Détection des micro-organismes environnementaux avec la réaction en chaîne par polymérase et l'électrophorèse sur gel

La réaction en chaîne par polymérase, ou PCR, est une technique biologique fondamentale qui est largement appliquée à la détection et à l’identification des micro-organismes présents dans le sol, l’eau et d’autres échantillons environnementaux.

Classiquement, les micro-organismes sont cultivés en laboratoire à l’aide de milieux de croissance spécialisés. Cependant, de nombreux microbes présents dans l’environnement naturel sont « non cultivables », soit parce qu’ils ont une activité métabolique ou un taux de croissance très faibles, soit parce qu’ils ont des exigences de croissance très strictes qui peuvent ne pas être reproductibles dans une boîte de culture. Les différences de cultivabilité entre les microbes signifient également que, lorsque les micro-organismes d’un échantillon environnemental sont cultivés, leur abondance relative en culture peut ne pas refléter leurs niveaux réels dans l’environnement.

L’avènement de la PCR, qui peut amplifier spécifiquement même de petites quantités d’ADN présentes dans un échantillon mixte, permet de détecter et d’identifier rapidement des microbes d’intérêt spécifiques, même ceux qui ne sont pas cultivables, au sein de l’assortiment complexe d’organismes présents dans un échantillon environnemental.

Cette vidéo présentera les principes de la PCR. Il abordera ensuite un protocole général pour réaliser une PCR sur de l’ADN isolé d’un échantillon environnemental afin de détecter la présence d’un organisme d’intérêt. Enfin, plusieurs applications de l’identification des microbes par PCR seront explorées.

Le principe de base de la PCR est d’utiliser des cycles répétés de changements séquentiels de température pour obtenir une amplification exponentielle de l’ADN, généralement avec une machine connue sous le nom de thermocycleur pour faire défiler automatiquement les différentes températures. La synthèse de l’ADN est réalisée par des enzymes ADN polymérase obtenues à partir de bactéries vivant dans des sources chaudes, telles que Thermus aquaticus ou « Taq ». Ces polymérases sont stables à la chaleur, ce qui leur permet de résister aux températures élevées utilisées lors de la PCR.

La séquence cible, connue sous le nom d’amplicon, est amplifiée à partir de la matrice d’ADN à l’aide de deux courts tronçons de nucléotides appelés « amorces ». En raison de la grande spécificité de la liaison des acides nucléiques complémentaires, les amorces permettent l’amplification ciblée de séquences d’intérêt très spécifiques. En concevant des amorces qui ne feront qu’amplifier une séquence unique, ou une combinaison unique de séquences, d’un organisme d’intérêt, la PCR peut être utilisée pour détecter de manière différentielle la présence de l’ADN de cet organisme parmi tout le matériel génétique présent dans un échantillon environnemental complexe.

Chaque cycle de PCR est divisé en trois phases. La première, connue sous le nom de « dénaturation », est généralement fixée au-dessus de 92 ? C et dure environ 30 s. La dénaturation est utilisée pour briser les molécules d’ADN en brins uniques, afin de permettre à la réaction d’amplification de se dérouler.

La deuxième phase, le « recuit », est réglée 2 à 3 ? C au-dessous de la température de fusion la plus basse des deux amorces, généralement entre 50 et 65 ? C, et dure également environ 30 s. La température de fusion est la température à laquelle 50 % des molécules d’ADN double brin se sont séparées en brins simples, et donc l’étape de recuit permet aux amorces de se lier à leurs sites cibles dans le modèle d’ADN.

La troisième phase d’un cycle de PCR est « l’élongation » ou « l’extension », lorsque l’ADN polymérase se lie au duplex amorce-matrice et catalyse la synthèse des nouveaux brins. Fixé à 72 ? C pour la polymérase PCR la plus couramment utilisée, Taq, la durée de cette phase dépend de la longueur de l’amplicon, généralement 30 s pour 500 paires de bases. Après chaque cycle, l’ADN amplifié est à nouveau dénaturé et sert de nouveau modèle, entraînant une augmentation exponentielle de la quantité de produits PCR.

Une fois la réaction terminée, les produits de PCR peuvent être résolus par taille sur un « gel » généralement constitué d’agarose polymère, un processus connu sous le nom d’électrophorèse. Un champ électrique est appliqué à travers le gel, et les charges négatives dans le squelette des molécules d’ADN les font migrer vers l’extrémité positive du champ. D’une manière générale, les molécules d’ADN linéaires qui sont plus grandes mettront plus de temps à voyager à travers la matrice de gel.

Maintenant que vous comprenez comment fonctionne la PCR, voyons comment la réaction peut être utilisée pour identifier les micro-organismes dans un échantillon environnemental.

Pour commencer, calculez le volume de chaque réactif nécessaire en fonction du nombre d’échantillons à traiter, plus 10 % supplémentaires pour tenir compte des erreurs de pipetage. Un modèle de contrôle positif - qui contient la région cible - doit être inclus pour s’assurer que la réaction fonctionne ; ainsi qu’un contrôle négatif où aucun modèle d’ADN n’est inclus, afin d’exclure la contamination dans l’un des composants de la réaction. Conservez l’enzyme polymérase Taq sur de la glace et décongelez le reste des réactifs et les échantillons d’ADN à température ambiante dans une hotte à flux laminaire désignée pour éviter toute contamination.

Une fois que tous les réactifs ont décongelé, constituez le « mélange maître » de réactifs en ajoutant le volume calculé de chaque réactif dans un tube de microfuge à faible liaison, ce qui minimise les écarts de quantités de réactifs dus à l’adsorption des molécules à la surface du tube. Manipulez doucement et centrifugez chaque réactif avant de l’ajouter. Une fois le mélange maître préparé, vortex pour mélanger et recueillir par centrifugation.

Étiquetez une bandelette PCR de 8 tubes pour désigner un tube pour chaque échantillon, y compris les témoins. Versez la quantité appropriée de mélange maître PCR dans chaque tube de la bandelette. Ensuite, ajoutez chaque échantillon d’ADN dans le tube correspondant.

Placez le capuchon de la bande en toute sécurité sur le tube de la bandelette et centrifugez brièvement dans une mini-centrifugeuse avec un adaptateur de bande. Ensuite, placez le tube dans le thermocycleur et exécutez la réaction conformément au programme PCR approprié.

Pendant l’exécution de la PCR, préparer un gel d’agarose pour l’électrophorèse des produits de PCR. Pesez une quantité appropriée de poudre d’agarose pour un gel avec une concentration qui peut résoudre les produits PCR en fonction de leurs tailles prévues. Ajouter l’agarose dans une fiole de 125 ml, puis ajouter le volume approprié de tampon de gel dans la fiole, en fonction du volume de gel coulé, et agiter pour mélanger. Passez la solution d’agarose au micro-ondes à puissance élevée pendant 1 min. Une fois terminé, vérifiez que l’agarose s’est complètement dissoute en agitant le ballon et répétez l’utilisation au micro-ondes par incréments de 30 secondes si nécessaire.

Fixez fermement le capuchon sur le ballon et refroidissez la solution d’agarose à 50 ? C en faisant tourner la fiole sous l’eau froide courante. Une fois refroidi, ajoutez 1 ? L de bromure d’éthidium à l’agarose. Étant donné que le bromure d’éthidium est potentiellement cancérigène, assurez-vous de porter un équipement de protection individuelle tel que des lunettes de protection, une blouse de laboratoire et des gants résistants au bromure d’éthidium.

Versez la solution d’agarose dans un plateau de coulée de gel par électrophorèse, en vous assurant qu’aucune bulle d’air n’est piégée dans l’agarose. Placez un peigne avec le nombre requis de puits dans la solution. Laissez le gel à température ambiante pendant 20 à 30 min pour qu’il se solidifie. Une fois le gel pris, retirez soigneusement le peigne, en veillant à ne pas déchirer le gel au cours du processus.

Placez le gel solidifié dans la chambre d’électrophorèse. Ajoutez le tampon LB dans la chambre jusqu’à ce que le gel soit juste immergé. Sur un morceau de Parafilm, pipetez un « point » de l’échelle d’ADN d’une plage adaptée à la taille attendue des produits PCR. Récupérez les tubes PCR avec les réactions terminées du thermocycleur. Recueillir les condensats dans les tubes PCR par brève centrifugation, et ajouter 8 ? L de chaque échantillon sur le Parafilm. Ajouter 2 ? L de 10x en chargeant le colorant à chaque endroit du produit PCR, de sorte que la concentration finale du colorant soit de 2x.

Chargez les échantillons et l’échelle dans les puits désignés dans le gel d’agarose, en faisant attention de ne pas percer le gel. Une fois le chargement terminé, mettez le couvercle sur la chambre d’électrophorèse et connectez les électrodes à l’alimentation électrique. Étant donné que l’ADN est chargé négativement et migre vers l’électrode positive, assurez-vous que les puits sont du côté le plus proche de l’électrode négative. Allumez l’alimentation électrique et réglez-la sur une tension adaptée à la taille de la chambre d’électrophorèse et au système tampon utilisé. Réglez l’électrophorèse sur « run ». De petites bulles se déplaçant sur les côtés de la chambre seront observées si l’électrophorèse se déroule correctement.

Une fois que la façade du colorant a suffisamment avancé dans le gel, coupez l’alimentation électrique. Transportez soigneusement le gel vers un imageur de gel pour visualiser les produits électrophorés. Avec un bouclier protecteur, allumez la lumière UV et visualisez les bandes d’ADN sur le gel. Analysez la position des bandes pour voir si elle correspond au motif attendu qui indique la présence de l’espèce d’intérêt dans l’échantillon environnemental.

Maintenant que vous avez vu comment la PCR est effectuée, examinons les différentes façons dont elle est appliquée pour détecter les micro-organismes d’intérêt dans l’environnement.

L’une des utilisations de la détection microbienne environnementale basée sur la PCR consiste à identifier des organismes pathogènes tels que l'« amibe mangeuse de cerveau » Naegleria fowleri, un organisme unicellulaire présent dans les plans d’eau douce et les piscines non chlorées qui peut attaquer le système nerveux humain, souvent mortellement. La présence de ce microbe mortel dans les échantillons d’eau ou le liquide céphalo-rachidien des patients suspects peut être testée en effectuant une PCR à l’aide d’amorces qui ciblent des séquences d’ADN uniques dans le génome de l’amibe.

Une autre application de l’identification microbienne par PCR consiste à tester la présence de bactéries pathogènes chez les mouches capturées à proximité des établissements alimentaires, dans le cadre de la surveillance de la santé publique et des enquêtes sur les éclosions de maladies.

Ici, les chercheurs ont recherché la présence de bactéries pathogènes telles que Salmonella et Listeria, en isolant d’abord les bactéries de la surface du corps et du canal digestif des mouches, puis en utilisant des conditions de culture spécifiques à l’espèce pour enrichir ces espèces d’intérêt. Après avoir extrait l’ADN de toutes les bactéries cultivées, des kits PCR de détection spécifiques à l’espèce disponibles dans le commerce ont été utilisés pour tester leur identité.

Enfin, différentes souches de bactéries pathogènes résistantes aux antibiotiques comme Staphylococcus aureus, qui présentent des problèmes majeurs de santé publique, peuvent être identifiées et différenciées par PCR.

Dans cet exemple, les chercheurs ont isolé et cultivé S. aureus à partir d’échantillons cliniques, puis ont extrait l’ADN des colonies bactériennes et effectué une PCR. Les réactions d’amplification ont été « multiplexées », ce qui signifie que plusieurs ensembles d’amorces ciblant différentes régions uniques du génome bactérien ont été combinés dans la même réaction. Des ensembles d’amorces individuels ont été conçus de manière à ce que les produits de PCR résultent de l’ADN de certaines souches seulement, mais pas d’autres, de sorte qu’en combinaison, des modèles de bandes de produits uniques ont été observés pour chaque souche.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la détection des micro-organismes basée sur la PCR. Nous avons examiné les principes qui sous-tendent la réaction en chaîne par polymérase ; un protocole pour effectuer la PCR sur de l’ADN extrait de micro-organismes environnementaux ; et enfin, plusieurs applications spécifiques de cette technique pour tester des organismes d’intérêt dans différents types d’échantillons environnementaux ou cliniques. Merci d’avoir regardé !