Détection des micro-organismes environnementaux avec la réaction en chaîne par polymérase et l'électrophorèse sur gel

1. le prélèvement

1. Recueillir le sol à l’aide d’une tarière ou pelle jusqu'à une profondeur déterminée. Si la collecte du sol de la rhizosphère (la région étroite du sol entourant et influencé par les racines des plantes et leurs microbes associés), seulement percevoir directement auprès autour des racines de la plante en frappant le sol au large dans un tonneau de collection.
2. Recueillir l’échantillon d’eau en plongeant une bouteille en plastique stérile dans l’eau tout en tenant l’extrémité de la baguette de trempage.

2. préparation et Extraction des acides nucléiques

1. Recueillir les organismes et les virus dans l’échantillon et extraire l’ADN et l’ARN. Pour plus de détails, veuillez consulter la vidéo sur l’extraction des acides nucléiques communauté JoVE Science Education.
2. Stocker l’ADN extraite dans des microtubes étiquetées. Si l’ADN doit être stocké pendant la nuit ou pour des périodes plus longues, congeler à-20 ° C et décongeler les tubes à température ambiante lorsqu’il est prêt pour utilisation.
3. Si le matériel génétique à doser est RNA (si c’est le génome des virus à ARN, ou l’ARN transcrit des organismes multicellulaires), effectue la transcription inverse (RT) sur l’échantillon pour créer l’ADN complémentaire (ADNc) avant de procéder à la PCR. Pour plus de détails, veuillez vous référer à l’enseignement des sciences JoVE vidéo sur RT-PCR.

3. polymerase Chain Reaction

1. Placez l’enzyme PCR (p. ex., Taq polymérase) sur la glace et dégeler les autres réactifs (tampon PCR, dNTPs, amorces) à l’intérieur d’une hotte « propre » désignée à la température ambiante. L’enzyme est stocké à-20 ° C mais ne gèle jamais. Il est sensible à la température et donc doit rester cool et son exposition à la température ambiante réduite
2. Calculer le volume de chaque réactif nécessaire pour faire un « mix master » de tous les réactifs qui sont constants parmi toutes les réactions (tableau 1). Assurez-vous que tenir compte des résultats positifs (par exemple, un modèle connu pour contenir la région cible) et les contrôles négatifs (par exemple, aucun modèle) dans les calculs. Ajouter une majoration de 10 % pour le dernier volume pour tenir compte de l’erreur de pipettage. Volumes d’apprêt dépendent des dosages pour des organismes spécifiques ; reportez-vous à la documentation publiée pour les valeurs appropriées.
3. À l’aide d’une liaison de faible microcentrifugeuse tube, ce qui réduit l’adhérence des molécules de réactifs aux parois en plastique, ajouter les volumes calculés de chaque réactif pour assembler des master mix. Doucement de vortex et centrifuger chaque réactif avant d’ajouter. Une fois le master mix est préparé, vortex à mélanger et à recueillir par centrifugation
4. Préparer les bandes de 8 tubes PCR. Désigner un tube pour chaque échantillon, y compris les contrôles positifs et négatifs
5. Injecter le volume approprié de mélange PCR dans chaque tube de la bande
6. Ajouter le volume approprié de la matrice d’ADN d’échantillons, ainsi que 5 μL du modèle positif et 5 μL d’eau moléculaire de catégorie comme contrôle négatif, dans les tubes PCR respectifs.
7. Placer le capuchon solidement sur la bande de 8-tube et centrifuger pendant quelques secondes à l’aide d’un minicentrifuge
8. Placez une bande de 8-tube dans un thermocycleur
9. Définir le programme approprié PCR sur le thermocycleur. Un programme typique se compose des éléments suivants
   1. Dénaturation à 94 ° C pendant 3 min.
   2. 30 à 40 cycles d’amplification : dénaturation à 94 ° C pendant 30 s, recuit à température amorce spécifique (généralement entre 50 et 60 ° C) pour 30 s et l’extension à 72 ° C pendant 30 s / 500 bp.
   3. Extension finale à 72 ° C pendant 7-10 min.

4. préparation du Gel d’Agarose

1. Selon le volume désiré gel et gel de concentration (tableau 2), peser la quantité appropriée de poudre d’agarose dans un erlenmeyer de 125 mL.
2. Ajouter le volume approprié de tampon de gel en cours d’exécution dans la fiole et agiter le ballon à la main.
3. Faire chauffer le mélange tampon-agarose dans un four à micro-ondes à puissance élevée pendant 1 min.
4. Enlever le ballon du micro-ondes et agiter à la main pour s’assurer que tous l’agarose est dissout. Si l’agarose n’a pas été complètement dissous, répéter au micro-ondes par tranches de 30 s.
5. Après s’être assuré fermement le bouchon sur le flacon, refroidir à 50 ° C en tournant sous l’eau froide courante.
6. Ajouter 1 μL de bromure d’éthidium (EtBr) au mélange d’agarose en utilisant un micropippette désigné pour le bromure d’éthidium. Bromure d’éthidium est un colorant qui lie les acides nucléiques bicaténaires et émet une fluorescence orange lorsque illuminé par la lumière UV. Notez que EtBr est potentiellement cancérigène, donc des équipements de protection individuelle (lunettes, blouse de laboratoire, gants jetables de bromure d’éthidium) doivent être portés.
7. Verser le gel fondu dans un bac de coulée de gel électrophorèse. Veillez à ce qu’aucune bulle n’est emprisonnées dans l’agarose. Placer un peigne dans le gel et la fixer solidement. Attendre environ 20-30 min pour le gel à se solidifier.
8. Une fois le gel a solidifié, enlever soigneusement le peigne sans causer des déchirures dans le gel. Le peigne crée des puits dans le gel pour charger les échantillons.

5. électrophorèse sur gel de

1. Placer le gel d’agarose solidifiée dans la chambre d’électrophorèse.
2. Ajouter le tampon approprié en cours d’exécution dans la chambre jusqu'à ce que le gel est à peine immergé.
3. Sur un morceau de Parafilm, Pipetter taches de chargement concentré de colorant. Également inclure une échelle d’ADN d’une gamme adaptée pour les tailles attendues des produits PCR. Vous pouvez également utiliser une nouvelle série de microtubes, un pour chaque échantillon.
4. Une fois que l’ACP est terminée, récupérez cette bande 8-tube du thermocycleur et centrifuger brièvement pour recueillir les condensats. Ajouter un volume approprié du produit de l’ADN à la teinture de chargement et la pipette de haut en bas pour mélanger. Par exemple, 2 µL de 10 x chargement colorant est mélangé avec 8 µL de l’échantillon pour obtenir un volume final de 10 µL, avec le colorant à 1 x.
5. Pipetter chaque mélange colorant-échantillon dans les puits désignés dans le gel d’agarose, en veillant à ne pas percer les puits.
6. Connecter les électrodes à la chambre d’électrophorèse. L’ADN est chargé négativement, pour qu’il « fonctionne » vers l’électrode positive. Par conséquent, connecter l’électrode positive de l’autre côté de la chambre, où les puits ont été chargés. Affectez à l’alimentation une tension appropriée pour le système d’amortisseur et la taille de la chambre de gel et affectez-lui exécuter. Petites bulles doivent être visibles, se déplaçant sur les côtés de la chambre si l’électrophorèse se déroule correctement.
7. Une fois que le front de colorant a avancé assez loin vers le bas le gel, coupez l’alimentation de puissance. Soigneusement le gel dans le transilluminateur ou visual imageur de transport et allumez la lampe à UV lumière pour visualiser les bandes d’ADN sur le gel.
8. Analyser la taille de bande et les positions sur le gel. Comparer les positions de la bande des échantillons pour le contrôle positif pour déterminer si l’ADN de l’organisme d’intérêt est présent dans l’échantillon (Figure 1).

Composant	Volume par Tube (μL)	Volume pour 5 tubes (μL)	Concentration finale
10 x Ex tampon Taq	5.0	25	1 x
dNTPs 2,5 mM	4.0	20	0. 2 mM
Primer avant *	2.0	10	400 nM
Inverser l’apprêt *	2.0	10	400 nM
Moléculaire H2O	31.75	158.75	-
Ex Taq	0.25	1.25	2.5 U
Mélange PCR	45	225

Tableau 1. Les volumes de réactifs pour PCR master mix. * Volumes primer varient selon le dosage de l’organisme. Réglez le volume d’eau de grade moléculaires pour faire le μL 45 volume final. Volumes des autres composants ne devraient pas varier.

Recommandé % d’Agarose	Résolution optimale pour Fragments d’ADN linéaire (paires de bases)
0,5	1 000-30 000
0,7	800-12 000
1.0	500-10 000
1.2	400-7 000
1.5	200-3 000
2.0	50-2,00

Le tableau 2. Gammes DNA fragment taille optimale résolus par des pourcentages de gel d’agarose différents.