Summary
Här använder vi HD-MEA för att fördjupa oss i beräkningsdynamik för storskaliga neuronala ensembler, särskilt i hippocampus, luktbulbkretsar och mänskliga neuronala nätverk. Att fånga spatiotemporal aktivitet, i kombination med beräkningsverktyg, ger insikter i neuronal ensemblekomplexitet. Metoden ökar förståelsen för hjärnans funktioner och kan potentiellt identifiera biomarkörer och behandlingar för neurologiska sjukdomar.
Abstract
Storskaliga neuronala nätverk och deras komplexa distribuerade mikrokretsar är viktiga för att generera perception, kognition och beteende som uppstår från mönster av spatiotemporal neuronal aktivitet. Dessa dynamiska mönster som uppstår från funktionella grupper av sammankopplade neuronala ensembler underlättar exakta beräkningar för bearbetning och kodning av neural information i flera skalor, vilket driver högre hjärnfunktioner. För att undersöka beräkningsprinciperna för neural dynamik som ligger till grund för denna komplexitet och undersöka den flerskaliga effekten av biologiska processer i hälsa och sjukdom, har storskaliga samtidiga inspelningar blivit avgörande. Här används en mikroelektrod med hög densitet (HD-MEA) för att studera två modaliteter av neural dynamik - hippocampus- och luktbulbkretsar från ex-vivo mushjärnskivor och neuronala nätverk från in-vitro cellkulturer av humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). HD-MEA-plattformen, med 4096 mikroelektroder, möjliggör icke-invasiva, etikettfria inspelningar av extracellulära avfyrningsmönster från tusentals neuronala ensembler samtidigt med hög spatiotemporal upplösning. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att karakterisera flera elektrofysiologiska nätverksomfattande egenskaper, inklusive spikaktivitetsmönster med en eller flera enheter och lokala fältpotentialsvängningar. För att granska dessa flerdimensionella neurala data har vi utvecklat flera beräkningsverktyg som innehåller maskininlärningsalgoritmer, automatisk händelsedetektering och klassificering, grafteori och andra avancerade analyser. Genom att komplettera dessa beräkningspipelines med denna plattform tillhandahåller vi en metodik för att studera den stora, flerskaliga och multimodala dynamiken från cellsammansättningar till nätverk. Detta kan potentiellt öka vår förståelse för komplexa hjärnfunktioner och kognitiva processer i hälsa och sjukdom. Engagemang för öppen vetenskap och insikter i storskalig beräkningsneural dynamik kan förbättra hjärninspirerad modellering, neuromorfisk databehandling och neurala inlärningsalgoritmer. Att förstå de underliggande mekanismerna för försämrade storskaliga neurala beräkningar och deras sammankopplade mikrokretsdynamik kan dessutom leda till identifiering av specifika biomarkörer, vilket banar väg för mer exakta diagnostiska verktyg och riktade terapier för neurologiska sjukdomar.
Introduction
Neuronala ensembler, ofta kallade cellsammansättningar, är centrala i neural kodning, vilket underlättar intrikata beräkningar för bearbetning av flerskalig neural information 1,2,3. Dessa ensembler ligger till grund för bildandet av expansiva neuronala nätverk och deras nyanserade mikrokretsar4. Sådana nätverk och deras oscillerande mönster driver avancerade hjärnfunktioner, inklusive perception och kognition. Även om omfattande forskning har utforskat specifika neuronala typer och synaptiska vägar, är en djupare förståelse för hur neuroner tillsammans bildar cellsammansättningar och påverkar spatiotemporal informationsbehandling över kretsar och nätverk fortfarande svårfångad5.
Akuta, ex-vivo hjärnskivor är avgörande elektrofysiologiska verktyg för att studera intakta neurala kretsar, och erbjuder en kontrollerad miljö för att undersöka oscillerande aktivitetsmönster för neural funktion, synaptisk överföring och anslutning, med implikationer i farmakologisk testning och sjukdomsmodellering 6,7,8. Detta studieprotokoll belyser två viktiga hjärnkretsar - den hippocampus-kortikala (HC) som är involverad i inlärnings- och minnesprocesser 9,10, och luktbulben (OB) som är ansvarig för luktdiskriminering 11,12,13. I dessa två regioner genereras nya funktionella neuroner kontinuerligt av vuxen neurogenes under hela livet i däggdjurshjärnor14. Båda kretsarna uppvisar flerdimensionella dynamiska neurala aktivitetsmönster och inneboende plasticitet som deltar i omkoppling av det befintliga neurala nätverket och underlättar alternativa informationsbehandlingsstrategier vid behov15,16.
Akuta, ex-vivo hjärnsnittsmodeller är oumbärliga för att fördjupa sig i hjärnans funktionalitet och förstå sjukdomsmekanismer på mikrokretsnivå. In vitro-cellkulturer som härrör från humant inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) neuronala nätverk erbjuder dock en lovande väg för translationell forskning, som sömlöst kopplar samman resultat från djurförsök med potentiell klinisk behandlingpå människor 17,18. Dessa människocentrerade in vitro-analyser fungerar som en tillförlitlig plattform för att bedöma farmakologisk toxicitet, möjliggöra exakt läkemedelsscreening och främja forskning om innovativa cellbaserade terapeutiska strategier19,20. Med tanke på den centrala rollen för iPSC:s neuronala modell har vi dedikerat den tredje modulen i denna protokollstudie för att grundligt undersöka de funktionella egenskaperna hos dess härledda nätverk och för att finjustera de associerade cellodlingsprotokollen.
Dessa elektrogena neurala moduler har ofta studerats med hjälp av tekniker som kalcium (Ca2+-avbildning), patch-clamp-inspelningar och mikroelektrodmatriser med låg densitet (LD-MEA). Medan Ca2+-avbildning erbjuder kartläggning av encellsaktivitet, är det en cellmärkningsbaserad metod som hindras av dess låga tidsupplösning och utmaningar vid långtidsinspelningar. LD-MEA saknar rumslig precision, medan patch-clamp, som är en invasiv teknik på en enda plats och mödosam, ofta ger en låg framgångsfrekvens 21,22,23. För att ta itu med dessa utmaningar och effektivt undersöka nätverksomfattande aktivitet har storskaliga samtidiga neurala inspelningar dykt upp som ett centralt tillvägagångssätt för att förstå beräkningsprinciperna för neural dynamik som ligger till grund för hjärnans komplexitet och deras konsekvenser för hälsa och sjukdom24,25.
I detta JoVE-protokoll demonstrerar vi en storskalig neural inspelningsmetod baserad på högdensitets-MEA (HD-MEA) för att fånga spatiotemporal neuronal aktivitet över olika hjärnmodaliteter, inklusive hippocampus- och luktbulbkretsar från ex-vivo mushjärna akuta skivor (Figur 1A-C) och in-vitro humana iPSC-härledda neuronala nätverk (Figur 1D-E), tidigare rapporterad av vår grupp och andra kollegor26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. HD-MEA, som bygger på CMOS-teknik (Complementary Metal-oxide-Semiconductor), har kretsar och förstärkning på chipet, vilket möjliggör inspelningar under millisekunder över en 7 mm2 arraystorlek36. Detta icke-invasiva tillvägagångssätt fångar multi-site, etikettfria extracellulära avfyrningsmönster från tusentals neuronala ensembler samtidigt med hjälp av 4096 mikroelektroder med en hög spatiotemporal upplösning, vilket avslöjar den intrikata dynamiken hos lokala fältpotentialer (LFP) och multiunit spiking activity (MUA)26,29.
Med tanke på omfattningen av de data som genereras av denna metod är det nödvändigt med en sofistikerad analytisk ram, men den medför utmaningar37. Vi har utvecklat beräkningsverktyg som omfattar automatisk händelsedetektering, klassificering, grafteori, maskininlärning och andra avancerade tekniker (Figur 1F)26,29,38,39. Genom att integrera HD-MEA med dessa analysverktyg utformas ett holistiskt tillvägagångssätt för att undersöka den intrikata dynamiken från enskilda cellsammansättningar till bredare neurala nätverk över olika neurala modaliteter. Detta kombinerade tillvägagångssätt fördjupar vårt grepp om beräkningsdynamiken i normala hjärnfunktioner och ger insikter om anomalier som finns i patologiska tillstånd28. Dessutom kan insikter från detta tillvägagångssätt driva framsteg inom hjärninspirerad modellering, neuromorfisk databehandling och neurala inlärningsalgoritmer. I slutändan är denna metod lovande när det gäller att avslöja kärnmekanismerna bakom neurala nätverksstörningar, potentiellt identifiera biomarkörer och vägleda skapandet av exakta diagnostiska verktyg och riktade behandlingar för neurologiska tillstånd.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med gällande europeiska och nationella bestämmelser (Tierschutzgesetz) och godkändes av den lokala myndigheten (Landesdirektion Sachsen; 25-5131/476/14).
1. Ex-vivo hjärnskivor från hippocampus-kortikala och luktbulbkretsar på HD-MEA
- Beredning av experimentella lösningar för skärning och registrering (figur 2A)
- På försöksdagen bereds 0,5 l lösning för skärning med hög sackaroshalt och 1 l registreringslösning för konstgjord cerebrospinalvätska (aCSF) (tabell 1A,B).
- Tillsätt alla fasta kemikalier till en torr mätkolv och fyll sedan en del av vägen med dubbeldestillerat (dd) vatten.
- Tillsätt MgCl2 och CaCl2 från 1 M stamlösningar och fyll sedan återstoden med dd vatten. Börja hela tiden röra om med en magnetomrörare tills synliga fasta ämnen har lösts upp ~5 min.
- Använd en fryspunktsosmometer för att validera osmolariteten mellan 350–360 mOsm för skärlösningen med hög sackaros och 315–325 mOsm för aCSF-registreringslösningen.
- Använd en pH-mätare för att validera pH-värdet mellan 7,3-7,4 för skärlösningen med hög sackaros och 7,25-7,35 för aCSF-registreringslösningen. Börja kontinuerligt bubbla med 95 % O2 och 5 % CO2 %.
- Lägg den sackarosrika skärlösningen på is i minst 30 minuter före skivning och börja bubbla kontinuerligt med 95 %O2 och 5 % CO2.
- Efter 10 minuters karbogenering, fyll en 50 ml bägare med 30 ml skärlösning och förvara den i frysen (-20 °C) i 20-30 min eller tills den är delvis frusen.
OBS: Alla lösningar ska beredas färska för varje experiment. Dd-vattnet som används här är autoklaverat ultrarent vatten som lagras vid rumstemperatur (RT). Mängden lösning som bereds bör skräddarsys för den specifika studiefrågan.
- På försöksdagen bereds 0,5 l lösning för skärning med hög sackaroshalt och 1 l registreringslösning för konstgjord cerebrospinalvätska (aCSF) (tabell 1A,B).
- Förberedelse av arbetsytor för hjärnsnitt (Figur 2A)
- Ta med djuret in i försöksrummet.
OBS: I detta protokoll användes C57BL/J6 honmöss i åldern 8-16 veckor som tidigare beskrivits 26,29,32. Djuret bör tillåtas acklimatisera sig i minst 30 minuter efter transport. Långväga överföringar (dvs. mellan institut) bör undvikas samma dag som experimentet. Djurets ålder, kön och stam måste bestämmas utifrån den specifika studiefrågan. - Medan djuret acklimatiserar sig och lösningen med hög sackaroshalt svalnar, placera de nödvändiga verktygen på varje anvisad arbetsyta (se materialförteckning).
- Förbereda arbetsytan för återställning och underhåll av hjärnsegment. Fyll uppsamlingskammaren med carbogenated aCSF-registreringslösning och placera kammaren i vattenbadet inställt på 32 °C. Upprätthåll kontinuerlig karbogenering under hela experimentet.
- Förbered arbetsytan för förberedelse av hjärnsegment. Ställ in vibratomen - placera bladet i vibratombladshållaren och kalibrera vibratomen till rätt inställningar (bladhastighet: 0,20 mm/s, höjdamplitud: 95 μm, bladvinkel: 45°). Fyll vibratomisbrickan med is och buffertbrickan med en skärlösning med hög sackaros och börja karbogenera lösningen i buffertbrickan.
- Förbered arbetsytan för hjärnförberedelse. Fyll petriskålen i glas med 150 mm is och placera en odlingsskål i plast med 90 mm plastform. Fyll plastodlingsskålen med en skärlösning med hög sackaroshalt och börja karbogenera. Tillsätt en droppe superlim på den kylda provplattan och fäst agarosformen.
OBS: Agarosmögel bereds minst dagen innan med 3% agaros i vatten i en anpassad mushjärnform. - Slutligen förbereder du arbetsytan för hjärnextraktion. Täck aluminiumfolie med silkespapper, hämta en 50 ml bägare med högsackarosskärande lösningsslush och tillsätt isofluran i anestesikammaren.
OBS: Anestesi kommer att läggas till anestesikammaren ~1 min före djurplacering. En 50 ml bägare med 30 ml slush med sackaroshalt kommer att tas bort från -20 °C frys ~2 minuter före halshuggning.
- Ta med djuret in i försöksrummet.
- Extraktion och skivning av mushjärna
OBS: Hela denna procedur bör utföras så snabbt som möjligt för att undvika syrebrist till hjärnan. Avlägsnande av hjärnan bör bara ta 1-2 minuter från halshuggning till nedsänkning i den sackarosrika skärlösningen.- Bedöva djuret med lämplig dos av isofluran (0,5 ml/1 l anestesikammare). Bestäm anestesidjupet genom en tassnypning; Bekräfta att det inte finns någon tasstillbakadragande reflex innan du fortsätter.
- Överför djuret till silkespappret i hjärnextraktionsarbetsytan och halshugg det med en kirurgisk sax.
- Sätt in irissaxen i hjärnstammen och håll bottensaxen i jämnhöjd med calvaria. Skär längs den sagittala suturen tills den koronala suturen nås. Placera irissaxen i ögonhålorna och klipp igenom den metopiska suturen. Använd en böjd pincett för att flytta ner sidorna av calvaria och exponera hela hjärnan.
OBS: Var försiktig med både irissaxen och pincetten så att du inte punkterar hjärnan när du klipper igenom suturerna. - Skjut in hjärnan med den trubbiga kanten på den böjda pincetten i 50 ml-bägaren med 30 ml slush med sackaros. Låt stå i 1 min.
- Överför hjärnan till den 90 mm tjocka plastodlingsskålen med kyld karbogenerad skärlösning i arbetsytan för hjärnpreparering. Orientera hjärnan för positionering i agarosformen.
- Tillsätt en liten klick superlim i den rostrala änden av agarosformen. Placera hjärnan i formen med spateln. Se till att hjärnan placeras med ryggsidan nedåt för horisontell skivning.
OBS: Limmets placering i formen kommer att ändras beroende på intresseområdet (ROI). För skivor i hippocampus-kortikal (HC) och luktbulb (OB), se till att OB är stabiliserad och att hjärnans sidor förblir fria från lim. För mycket lim kommer att påverka skivningskvaliteten och orsaka revor under vibratomskivning. - Flytta provplattan in i buffertbrickan, flytta bladet på plats med rätt vinkel och öka buffertbrickans höjd för att föra bladet så nära hjärnan som möjligt.
- Skiva med 0,20 mm/s hastighet 300 μm intervall av HC- och OB-vävnader och samla sedan upp dem efter varje skivningsomgång med en Pasteur-pipett av glas.
- Låt skivorna ligga i den aCSF-fyllda återvinningskammaren i ett 32 °C vattenbad i 45 minuter, följt av 1 timme vid RT. Se till att skivorna inte överlappar varandra och att de är helt exponerade för den karbogenerade lösningen.
OBS: Var noga med att upprätthålla kontinuerlig karbogenering av alla lösningar och alla kammare som nämns som innehåller lösningen. En tryckregulator kan användas för att upprätthålla konsekvent karbogenering.
2. In vitro humant iPSC-baserat neuronalt nätverk på HD-MEA
OBS: Alla iPSC-neuroner som används i denna studie är kommersiellt erhållna (se materialförteckning). Dessa humana celler skilde sig från stabila iPS-cellinjer som härrörde från humant perifert blod eller fibroblaster.
- Beläggning av HD-MEA-chip för humana iPSC-cellkulturer in vitro (figur 2B)
- Placera HD-MEA-chippet på registreringsplattformen, fyll behållaren med PBS och testa chipet före beläggning. Starta programvaran Brainwave. Välj Arkiv > Ny inspelningssession. Ställ in inspelningsparametrarna så att de har en inspelningsfrekvens på 50 Hz och en samplingsfrekvens på 18 kHz/elektrod. Ändra Amplifier Offset för att kalibrera chipet. Se tabell 2 för felsökningstips.
OBS: Parametrarna för inspelningsfrekvens och samplingsfrekvens beror på datatyp och individuella systemkrav. - Sterilisera och förkonditionera HD-MEA.
- Torka av chipet och glasringen under huven med en vävnad fuktad med 96 % etanol (EtOH), placera sedan varje enhet i en steril petriskål på 100 x 20 mm och fyll MEA-behållaren med 70 % EtOH i 20 minuter.
- Aspirera EtOH och tvätta behållaren med sterilt, filtrerat dd-vatten 3 gånger. Tillsätt 1 ml förkonditioneringsmedium och inkubera över natten vid 37 °C och 5 % CO2 .
OBS: Förkonditioneringsmedia måste vara en saltbaserad lösning för att göra HD-MEA-ytan mer hydrofil. Detta kan inkludera tidigare preparerade BrainPhys (BP) kompletta medier (inte >3 månader gamla) (tabell 1C).
- Päls HD-MEA. Nästa dag, aspirera förkonditioneringsmedia. Tillsätt 1 ml 0,1 mg/ml poly-dl-ornitin (PDLO) för att täcka hela det aktiva området. Inkubera vid 37 °C över natten i en inkubator.
- Förbered och värm media till RT. Protokollen här utnyttjar funktionella humana iPSC-neuroner från två kommersiella källor; Således varierar mediakomponenterna för varje leverantör. Ett protokoll beskrivs i (tabell 1C, D).
- Aspirera PDLO, tvätta 3 gånger med dd-vatten och låt chipsen torka under huven i 10 min.
- Fyll en 35 mm x 10 mm petriskål med sterilt, filtrerat dd-vatten och placera den bredvid chipset för att bibehålla rätt fuktighet och undvika avdunstning av de sådda cellerna i nästa steg.
- Placera HD-MEA-chippet på registreringsplattformen, fyll behållaren med PBS och testa chipet före beläggning. Starta programvaran Brainwave. Välj Arkiv > Ny inspelningssession. Ställ in inspelningsparametrarna så att de har en inspelningsfrekvens på 50 Hz och en samplingsfrekvens på 18 kHz/elektrod. Ändra Amplifier Offset för att kalibrera chipet. Se tabell 2 för felsökningstips.
- Plätering och underhåll av humana iPSC-neuroner i HD-MEA (Figur 2B)
- Tina och späd celler till önskade celler per mikroliterkoncentration (dvs. 1000 celler/μl för att erhålla 50 000 celltäthet i en 50 μL minskning av HD-MEA) (tabell 1C).
- Pipettera cellsuspensionen på ytan av det aktiva chipområdet med hjälp av ett höghalts-laminin-prickmedium (tabell 1D).
- Inkubera vid 37 °C med 5 % CO2 i 45-60 min.
- Fyll försiktigt på 2 ml material i HD-MEA-behållaren (tabell 1C).
- Utför 100 % mediebyte på dag 1 (DIV1) efter sådd med RT-media (tabell 1C). Byt 50 % av materialet var 3-4:e dag. Håll HD-MEA inkuberat vid 37 °C med 5 % CO2 under hela försöket.
OBS: Pipettera försiktigt för att undvika att cellerna lossnar. Kontrollera färgen på mediet för eventuell förorening. Intervallet och mängden mediebyte kan bestämmas av enskilda studiefrågor eller cellbehov/specifikationer. - Valfritt: Kontrollera framstegen för cellodlingstillväxten mellan DIV4-DIV8 under ett upprätt DIC-mikroskop (differential interference contrast) efter rengöring stage med >70 % EtOH.
3. Ex-vivo och in vitro storskaliga neurala registreringar med HD-MEA
- Förberedelse av arbetsytan för inspelning av hjärnsegment (figur 2A)
- Medan hjärnsegmenten återställs placerar du de verktyg som krävs på varje angiven arbetsyta (se Materialförteckning).
OBS: Huvudsysteminställningen måste optimeras och testas i god tid före experimentdagen för hjärnskivan. Perfusionssystemet (inloppsledningar, pumputloppsledningar, slangar och jordning) måste testas med PBS eller aCSF och en HD-MEA på inspelningsplattformen för att säkerställa en ren signal, ökat signalbrusförhållande och avsaknad av perfusionsbrus. - Bestryk HD-MEA-chipet med 0,1 mg/ml PDLO för att förbättra kopplingen mellan vävnad och chip och inkubera vid 37 °C i 20 minuter.
- Under chipinkubationen, fyll det gravitationsbaserade perfusionssystemet och ledningarna med registrerande aCSF. Säkerställ kontinuerlig karbogenering av perfusionssystemet. Ställ in en flödeshastighet på 4.5 ml/min och en temperatur på 37 °C.
- Placera HD-MEA-chippet på registreringsplattformen, fyll behållaren med aCSF, testa perfusionssystemet och felsök eventuellt återstående systembrus.
- Starta programvaran Brainwave. Välj Arkiv > ny inspelningssession. Ställ in inspelningsparametrarna så att de har en inspelningsfrekvens på 1 Hz och en samplingfrekvens på 14 kHz/elektrod. Ändra Amplifier Offset för att kalibrera chipet. Se tabell 2 för felsökningstips.
OBS: Parametrarna för inspelningsfrekvens och samplingsfrekvens beror på datatyp och individuella systemkrav.
- Starta programvaran Brainwave. Välj Arkiv > ny inspelningssession. Ställ in inspelningsparametrarna så att de har en inspelningsfrekvens på 1 Hz och en samplingfrekvens på 14 kHz/elektrod. Ändra Amplifier Offset för att kalibrera chipet. Se tabell 2 för felsökningstips.
- Se till att inspelningsområdet är mörkt genom ett rumsbelysningssystem eller en skuggad bur på det optiska bordet.
- Rikta in stereomikroskopet med HD-MEA-chipbehållaren och det aktiva området för bildtagning.
- Placera ankaret i spånbehållaren för att komma i balans.
OBS: Anchor är en specialtillverkad platinaharpa med minimala trådar för att främja syresättning; Vissa kommersiella är dock tillgängliga. - Tillsätt farmakologiska föreningar till lämpliga perfusionsrör.
OBS: I detta protokoll erhölls både spontana och 100 μM 4-aminopyridin (4-AP) farmakologiskt inducerade registreringar som tidigare beskrivits. Farmakologiska föreningar kan skräddarsys för den specifika studiefrågan. - I arbetsytan för beredning av hjärnskivor placerar du en ny 90 mm plastodlingsskål i en 150 mm petriskål av glas. Tillsätt aCSF och börja karbogenera.
- Medan hjärnsegmenten återställs placerar du de verktyg som krävs på varje angiven arbetsyta (se Materialförteckning).
- Kretsomfattande inspelningar från HC- och OB-skivor med HD-MEA
OBS: Skivkoppling bör utföras så snabbt som möjligt för att undvika syrebrist till skivan. Kopplingen bör endast ta ~1 minut från den första placeringen av den mikrodissekerade skivan på chipets aktiva område till den slutliga uppstarten av perfusionssystemet.- Ta bort skivan från hjärnskivans återvinningskammare med en glaspipett och placera den i en 90 mm plastodlingsskål med kontinuerlig karbogenering. Använd ett mikrodissektionsverktyg för att isolera HC eller OB från den omgivande hjärnvävnaden.
- Flytta de isolerade HC- eller OB-spetsskivorna med en glaspipett till HD-MEA-behållaren. Rikta försiktigt in skivan på det aktiva MEA-området med en fin borste. Sug alla lösningar från HD-MEA-chippet väl med ett aspirationssystem.
- Placera ankaret försiktigt ovanpå skivan med hjälp av en pincett.
OBS: Ankaret bör placeras utan skivrörelse för att undvika förlust av koppling. - Tillsätt försiktigt lösningen i spånbehållaren och starta perfusionssystemet.
OBS: Säkerställ laminärt flöde från perfusionsinloppet och pumpens utlopp för optimala registreringsparametrar. - Se till att inspelningsområdet är tillräckligt nedtonat genom rumsbelysningssystemet eller med en skuggad bur på ett optiskt bord.
- Låt skivan acklimatisera sig i 10 minuter innan du påbörjar inspelningar eller ytterligare farmakologisk modulering.
- Starta programvaran Brainwave. Välj Arkiv > ny inspelningssession. Ställ in inspelningsparametrarna så att de har en inspelningsfrekvens på 1 Hz och en samplingfrekvens på 14 kHz/elektrod. Ändra Amplifier Offset för att kalibrera chipet.
OBS: Som tidigare nämnts i avsnitt 3.1.4.1, se till att tillämpa samma registreringsparametrar när du utför systemtester. - Tryck på Spela in för att påbörja förvärvet med de förinställda experimentella förhållandena.
- Omedelbart efter den slutliga inspelningen, ta ljusbilder av den akuta hjärnskivan. Flytta tillbaka skivan till skivans återhämtningskammare, ta bort allt organiskt material som är kopplat till spånet med en borste och fortsätt med nästa skiva. Rengör HD-MEA enligt beskrivningen i avsnitt 3.4.
- Förberedelse av mänsklig iPSC-inspelningsarbetsyta och nätverksomfattande inspelningar på HD-MEA (figur 2B)
OBS: Byt media antingen dagen före inspelning eller omedelbart efter mänsklig iPSC-inspelning (tabell 1C). I studier med de funktionella nervcellerna byttes media var 4:e dag, och på 4, 8, 16 och 24 DIV-media byttes omedelbart efter iPSC-inspelningar.- Säkerställ en steril arbetsmiljö genom att rengöra HD-MEA-insamlingsplattformen med >70 % EtOH.
- Placera försiktigt ett polydimetylsiloxan (PDMS)-baslock med referens på HD-MEA-ringen under huven. Flytta HD-MEA-chippet till iPSC-inspelningsarbetsytan och anslut HD-MEA-chippet till förvärvsplattformen.
- Se till att inspelningsområdet är tillräckligt nedtonat genom ett rumsbelysningssystem eller en skuggad bur på ett optiskt bord.
- Låt HD-MEA-chippet komma i jämvikt i 10 minuter innan inspelningar eller ytterligare farmakologisk modulering påbörjas.
- Starta programvaran Brainwave. Välj Arkiv > Ny inspelningssession. Ställ in inspelningsparametrarna så att de har en inspelningsfrekvens på 50 Hz och en samplingsfrekvens på 18 kHz/elektrod. Ändra Amplifier Offset för att kalibrera chipet.
Anmärkning: Som tidigare nämnts i avsnitt 2.1.1, se till att tillämpa samma registreringsparametrar när du utför ett systemtest före beläggning och plätering. - Registrera spontan avfyrningsaktivitet eller farmakologiskt inducerade svar från det humana iPSC-nätverket varje dag i experimentplanen (dvs. 4, 8, 16, 24 DIV).
OBS: Låt inte chipet stå utanför inkubatorn i >30 minuter för att upprätthålla stabil temperatur och luftfuktighet och förhindra temperaturchock för cellerna. - Inkubera HD-MEA vid 37 °C med 5 % CO2 under experimentets gång.
- Efter avslutat experiment, fixera det neuronala nätverket på chips och färgning för ytterligare optisk avbildning eller rengör HD-MEA direkt, enligt beskrivningen i steg 3.4.
- Rengöring av HD-MEA-chips
- Efter experimentet, kassera lösningen enligt korrekt avfallshantering och skölj med dd-vatten.
- Tillsätt valfritt tvättmedel, rengör det aktiva området och hela behållaren med en Q-tip och kassera tvättmedlet. Fyll på med tvättmedel, inkubera i 20 minuter och kassera sedan tvättmedlet.
- Skölj noggrant med vatten av laboratoriekvalitet. Skölj sedan 3-4 gånger med dd-vatten.
- Använd lufttryck för att torka HD-MEA-chippet ordentligt.
4. Analys av storskaliga neurala inspelningar från HD-MEA
OBS: Medan steg 4.1 är Brainwave-programvaruspecifikt, kan steg 4.2 ändras baserat på varje användares kommersiellt tillgängliga HD-MEA-enhetstyp.
- Förbearbetning av rådata och händelseidentifiering
- Öppna en inspelad rådatafil (.brw) i Brainwave-programvaran. Välj Analys > LFP-identifiering eller Toppidentifiering.
OBS: LFP-detektering använder IIR-filtrering med ett lågpass 4:e ordningens Butterworth-filter (1-100 Hz). Hårda tröskelalgoritmer inkluderar en hög tröskel på 150 μV, en låg tröskel på -150 μV, ett energifönster mellan 70-120 ms, en eldfast period på 10 ms och en maximal händelsevaraktighet på 1 s. Single och MUA Spike Detection använder IIR-filtrering med ett högpass 4:e ordningens Butterworth-filter (300-3500 Hz). En PTSD-algoritm tillämpas med en standardavvikelsefaktor på 8, en maximal livstidsperiod på 2 ms och en refraktär period på 1 ms. - För HC- och OB-kretsinspelningar lägger du till alternativet Avancerad arbetsyta i den identifierade händelsefilen (.bxr) för att importera den strukturella ljusbilden som tagits från stereomikroskopet. När du undersöker storskaliga HC-kretsar, skapa strukturella lager som innehåller gyrus dentatus (DG), hilus, Cornu Ammonis 1 (CA1), Cornu Ammonis 3 (CA3), entorhinal cortex (EC) och perirhinal cortex (PC). När du undersöker storskaliga OB-kretsar, skapa strukturella lager som innehåller luktnervskiktet (ONL), glomerulärt lager (GL), externt plexiformt skikt (EPL), mitralcellsskikt (MCL) och granulärt celskikt (GCL). Betrakta EPL och MCL som projektionsskiktet (PL), inklusive luktcortex (OCx).
- Öppna en inspelad rådatafil (.brw) i Brainwave-programvaran. Välj Analys > LFP-identifiering eller Toppidentifiering.
- Databearbetning med en anpassad Python-beräkningspipeline
- Försvagning
- Läs .bxr-filen med hjälp av ett specialskrivet Python-skript 26,29,32 och h5py 3.6.0 python-paket.
- Extrahera spiktåg som rör iPSC-nätverksinspelningarna och LFP-händelsetåg som rör HC- och OB-hjärnsegmentkretsinspelningarna.
- Karakterisera händelser med ett totalt antal aktiva elektroder som är mindre än 0,1 % eller 10 % av de genomsnittliga aktiva elektroderna per genomsnittlig händelse eller detekterade händelser som faller utanför ett statistiskt rimligt skjuthastighetsintervall som slumpmässiga händelser och ta bort dem. Använd dessutom tröskelvärden för amplitud och händelsevaraktighet.
OBS: För avfyrningshastighetsområdet beaktas 0.1-15 spikar/s och 0.1-60 LFP-händelser/min. Det här är exempel på tröskelvärden för frekvenser som används för de analyserade datauppsättningarna. Tröskelvärdena för hastighet, amplitud och varaktighet beror på enskilda data. - Spara resulterande händelsetågdata med tillhörande spatiotemporal information i .npy filformat.
- Rastergram
- Läs filtrerade .npy- och .bxr-filer för händelser och generera ett rasterdiagram med hjälp av pyplot-funktionen Matplotlib (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html).
- Dessutom, för hjärnsegmentinspelningar med lagerspecificitet, sorterar och grupperar elektrod-ID:n baserat på de lager som producerades i steg 4.1.2.
- Genomsnittlig avfyrningsaktivitet
- Bearbeta tidsseriedata från .bxr-filen och beräkna varje elektrods genomsnittliga avfyrningshastighet (antal händelser/inspelningstid).
- Konstruera en datamatris där raderna och kolumnerna representerar koordinaterna för elektroderna i HD-MEA 64 x 64-matrisen, där varje matrisvärde anger den genomsnittliga avfyrningshastigheten.
- Använd ett plottningsbibliotek som Matplotlibs imshow eller Seaborns heatmap-funktioner i Python.
- Använd den "heta" färgkartan här och skapa en informativ värmekarta som visuellt kapslar in den rumsliga fördelningen av genomsnittliga avfyrningshastigheter över elektrodmatrisen.
- Representativa vågformsspår
- Läs tidsseriedata från .brw-filen och generera en vågformsspårning med hjälp av Matplotlib pyplot-funktionen. (https://matplotlib.org/3.5.3/api/_as_gen/matplotlib.pyplot.html).
- Mata in önskat elektrod-ID, tidsintervall och frekvensband för ett representativt vågformsspår. Frekvensband som definieras i dessa analyser inkluderar lågfrekventa LFP-svängningar (1-100 Hz) med bandpassfiltrerade δ, θ, β och γ frekvensband; skarpa vågkrusningar (SWR) (140-220 Hz); och högfrekvent singel och MUA (300-3500 Hz). Frekvensbanden δ, θ, β och γ är 1-4 Hz, 5-12 Hz, 13-35 Hz respektive 35-100 Hz.
- Effektspektral densitet
- Läs tidsseriedata från .brw-filen och beräkna periodogrammen för att urskilja de dominerande frekvenserna som ligger till grund för den oscillerande aktiviteten inom varje tidsserie.
- Konstruera pseudofärgspektrogram av frekvens-tid-dynamiken.
OBS: Spektra beräknas med Welchs metod genom att använda den snabba fouriertransformen av inspelade LFP:er för att uppskatta spektral effekttäthet41. - Mata in önskat elektrod-ID, tidsintervall och frekvensband för en spektral densitetskarta. Frekvensband som definieras i dessa analyser inkluderar de som beskrivs i steg 4.2.4.
- Funktionell anslutning
- För kretsinspelningar av hjärnsegment, följ steg 4.2.6.2-4.2.6.4.
- Läs tidsseriedata från .brw-filen och beräkna korskovariansen mellan par av aktiva elektroder i 64 x 64-matrisen med hjälp av Pearsons korrelationskoefficient (PCC)42.
- Anpassa en vektorautoregressiv modell till tidsserien med hjälp av multivariat Granger-kausalitet för att kvantifiera påverkan av en tidsserie på en annan.
- Använd funktionen för riktad överföring (DTF) för att bedöma riktningsinformationsflödet i de korrelerade länkarna.
OBS: Funktionell konnektivitet i det flerskiktade nätverket fastställs genom att ställa in ett korrelationsvärdetröskelvärde baserat på de över medelvärdet och två standardavvikelser för alla korskovariansvärden43,44. - För iPSC-inspelning, följ steg 4.2.6.6-4.2.6.8.
- Läs spiketrains-data från .bxr-filen och beräkna en 64x64-matris med PCC-korrelationskoefficienterna mellan alla kombinationer av binerade spiktåg med hjälp av spike_train_correlation funktioner (https://elephant.readthedocs.io/en/v0.7.0/reference/spike_train_correlation.html).
OBS: Funktionell konnektivitet i det flerskiktade nätverket upprättas genom att ställa in ett korrelationsvärdeströskelvärde baserat på de över medelvärdet och två standardavvikelser för alla korskovariansvärden. - Implementera dessutom filtreringsprocedurer för rumsliga och temporala filter (STF) och avståndsberoende latenströsklar (DdLT) i konnektivitetsmatrisen för att eliminera potentiella parade anslutningar som överskrider den maximala utbredningshastigheten (inställd på 400 mm/s)45.
- Extrahera negativa toppar från resulterande korskorrelationsmatriser med filtrerings- och tröskelåtgärder för att identifiera de hämmande anslutningarna med hjälp av filtrerad och normaliserad korskorrelationshistogramalgoritm (FNCCH)45.
- Omvandla varje anslutningsmatris till en dynamisk graffil (.gexf).
- Kartor över nätverksanslutning
- Laboratorium för öppna data i Gephi program 9.2 version (https://gephi.org) för den dynamiska grafen för att plotta specifika tidsintervall.
- Använd geolayout i layoutfönstret för rumslig mappning.
- Placera parameterbegränsningar på gradintervall och kantvikt för jämförelse.
- Tilldela nodfärg, kantstorlek och gradstorlek för bättre visualisering.
- Försvagning
Representative Results
Multimodell spatiotemporal kartläggning och extraktion av oscillerande avfyrningsegenskaper
För att kvantifiera nätverksomfattande LFP- och spikhändelser som uppstod från dynamiska neuronala ensembler, undersökte vi synkrona storskaliga avfyrningsmönster i HC- och OB-kretsar och mänskliga iPSC-nätverk. Inspelade hjärnskivkretsar från steg 3.2 och inspelade iPSC-nätverk från steg 3.3 analyserades enligt steg 4.1-4.2 i protokollet. Först utfördes händelsedetektering och denoising för alla inspelade datauppsättningar och regionalt upplösta enligt kretsspecifikationer. Därefter plottades topografisk pseudo-färgrumslig kartläggning av medelvärden för storskaliga LFP- och spikavfyrningsmönster, rastergram för detekterade händelser och representativa 5-s-spår av filtrerade vågformer (figur 3 A-I). Topografisk pseudofärgkartläggning av storskaliga LFP- och spikavfyrningshastighetsmönster överlagrades på respektive mikroskoptagna optiska bilder av HC (Figur 3A), OB (Figur 3B) och humant iPSC-neuronalt nätverk (Figur 3C). Detta gör det möjligt att undersöka enskilda kretsar och nätverksbaserade oscillerande mönster och svar. HC- och OB-rastergram innehåller detekterade LFP-händelseantal sorterade över DG-, Hilus-, CA3-, CA1-, EC- och PC-lagren i HC-kretsen och ONL-, OCx-, GL-, PL- och GCL-skikten i OB-nätverket över ett 60-sekunders tidsintervall (figur 3D,E). Det mänskliga iPSC-rastergrammet visar synkront detekterade spikhändelser i det sammankopplade odlade nätverket över ett 20 sekunders tidsintervall (figur 3G). Därefter visar 5s representativa händelsespår från storskaliga HD-MEA-inspelningsplatser ett intervall av registrerade oscillerande frekvenser i HC (dvs. vald elektrod i CA3) (figur 3G) och OB (dvs. vald elektrod i GL) (figur 3H) kretsar och multiunit spike bursting-aktivitet i det mänskliga iPSC-nätverket från fyra utvalda aktiva elektroder i arrayen (figur 3I). Dessa exemplifierande signaler visar biosignalsignaturer, inklusive lågfrekventa LFP-svängningar (1-100 Hz) med bandpassfiltrerade δ, θ, β och γ frekvensband; skarpa vågkrusningar (SWR) (140-220 Hz); och högfrekvent singel och MUA (300-3500 Hz). Slutligen användes analys av effektspektral densitet (PSD) för att samtidigt kvantifiera ett specifikt oscillerande bands effektstorlek i den sammankopplade HC- och OB-kretsen som registrerats från HD-MEA (figur 3J,K).
Multimodal nätverksomfattande funktionell konnektivitet
För att härleda den storskaliga konnektiviteten hos flerskiktade neurala nätverk från samtidiga avfyrningsmönster av samtidigt aktiva neuronala ensembler, beräknades korskovariansen mellan par av aktiva elektroder i detekterade händelser enligt steg 4.2.6 i protokollet. Här sorterades korrelationskoefficienten baserat på lager i HC- och OB-kretsen eller osorterad i iPSC-nätverket och lagrades sedan i en symmetrisk matris. Funktionella konnektomer av HC- och OB-kretsar genererades genom att tillämpa multivariat Granger-kausalitet och riktad överföringsfunktion (DTF) för att kvantifiera påverkan av en tidsserie på en annan och bedöma det riktade informationsflödet inom de korrelerade länkarna i de distinkta nätverken. Connectome-mappning av HC (Figur 4A) och OB (Figur 4B) och nätverksvisualisering utfördes med Gephi-programmet 9.2 version (https://gephi.org). Liknande parameterbegränsningar placerades på de funktionella länkarna för att jämföra HC- och OB-hjärnsegmentkretsarna och illustrerade 100 s av den funktionella konnektiviteten för detekterade LFP-händelser. Noder skalas efter gradstyrka med nodfärg som indikerar lager och länkfärg som identifierar anslutningarna inom och mellan lager. Funktionella konnektomer av mänskliga iPSC-nätverk genererades genom att tillämpa spatial-temporala filter (STF) och avståndsberoende latenströsklar (DdLT) för att förbättra urvalet av signifikanta länkar och förfina identifieringen av meningsfulla anslutningar genom att tillämpa filtrerad och normaliserad korskorrelationshistogramanalys (FNCCH). Connectome-mappning av mänskliga iPSC-nätverk på hela HD-MEA-chipvisualiseringen (figur 4C) utförd med Gephi. Nodfärg indikerar excitatorisk eller hämmande ingång, och länkfärg identifierar anslutningar.
Figur 1: Översikt över den experimentella och beräkningsmässiga plattformen för storskalig HD-MEA. (A) Isometrisk schematisk representation av våra multimodala biohybrida neuroelektroniska plattformar realiserade med CMOS-baserad HD-MEA för att fånga neural dynamik från HC, OB och humana iPSC neuronala kretsar och nätverk. (B) Schematiskt arbetsflöde för skivning av mushjärnor och dess arbetslandskap för att erhålla HC- och OB-skivor. (C) Topografiska representationer av de storskaliga avfyrningsmönstren som registrerats samtidigt från hela HC- och OB-skivorna överlagrade med de extraherade extracellulära vågformerna till de optiska bilderna. (D) Schematisk representation av iPSC neuronala nätverk erhållet från människor. (E) Fluorescensmikroskop som visar cellulärt c-fos och somatisk/dendritisk MAP-2 av hela det humana neuronala nätverket på HD-MEA-chip (vänster) matchat med hela den genomsnittliga avfyrningsaktivitetskartan (höger). (F) Beräkningsramverk inklusive avancerad dataanalys, konnektivitetskartläggning och AI-maskininlärningsverktyg för att analysera flerdimensionella neurala data som erhållits från storskaliga inspelningar på HD-MEA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Layouter för ex-vivo hjärnskivor och in vitro mänskliga iPSC-odlingsberedning och inspelningsarbetsytor. A) Schematiskt arbetsflöde som illustrerar inställningarna för beredning av HC- och OB-skivor, med nödvändiga verktyg och utrustning i varje arbetsyta. B) Schematisk framställning av iPSC-odling på människa, inklusive nödvändiga verktyg och anordningar. En fullständig materialförteckning finns i steg 1.2.2, 2.1, 2.2, 3.1.1, 3.3 och i materialförteckningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kartläggning och extrahering av spatiotemporala mönster av nätverksdynamik. (A-C) Genomsnittliga LFP- och spikhastighetskartor, beräknade över femminutersinspelningar, överlagrade på mikroskopets ljusbild. (D-F) Rasterdiagram som visar upptäckta, nedtonade LFP-händelser i ett 60-sekunders datadelurval och toppar i ett 20-sekunders datadelurval. (G-I) Representativ extrahering av vågformsspår från ett 5-sekunders segment av delprovet av rasterdiagramdata (markerat rött i rasterdiagrammet), visas som råa LFP-oscillerande band (1–100 Hz). δ (1–4 Hz), θ (5–12 Hz), β (13–35 Hz) och γ (35–100 Hz) frekvensband. SWR (140-220 Hz); och högfrekvent enkel- och MUA-spikning (300-3500 Hz). (J,K) Effektspektrala densitetskartor för snabba och långsamma oscillerande LFP:er (1-100 Hz) och SWR (140-220 Hz). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Organisering av multimodala nätverksomfattande funktionella konnektomer. (A-C) Gephi-kartor som illustrerar nodal funktionell anslutning, där noder motsvarar en av exempelförklaringarna för färgfältet (nedan), medan länkarna (eller kanterna) är skuggade för att matcha de anslutande noderna. Exempelförklaringar för (A) HC-, (B) OB och (C) iPSC-lager visas på en 64 x 64-matris. HC- och OB-lager ritas över ett tidsintervall på 100 sekunder för att effektivt minska antalet synliga noder och länkar i visualiseringssyfte. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Lösningar för beredning av hjärnskivor och media för iPSC-neuronala kulturer. A) Lösning för styckning med hög sackaroshalt för ex-vivo beredning av hjärnskivor. B) Lösning för registrering av aCSF för beredning och registrering av hjärnskivor ex vivo. (C-D) Human neuronal iPSC Media Protocol, där (C) är BrainPhys kompletta media som används för cellupptining, HD-MEA-chipbeläggning och odlat HD-MEA-underhåll, och (D) dotting-mediet som används för HD-MEA-cellplätering. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Felsökning av vanliga problem med HD-MEA-inspelning. En lista över vanliga problem, deras potentiella orsaker och felsökningslösningar relaterade till HD-MEA-chips, inspelningsplattform, systembrus och programvara. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Discussion
Den intrikata dynamiken i spatiotemporal neuronal aktivitet, som uppstår från sammankopplade neuronala ensembler, har länge varit föremål för intriger inom neurovetenskapen. Traditionella metoder, såsom patch-clamp, standard MEA och Ca2+-avbildning, har gett värdefulla insikter om hjärnans komplexitet. De misslyckas dock ofta med att fånga den omfattande nätverksomfattande beräkningsdynamiken 21,22,23. Det tekniska protokollet för HD-MEA-plattformen, som beskrivs i denna JoVE-studie, representerar ett betydande steg framåt och erbjuder en panoramabild av neural dynamik över olika modaliteter, från cellsammansättningar till expansiva nätverk (dvs. akuta, ex-vivo mushjärnskivor och in-vitro humana iPSC-nätverk)26,29,30,32.
Akuta, ex-vivo mushjärnskivor har varit ett grundläggande verktyg i neuronal forskning, vilket underlättar undersökningar på molekylär och kretsnivå 6,7. Utmaningen med att upprätthålla vävnadens livskraft har dock varit en ihållande flaskhals. Protokollet som beskrivs i denna studie introducerar kritiska modifieringar för att optimera kvaliteten och livslängden hos dessa skivor för att utnyttja deras fördelar på HD-MEA-plattformen. Detta protokoll understryker vikten av - i) Att uppnå skivlikformighet, för vilken användningen av en vibratom är att föredra framför en vävnadshackare på grund av dess precision och minimerade vävnadsskador, trots avvägningen av längre skivningstider. ii) Säkerställa konstant karbogenering under hela processen, från extraktion till registrering, för att upprätthålla vävnadens viabilitet. iii) Reglera temperaturen och ge tillräcklig återhämtningstid före inspelning. iv) Använda ett agarosblock eller mögel för att stabilisera hjärnan, förhindra rivning och minimera limkontakt. v) Upprätthållande av optimala flödeshastigheter för karbogenerad aCSF i HD-MEA-reservoaren för att säkerställa skivans hälsa samtidigt som problem som frikoppling, brus och drift undviks (tabell 2).
För både hjärnskivor från möss och iPSC-preparat från människa är det av största vikt att förbättra kopplingen mellan elektrod och vävnad 30,46,47. Vårt protokoll understryker vikten av att använda den vidhäftningsfrämjande molekylen Poly-dl-ornitin (PDLO). Denna molekyl ökar inte bara ytan för att detektera elektriska signaler utan ökar också den elektriska ledningsförmågan46. Genom att göra det främjar det cellulär vidhäftning, tillväxt och utveckling av funktionella nätverksegenskaper. Sådan optimering spelar en avgörande roll för att förbättra effektiviteten hos HD-MEA-plattformen. Detta säkerställer i sin tur en korrekt och konsekvent analys av ex-vivo- och in-vitro-konnektomer i mikroskala och deras spatiotemporala avfyrningssekvenser. PDLO har visat sig överträffa andra substrat som polyetylenimin (PEI) och poly-l-ornitin (PLO) när det gäller att främja spontan avfyrningsaktivitet och lyhördhet för elektriska stimuli i neuronala kulturer. Dessutom har PDLO använts för ytfunktionalisering på HD-MEA och visat sig förbättra elektrod-slice-kopplingsgränssnittet och öka signal-brusförhållandet i både OB- och HC-skivor26,29. Tillägget av ett specialbyggt platinaankare förstärker ytterligare elektrod-slice-gränssnittskopplingen, vilket leder till inspelningar med ett högre signal-brusförhållande.
Användningen av HD-MEA för både ex-vivo mushjärnskivor och in vitro humana iPSC-nätverk introducerar en metod som är skicklig på att utforska omfattande, flerskalig och multimodal dynamik. Detta innovativa tillvägagångssätt medför dock stora utmaningar, särskilt inom datahantering 48,49,50,51. En enda HD-MEA-inspelning som görs med en samplingsfrekvens på 18 kHz/elektrod genererar häpnadsväckande 155 MB/s data. Datavolymen eskalerar snabbt när man tar hänsyn till flera skivor, olika farmakologiska tillstånd eller förlängda inspelningsperioder. Ett sådant inflöde av information kräver robusta lagringsinfrastrukturer och avancerade beräkningsverktyg för strömlinjeformad bearbetning. HD-MEA-plattformens förmåga att samtidigt samla in data från tusentals neuronala ensembler är både en välsignelse och ett hinder. Det ger suveräna insikter i beräkningsdynamiken för hjärnfunktioner, men det kräver också ett förfinat analytiskt ramverk. I detta JoVE-protokoll har vi gett exempel på beräkningsstrategier, inklusive storskalig händelsedetektering, klassificering, grafteori, frekvensanalys och maskininlärning. Dessa metoder understryker de intensiva ansträngningar som görs för att ta itu med utmaningarna med att analysera komplexa neurala data. Det finns dock fortfarande stort utrymme för utveckling av mer avancerade beräkningsverktyg för att analysera dessa flerdimensionella neurala datamängder. Beväpnad med lämpliga verktyg och metoder förstoras potentialen hos HD-MEA-plattformen, vilket ger djupgående insikter i hjärnans invecklade funktioner vid både friska och patologiska tillstånd.
I huvudsak erbjuder HD-MEA-plattformen, när den integreras med de detaljerade protokoll och beräkningsverktyg som diskuteras, ett transformativt tillvägagångssätt för att förstå hjärnans intrikata funktioner. Genom att fånga storskalig, flerskalig och multimodal dynamik ger den ovärderliga insikter i processer som inlärning, minne och informationsbehandling. Dessutom har dess tillämpning i in-vitro mänskliga iPSC-nätverk potential att revolutionera läkemedelsscreening och personlig medicin. Men även om denna plattform representerar ett betydande framsteg inom neurovetenskaplig forskning, är det avgörande att erkänna och ta itu med de inneboende tekniska utmaningarna. Med pågående förfining och integration av avancerade beräkningsverktyg står HD-MEA-plattformen redo att inleda en ny era av exakta diagnostiska verktyg, identifiering av specifika biomarkörer och riktade terapier för neurologiska sjukdomar.
Disclosures
Författarna deklarerar inga konkurrerande eller ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av institutionella fonder (DZNE), Helmholtz Association inom Helmholtz Validation Fund (HVF-0102) och Dresden International Graduate School for Biomedicine and Bioengineering (DIGS-BB). Vi vill också tacka plattformen för beteendemässiga djurförsök vid DZNE-Dresden (Alexander Garthe, Anne Karasinsky, Sandra Günther och Jens Bergmann) för deras stöd. Vi vill uppmärksamma att en del av figur 1 skapades med hjälp av plattformen BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 150 mm Glass Petri Dish | generic | generic | Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| 0.22 μm Sterile Filter Unit | Assorted | Assorted | Assorted |
| 90 mm Plastic Culture Dish | TPP | 93100 | Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Agarose | Roth | 6351.5 | Brain Preparation Workspace |
| Agarose Mold | CUSTOM | CUSTOM | Brain Preparation Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
| Aluminum Foil | generic | generic | Brain Extraction Workspace |
| Anesthesia chamber | generic | generic | Brain Extraction Workspace; Assorted Beaker, Bedding etc |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544-25G | Solution Preparation Workspace |
| Assorted Beakers | generic | generic | Solution Preparation Workspace; 50 mL |
| Assorted Luers | Cole Parmer | 45511-00 | Brain Slice Recording Workspace |
| Assorted Volumetric flasks | generic | generic | Solution Preparation Workspace; 500 mL, 1 L |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504-044 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Biological Safety Cabinet with UV Lamp | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
| BrainPhys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | CDI, and BrainXell Commerical Supplier Protocol |
| Brainwave Software | 3Brain AG | Version 4 | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
| BrainXell Glutamatergic Neuron Assay | BrainXell | BX-0300 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Solution Preparation Workspace |
| Carbogen | generic | generic | All Workspaces; 95%/5% O2 and CO2 mixture |
| Cell Culture Incubator | Assorted | Assorted | Assorted |
| CMOS-based HD-MEA chip | 3Brain AG | CUSTOM | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
| Conical Tubes, 50 mL, Falcon (Centrifuge Tubes) | STEMCELL Technologies | 38010 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Crocodile Clip Grounding Cables | JWQIDI | B06WGZG17W | Brain Slice Recording Workspace |
| Curved Forceps | FST | 11052-10 | Brain Extraction Workspace |
| DMEM/F12 Medium | Life Technologies | 11330-032 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | STEMCELL Technologies | 37350 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Filter Paper | Macherey-Nagel | 531 011 | Brain Preparation Workspace |
| Fine Brush | Leonhardy | 773 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Forceps | VITLAB | 67895 | Brain Slice Recording Workspace |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Glass pasteur pipette | Roth | 4518 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7021-1KG | Solution Preparation Workspace |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Gravity-based Perfusion System | ALA | VC3-8xG | Brain Slice Recording Workspace |
| HD-MEA Recording platform | 3Brain AG | CUSTOM | Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace |
| Heater | Warner Instruments | TC-324C | Brain Slice Recording Workspace |
| Hemocytometer or Automated Cell Counter | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
| Hypo Needles | Warner Instruments | 641489 | Brain Slice Recording Workspace |
| iCell GlutaNeurons Kit, 01279 | CDI | R1061 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Iris Scissors | Vantage | V95-304 | Brain Extraction Workspace |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | Brain Extraction Workspace |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-250G | Solution Preparation Workspace |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Liquid Nitrogen Storage Unit | Assorted | Assorted | HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace |
| Magnetic Stirrer | generic | generic | Solution Preparation Workspace |
| Metal Screws | Thorlabs | HW-KIT2/M | Brain Slice Recording Workspace |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028-100ML | Solution Preparation Workspace |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | 63138-250G | Solution Preparation Workspace |
| Microdissection Tool Holder | Braun | 4606108V | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Microdissection Tool Needle | Braun | 9186166 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Modular Stereomicroscope | Leica | CUSTOM | Brain Slice Recording Workspace; custom specifications and modifications |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | CDI, and BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-1KG | Solution Preparation Workspace |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751-100G | Solution Preparation Workspace |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | Solution Preparation Workspace |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Optical Cage System | Thorlabs | Assorted | Brain Slice Recording Workspace |
| Optical Table w/Breadboard | Thorlabs | SDA7590 | Brain Slice Recording Workspace |
| PDLO | Sigma Aldrich | P0671 | HD-MEA Coating, Brain Slice Recording Workspace |
| Penicillin-streptomycin, 100x | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Pipette tips | TipONE | S1120-8810 | Brain Slice Recording Workspace |
| Pipettors | Assorted | Assorted | Assorted |
| Platinum Anchor | CUSTOM | CUSTOM | Brain Slice Recording Workspace |
| Polyethylene Tubing | Assorted | Assorted | Brain Slice Recording Workspace |
| Pump | MasterFlex | 78018-22 | Brain Slice Recording Workspace |
| Razor Blade | Apollo | 10179960 | Brain Preparation Workspace |
| Reference Electrode Cell Culture Cap | CUSTOM | CUSTOM | Human iPSC Recording Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
| Rubber Pipette Bulb | Duran Wheaton Kimble | 292000205 | Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace |
| Serological Pipettes, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL | Assorted | Assorted | Assorted |
| Slice Recovery Chamber | CUSTOM | CUSTOM | Brain Slice Recovery Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request |
| Spatula | ISOLAB | 047.06.150 | Brain Preparation Workspace |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84100-1KG | Solution Preparation Workspace |
| Super Glue | UHU | 358221 | Brain Slice Preparation Workspace |
| Surgical Scissors | Peters Instruments | BC 344 | Brain Extraction Workspace |
| Tabletop Centrifuge | Assorted | Assorted | Assorted |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | BrainXell Commercial Supplier Protocol |
| Tissue Paper | generic | generic | Brain Extraction Workspace |
| Trypan Blue | STEMCELL Technologies | 07050 | CDI Commerical Supplier Protocol |
| Upright Microscope | Olympus | CUSTOM | Imaging Workspace; Custom specifications and modifications |
| Vacusip | Integra | 159010 | Brain Slice Recording Workspace |
| Vibratome | Leica | VT1200s | Brain Slice Preparation Workspace; Includes: Specimen plate, buffer tray, ice tray, specimen plate holding tool, vibratome blade adjusting tool |
| Vibratome Blade | Personna | N/A | Brain Slice Preparation Workspace |
| Water Bath | Lauda | L000595 | Brain Slice Recovery Workspace |
References
- Hebb, D. O. The Organization of Behavior; A Neuropsychological Theory. , Wiley. New York. (1949).
- Cossart, R., Garel, S. Step by step: cells with multiple functions in cortical circuit assembly. Nat Rev Neurosci. 23, 395-410 (2022).
- Carrillo-Reid, L., Yuste, R. Playing the piano with the cortex: role of neuronal ensembles and pattern completion in perception and behavior. Curr Opin Neurobiol. 64, 89-95 (2020).
- Buzsáki, G.
- Buzsáki, G. Neural Syntax: Cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68 (3), 362-385 (2010).
- Huang, Y., Williams, J. C., Johnson, S. M. Brain slice on a chip: opportunities and challenges of applying microfluidic technology to intact tissues. Lab Chip. 12 (12), 2103-2117 (2012).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
- Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
- Anderson, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, L. The Hippocampus Book. , Oxford University Press. New York. (2006).
- Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nat Neurosci. 20, 1434-1447 (2017).
- Mori, K., Nagao, H., Yoshihara, Y. The olfactory bulb: Coding and processing of odor molecule information. Science. 286 (5440), 711-715 (1999).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: A molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
- Kempermann, G. Why new neurons? Possible functions for adult hippocampal neurogenesis. J Neurosci. 23 (3), 635-638 (2003).
- Aimone, J. B., Wiles, J., Gage, F. H. Computational influence of adult neurogenesis on memory encoding. Neuron. 61 (2), 187-202 (2009).
- Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 7, 697-709 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
- Rajamohan, D., et al. Current status of drug screening and disease modelling in human pluripotent stem cells. Bioessays. 35 (3), 281-298 (2013).
- Heilker, R., Traub, S., Reinhardt, P., Schöler, H. R., Sterneckert, J. iPS cell derived neuronal cells for drug discovery. Trends Pharmacol Sci. 35 (10), 510-519 (2014).
- Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical applications of microelectrode array and patch clamp recordings on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Vis Exp. (186), e64265 (2022).
- Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: A limitation of patch-clamp recording. Annu Rev Physiol. 59, 621-631 (1997).
- Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protoc. 2 (2), 100442 (2021).
- Lee, C. H., Park, Y. K., Lee, K. Recent strategies for neural dynamics observation at a larger scale and wider scope. Biosens Bioelectron. 240, 115638 (2023).
- Urai, A. E., Doiron, B., Leifer, A. M., Churchland, A. K. Large-scale neural recordings call for new insights to link brain and behavior. Nat Neurosci. 25 (1), 11-19 (2022).
- Hu, X., Khanzada, S., Klütsch, D., Calegari, F., Amin, H. Implementation of biohybrid olfactory bulb on a high-density CMOS-chip to reveal large-scale spatiotemporal circuit information. Biosens Bioelectron. 198, 113834 (2022).
- Amin, H., Marinaro, F., Tonelli, D. D. P., Berdondini, L. Developmental excitatory-to-inhibitory GABA-polarity switch is disrupted in 22q11.2 deletion syndrome: A potential target for clinical therapeutics. Sci Rep. 7 (1), 15752 (2017).
- Amin, H., Nieus, T., Lonardoni, D., Maccione, A., Berdondini, L. High-resolution bioelectrical imaging of Aβ-induced network dysfunction on CMOS-MEAs for neurotoxicity and rescue studies. Sci Rep. 7 (1), 2460 (2017).
- Emery, B. A., Hu, X., Khanzada, S., Kempermann, G., Amin, H. High-resolution CMOS-based biosensor for assessing hippocampal circuit dynamics in experience-dependent plasticity. Biosens Bioelectron. 237, 115471 (2023).
- Amin, H., et al. Electrical responses and spontaneous activity of human iPS-derived neuronal networks characterized for 3-month culture with 4096-electrode arrays. Front Neurosci. 10, 121 (2016).
- Lonardoni, D., et al. Recurrently connected and localized neuronal communities initiate coordinated spontaneous activity in neuronal networks. PLoS Comput Biol. 13 (7), e1005672 (2017).
- Emery, B. A., et al. Large-scale multimodal recordings on a high-density neurochip: Olfactory bulb and hippocampal networks. 2022 44th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine & Biology Society (EMBC). , Glasgow, Scotland, United Kingdom. 3111-3114 (2022).
- Rossi, L., Emery, B. A., Khanzada, S., Hu, X., Amin, H. Pharmacologically and electrically-induced network-wide activation of olfactory bulb with large-scale biosensor. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
- Emery, B. A., et al. Recording network-based synaptic transmission and LTP in the hippocampal network on a large-scale biosensor. 2023 IEEE BioSensors Conference (BioSensors). , London, United Kingdom. 1-4 (2023).
- Hierlemann, A., Frey, U., Hafizovic, S., Heer, F. Growing cells atop microelectronic chips: Interfacing electrogenic cells in vitro with CMOS-based microelectrode arrays). Proceedings of the IEEE. 99 (2), 252-284 (2011).
- Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab Chip. 9, 2644-2651 (2009).
- Siegle, J. H., Hale, G. J., Newman, J. P., Voigts, J. Neural ensemble communities: open-source approaches to hardware for large-scale electrophysiology. Curr Opin Neurobiol. 32, 53-59 (2015).
- Amin, H., Maccione, A., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. High-density MEAs reveal lognormal firing patterns in neuronal networks for short and long term recordings. 2015 7th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering (NER). , Montpellier, France. 1000-1003 (2015).
- Altuntac, E., et al.
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. J Neurosci Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Welch, P. D. The use of fast Fourier transform for the estimation of power spectra: A method based on time averaging over short, modified periodograms. IEEE Transactions on Audio and Electroacoustics. 15 (2), 70-73 (1967).
- Eggermont, J. J., Munguia, R., Pienkowski, M., Shaw, G. Comparison of LFP-based and spike-based spectro-temporal receptive fields and cross-correlation in cat primary auditory cortex. PLoS One. 6 (5), e20046 (2011).
- Damos, P. Using multivariate cross correlations, Granger causality and graphical models to quantify spatiotemporal synchronization and causality between pest populations. BMC Ecol. 16, 33 (2016).
- Kaminski, M. J., Blinowska, K. J. A new method of the description of the information flow in the brain structures. Biol Cybern. 65, 203-210 (1991).
- Pastore, V. P., Massobrio, P., Godjoski, A., Martinoia, S. Identification of excitatory-inhibitory links and network topology in large-scale neuronal assemblies from multi-electrode recordings. PLoS Comput Biol. 14 (8), e1006381 (2018).
- Amin, H., Dipalo, M., De Angelis, F., Berdondini, L. Biofunctionalized 3D nanopillar arrays fostering cell guidance and promoting synapse stability and neuronal activity in networks. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (17), 15207-15215 (2018).
- Woeppel, K., Yang, Q., Cui, X. T. Recent advances in neural electrode-tissue interfaces. Curr Opin Biomed Eng. 4, 21-31 (2017).
- Steinmetz, N. A., Koch, C., Harris, K. D., Carandini, M. Challenges and opportunities for large-scale electrophysiology with Neuropixels probes. Curr Opin Neurobiol. 50, 92-100 (2018).
- Siegle, J. H., Hale, G. J., Newman, J. P., Voigts, J. Neural ensemble communities: open-source approaches to hardware for large-scale electrophysiology. Curr Opin Neurobiol. 32, 53-59 (2015).
- Freeman, J. Open source tools for large-scale neuroscience. Curr Opin Neurobiol. 32, 156-163 (2015).
- Stevenson, I. H., Kording, K. P. How advances in neural recording affect data analysis. Nat Neurosci. 14 (2), 139-142 (2011).
