived neuronal networks characterized for 3-month culture with 4096-electrode arrays. Front Neurosci. 10, 121 (2016).
  31. Lonardoni, D., et al. Recurrently connected and localized neuronal communities initiate coordinated spontaneous activity in neuronal networks. PLoS Comput Biol. 13 (7), e1005672 (2017).
  32. Emery, B. A., et al. Large-scale multimodal recordings on a high-density neurochip: Olfactory bulb and hippocampal networks. 2022 44th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine & Biology Society (EMBC). , Glasgow, Scotland, United Kingdom. 3111-3114 (2022).
  33. Rossi, L., Emery, B. A., Khanzada, S., Hu, X., Amin, H. Pharmacologically and electrically-induced network-wide activation of olfactory bulb with large-scale biosensor. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  34. Emery, B. A., et al. Recording network-based synaptic transmission and LTP in the hippocampal network on a large-scale biosensor. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  35. Hierlemann, A., Frey, U., Hafizovic, S., Heer, F. Growing cells atop microelectronic chips: Interfacing electrogenic cells in vitro with CMOS-based microelectrode arrays). Proceedings of the IEEE. 99 (2), 252-284 (2011).
  36. Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab Chip. 9, 2644-2651 (2009).
  37. Siegle, J. H., Hale, G. J., Newman, J. P., Voigts, J. Neural ensemble communities: open-source approaches to hardware for large-scale electrophysiology. Curr Opin Neurobiol. 32, 53-59 (2015).
  38. Amin, H., Maccione, A., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. High-density MEAs reveal lognormal firing patterns in neuronal networks for short and long term recordings. 2015 7th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering (NER). , Montpellier, France. 1000-1003 (2015).
  39. Altuntac, E., et al. Bottom-up neurogenic-inspired computational model. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
  40. Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. J Neurosci Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
  41. Welch, P. D. The use of fast Fourier transform for the estimation of power spectra: A method based on time averaging over short, modified periodograms. IEEE Transactions on Audio and Electroacoustics. 15 (2), 70-73 (1967).
  42. Eggermont, J. J., Munguia, R., Pienkowski, M., Shaw, G. Comparison of LFP-based and spike-based spectro-temporal receptive fields and cross-correlation in cat primary auditory cortex. PLoS One. 6 (5), e20046 (2011).
  43. Damos, P. Using multivariate cross correlations, Granger causality and graphical models to quantify spatiotemporal synchronization and causality between pest populations. BMC Ecol. 16, 33 (2016).
  44. Kaminski, M. J., Blinowska, K. J. A new method of the description of the information flow in the brain structures. Biol Cybern. 65, 203-210 (1991).
  45. Pastore, V. P., Massobrio, P., Godjoski, A., Martinoia, S. Identification of excitatory-inhibitory links and network topology in large-scale neuronal assemblies from multi-electrode recordings. PLoS Comput Biol. 14 (8), e1006381 (2018).
  46. Amin, H., Dipalo, M., De Angelis, F., Berdondini, L. Biofunctionalized 3D nanopillar arrays fostering cell guidance and promoting synapse stability and neuronal activity in networks. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (17), 15207-15215 (2018).
  47. Woeppel, K., Yang, Q., Cui, X. T. Recent advances in neural electrode-tissue interfaces. Curr Opin Biomed Eng. 4, 21-31 (2017).
  48. Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Curr Opin Neurobiol. 50, 92-100 (2018).
  49. Siegle, J. H., Hale, G. J., Newman, J. P., Voigts, J. Neural ensemble communities: open-source approaches to hardware for large-scale electrophysiology. Curr Opin Neurobiol. 32, 53-59 (2015).
  50. Freeman, J. Open source tools for large-scale neuroscience. Curr Opin Neurobiol. 32, 156-163 (2015).
  51. Stevenson, I. H., Kording, K. P. How advances in neural recording affect data analysis. Nat Neurosci. 14 (2), 139-142 (2011).

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Emery, B. A., Khanzada, S., Hu, X., Klütsch, D., Amin, H. Recording and Analyzing Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics on CMOS-Integrated High-Density Microelectrode Array. J. Vis. Exp. (205), e66473, doi:10.3791/66473 (2024).

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