Immunocoloration lots pour la détection de protéines à grande échelle dans le cerveau du singe entier

Cette procédure commence dès réception d’un cerveau perfusé avec du PFA à 4 %, externalisé et protégé par congélation, qui a été envoyé aux collaborateurs en neurosciences pour être inclus à l’aide de repères d’alignement intégrés dans la matrice environnante. Le cerveau peut être sectionné selon le plan coronal afin de produire des sections sérielles d’une épaisseur souhaitée, qui représenteront l’ensemble de l’étendue antéro-postérieure du cerveau à l’aide de paniers et de récipients spécialisés. Un traitement immuno-chimique par lots peut être effectué afin de déterminer le profil d’expression spatiale d’une protéine dans tout le cerveau.

Bonjour, je suis le Dr Shaheen Zur du Laboratoire de neurosciences visuelles à l'École d'optométrie de l'Université de Montréal. Bonjour, je suis le Dr Mark Burke, également du Laboratoire de neurosciences visuelles à l'École d'optométrie de l'Université de Montréal. Bonjour, je suis le Dr Mo Petto, directeur du Laboratoire de neurosciences visuelles à l'École d'optométrie, Université de Montréal.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de marquage immuno sur lots pour la détection à grande échelle de protéines dans un cerveau entier de singe. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les profils d'expression de protéines cibles dans l'ensemble du cerveau et pour comparer les expressions de ces protéines au sein d'un même cerveau. Commençons donc.

Avant le traitement histologique, obtenir un cerveau de primate qui a été préservé par perfusion systémique, fixation postérieure et protection à l'isolement cryogénique à l'aide de solutions de saccharose à concentration croissante. À ce stade, le cerveau est envoyé à Neuroscience Associates pour être inclus et sectionné librement à l’aide de leur technologie propriétaire. À la réception, on observera que sept repères d'alignement ont été placés dans la matrice d'inclusion afin que les sections puissent être correctement orientées et réalignées une fois le traitement histologique terminé.

Pendant la coupe, des images numériques sont prises et peuvent ensuite être utilisées pour la reconstruction 3D de cartes anatomiques. Les scientifiques associés traitent notre tissu afin d'obtenir des sections coronales libres en série de 50 micromètres d'épaisseur sur l'ensemble du cerveau. Une fois ce processus terminé, nous pouvons commencer le traitement histologique des sections.

Lorsque nous commençons le traitement histologique, nous avons généralement environ 140 sections à manipuler par anticorps ou coloration. Ici, nous allons démontrer la technique à l’aide d’un échantillon plus petit de sections traitées avec l’anticorps SMI 32, un anticorps monoclonal dirigé contre les protéines de neurofilaments non phosphorylées. Tout au long de la procédure, des bacs et paniers spéciaux pour coloration sont utilisés, permettant de traiter simultanément et efficacement un grand nombre de sections en flottaison libre.

Cela garantit que la coloration obtenue soit uniforme sur toutes les sections. La première étape consiste à incuber les sections dans une solution à base de PBS contenant du TRITON X 100 et du sérum de cheval normal pendant 60 minutes. Ceci réduira la liaison non spécifique des molécules d'anticorps, qui entraîne une coloration de fond.

Ensuite, les sections sont incubées toute la nuit. Dans une solution d'anticorps SMI 32 à base de PBS, complétée par du Triton X 100 et du sérum de cheval normal, les sections sont lavées le jour suivant selon trois périodes de dix minutes dans une solution de lavage, puis incubées deux heures à température ambiante dans une solution d'anticorps secondaire biotinylé Muse à base de PBS contenant du Triton X 100 et du sérum de cheval normal.

Après une série de trois nouveaux lavages de 10 minutes chacun, les sections sont placées dans une solution du complexe d'avidine-biotine conjuguée à la peroxydase de raifort pendant une heure à température ambiante. Enfin, après une autre série de lavages, les sections sont placées dans une réaction au diaminobenzidine pendant 10 minutes, produisant une coloration brune dans les neurones immunoréactifs. La réaction est ensuite arrêtée en retirant le panier de coloration et en immergeant les sections dans du PBS.

Après deux à trois rinçages de cinq minutes dans du PBS, les sections sont prêtes à être montées individuellement sur des lames en verre pour commencer le processus de montage, à l’aide d’une grande boîte de Pétri et de pinceaux très doux. Les sections sont prélevées du récipient contenant le tampon PBS et montées individuellement sur des lames en verre recouvertes de gélatine. Les échantillons sont ensuite laissés sécher à l’air libre toute la nuit dans une hotte aspirante le jour suivant.

Les sections sont rincées en les trempant dans de l'eau déionisée afin d'éliminer les éventuels cristaux de sel restants du processus de montage. Les lames sont ensuite déshydratées par des passages successifs dans de l'éthanol à concentrations croissantes, nettoyées au xylène et recouvertes d'une lame couvre-objet à l'aide d'un milieu de montage Permount. À ce stade, les lames doivent être conservées horizontalement pendant environ une semaine à dix jours, afin de permettre au milieu de montage de durcir.

Après cela, les lames peuvent être conservées dans une boîte à lames ou analysées par imagerie en microscopie. Cette méthode permet d'obtenir un profil d'expression complet d'une protéine cible d'intérêt à travers tout le cerveau de singe. Nous présentons ici des sections coronales représentatives qui offrent un aperçu de l'expression de la FMRP, de la nouvelle n et de la SMI 32.

Dans le cerveau du même singe. Nous venons de vous montrer comment réaliser une immunomarquage par lots pour une protéine ciblée d'intérêt sur l'ensemble du cerveau. Lors de cette procédure, il est important de s'assurer que toutes les sections subissent une agitation douce pendant leur incubation dans diverses solutions, et qu'elles restent constamment complètement immergées.

En outre, prenez votre temps lors du montage sur lame des dissections et éliminez autant que possible les plis et les rides sans compromettre l'intégrité du tissu. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.