Traitement du pin taeda PtGen2 cDNA microarray
20 mars 2009
L'ADNc biopuces PtGen2 a été développé pour les études d'expression génique dans le pin taeda, P. taeda, Et d'autres conifères. Ici, nous montrons pré-et post-hybridation manutention et le lavage des techniques qui peuvent être utilisés avec ce tableau de céder une meilleure cohérence, les artefacts réduits, et de milieux.
Cette vidéo a été produite par des chercheurs de la Warnell School of Forestry and Natural Resources de l’Université de Géorgie. Le but de cette vidéo de formation est de détailler comment traiter notre microarray LOB lolly pine pt, gen two CDNA, en accordant une attention particulière au lavage et à la manipulation de la puce, avant et après l’hybridation. En général, nos protocoles suivent ceux développés à l’Institut de recherche génomique Tiger et au Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility, VMSR, où nos puces sont imprimées.
Nous avons constaté qu’un traitement plus rigoureux du PT Gen 2 est nécessaire pour assurer la plus grande cohérence en ce qui concerne l’uniformité de la qualité du signal et les faibles bruits de fond. La première étape est un prélavage. Nous le faisons parce que notre tampon de détachage contient une teneur en sel très élevée et que ce prélavage est nécessaire pour éliminer ce sel.
Les lames sont placées dans un support de lames de microscope et plongent vigoureusement 15 à 20 fois dans une solution SDS à 0,2 % préchauffée à 43 degrés. Une fois les lames lavées dans la solution SDS, elles sont retirées soigneusement à l’aide d’une pince dans un bocal Copeland contenant un tampon de pré-hybridation. Ce tampon contient cinq XSSC 0,1 % SDS et 1 % BSA, et est également chauffé à 43 degrés.
Le pot Copeland est recouvert de parfum et placé dans un incubateur à 43 degrés pendant une heure. Après la pré-hybridation, les lames sont retirées sur un support de lames de microscope et traitées successivement à travers cinq changements d’eau désionisée plongeant 15 à 20 fois à chaque changement. Enfin, les lames sont placées dans de l’isopropanol et trempées cinq ou six fois avant d’être centrifugées à sec dans une centrifugeuse à puce M mate.
Après centrifugation, les lames sont soufflées avec de l’air comprimé passé à travers un filtre de 0,2 micron. Les lames sont ensuite recouvertes de patins de levage, qui ont également été nettoyés à l’air comprimé, et nous utilisons une petite pointe de pipette pour ajuster le glissement de l’élévateur dans la bonne position. Sur la diapositive.
Une fois que les lamelles de levage ont été positionnées, mais avant l’ajout du tampon d’hybridation, nous ajoutons 20 microlitres de 100 millimolaires dihi, trois atols aux puits d’humidité situés aux extrémités de la chambre. Nous sommes maintenant prêts à ajouter les CDNA cibles, qui ont été remis en suspension dans le tampon d’hybridation. La pointe de la pipette est placée sur le bord de la lamelle de levage et la lame et la solution sont pipetées lentement.
Nous avons constaté que l’utilisation de l’effet capillaire pour charger les réseaux offre le plus de cohérence et réduit considérablement l’incorporation de bulles indésirables. Une fois que le matériau cible a été ajouté au réseau, la chambre d’hybridation est assemblée et recouverte d’une feuille d’aluminium. La chambre d’hybridation est ensuite placée dans un bain d’eau agitée pour une incubation d’une nuit, généralement de 14 à 16 heures.
Le bain-marie est réglé à 48 degrés et le shaker est réglé à 50 tr/min. Il est également important de noter qu’à partir du moment de l’ajout de la solution d’hybridation jusqu’à tous les lavages post-hybridation, les procédures sont effectuées en basse lumière pour éviter la photo-oxydation. Le lendemain, les lames sont retirées de la chambre d’hybridation et placées dans un bocal Copeland contenant la solution de lavage numéro un, qui a été préchauffée à 53 degrés.
Les lames sont laissées dans le bocal Copeland pendant environ une minute jusqu’à ce que les glissières de l’élévateur tombent, après quoi les lames sont délicatement retirées à l’aide d’une pince et placées dans un porte-lames de microscope pour procéder aux lavages. Les lames sont ensuite plongées vigoureusement environ 15 à 20 fois dans un deuxième récipient, contenant également la solution de lavage numéro un à 53 degrés. Le récipient est ensuite recouvert de parfum et placé dans un agitateur d’air incubateur réglé à 53 degrés et cent tr/min.
Après l’incubation de 10 minutes et la solution de lavage, la première, les lames sont plongées vigoureusement 15 à 20 fois dans un récipient avec la solution de lavage numéro deux, qui est à température ambiante du récipient. Celui-ci est recouvert d’un film para et placé à nouveau sur un agitateur à température ambiante pour une incubation de 10 minutes. Enfin, les lames sont retirées de la solution de lavage numéro deux et plongées vigoureusement 15 à 20 fois dans un récipient contenant la solution de lavage numéro trois.
Les lames sont ensuite retirées dans un deuxième récipient de solution de lavage numéro trois recouvert de perfil et placées à nouveau sur le shaker pendant 10 minutes. Après le lavage final, nous centrifugeons les lames jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches. Pour ce faire, nous plaçons un capuchon Falcon de 15 mil dans un tube conique de 50 mil, et nous plaçons le code-barres des tableaux côté vers le bas dans le tube conique.
Les tubes sont ensuite essorés dans une tête de godet oscillante à 1500 tr/min à température ambiante. Après la centrifugation, les lames sont retirées dans un deuxième ensemble de tubes coniques de 50 mil, qui ont été recouverts d’une feuille d’aluminium. Les tubes sont ensuite purgés avec de l’azote gazeux, qui est filtré à travers un filtre et un capuchon de 0,22 micron pour le transport ou le stockage jusqu’au balayage.
Nous collectons les données de balayage sur un réseau de scans PerkinElmer de 5 000 sprints. L’image du réseau est quadrillée et les données de balayage brutes sont traitées, et l’analyse initiale des données est effectuée avec la suite logicielle d’imagerie de bio discovery. Ensuite, les données d’intensité du signal ponctuel sont normalisées au fur et à mesure que l’analyse statistique est effectuée à l’aide des outils de réseau BRB, un progiciel statistique robuste et disponible gratuitement qui peut être téléchargé à partir de l’Institut national du cancer.
D’autres analyses statistiques et recherches de motifs d’expression génique sont effectuées avec la suite de modèles et d’analyses d’expression génique Jeep PPA. Un autre progiciel d’analyse en ligne disponible gratuitement. Merci d’avoir regardé notre vidéo sur la façon de traiter le microréseau de pin PT Gen deux de lob lolly.
Les personnes suivantes étaient responsables du contenu et de la production de cette vidéo de formation.
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Aperçu
Cet article présente le microréseau ADNc PtGen2 développé pour les études d'expression génique chez le pin taché et d'autres espèces de conifères. Il détaille les techniques de manipulation et de lavage avant et après l'hybridation pour améliorer la cohérence et réduire les artefacts.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Analyse de l'expression génique
- Technologie des microréseaux
- Biologie végétale
Contexte
- Les microréseaux ADNc sont essentiels pour étudier l'expression génique.
- PtGen2 est spécifiquement conçu pour le pin taché et les conifères.
- Les techniques de manipulation appropriées sont cruciales pour des résultats fiables.
- Le contenu élevé en sel du tampon de dépôt nécessite un pré-lavage.
Objectif de l'étude
- Améliorer la cohérence des données d'expression génique.
- Réduire le bruit de fond dans les résultats des microréseaux.
- Fournir un protocole standardisé pour les chercheurs.
Méthodes utilisées
- Pré-lavage pour éliminer le sel du tampon de dépôt.
- Techniques de lavage rigoureuses après l'hybridation.
- Comparaison avec les protocoles d'installations de recherche établies.
- Évaluation de la qualité du signal et des niveaux de fond.
Résultats principaux
- Amélioration de la cohérence de la qualité du signal observée.
- Niveaux de fond plus bas atteints avec des techniques raffinées.
- Les protocoles ont démontré leur efficacité à travers plusieurs expériences.
- Recommandations pour les études futures fournies.
Conclusions
- Des techniques de manipulation et de lavage améliorées sont vitales pour le succès des microréseaux.
- Les protocoles standardisés peuvent conduire à des données d'expression génique plus fiables.
- La recherche future peut s'appuyer sur ces résultats pour obtenir de meilleurs résultats.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key challenge in plant genomics: achieving reproducible microarray data despite high-salt spotting buffers that can introduce artifacts. By standardizing pre- and post-hybridization washing steps, the method enhances data consistency and reduces background noise, supporting reliable gene expression profiling in conifer species. This contributes to target validation efforts in forestry biotechnology by enabling clearer detection of differentially expressed genes under experimental conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional responses in conifer tissues, supporting hypothesis testing in stress or developmental pathways.
- Operational Value: Reduces technical variability from salt artifacts, improving confidence in target identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, low-background microarray slides suitable for reproducible hybridization across experimental groups.
- Operational Value: Establishes a robust slide preparation workflow that enhances assay reproducibility and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by providing reliable expression profiles from pine tissues, useful in studying environmental adaptation or wood formation.
- Operational Value: Facilitates cross-study comparability through consistent slide processing, aiding translational continuity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology workflow, specifically supporting reliable target profiling in non-model plant systems where genetic tools are limited.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven expression analysis in loblolly pine, clarifying gene responses in root, needle, and stem tissues.
- Screening: Delivers microarray slides with uniform signal quality, enabling reliable comparative screening of gene expression under varying conditions.
- Analytics: Generates clean, normalized signal intensity data compatible with downstream tools like BRB Array Tools and JePPAs for statistical analysis.
- Translational Research: Supports continuity from gene discovery to functional validation by providing trustworthy expression baselines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable slide preparation protocol that can be applied across multiple conifer species and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in gene expression measurements by minimizing salt- and SDS-derived artifacts.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across slides and laboratories through defined washing and handling steps.
- Strategic Value: Reduces risk of false positives/negatives in expression profiling, supporting better go/no-go decisions in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidate genes based on cleaner, more reliable expression data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microarray handling and hybridization techniques.
- Needs access to temperature-controlled water baths, incubators, and centrifuges for slide processing.
- Demands standardized reagents including SDS, SSC, BSA, and isopropanol for washing and dehydration.
- Requires adaptation of humidity control and hybridization timing based on target RNA source and labeling method.
- Practical limitation: High-salt spotting buffer necessitates rigorous pre-washing; incomplete salt removal may persist if steps are shortened.
