Immunocoloration lots pour la détection de protéines à grande échelle dans le cerveau du singe entier

Cette procédure commence à la réception d’un cerveau perfusé, exorisé et cryoprotégé à 4 % de PFA, qui a été envoyé à des associés en neurosciences pour être intégré à l’aide de repères d’alignement intégrés dans la matrice environnante. Le cerveau peut être sectionné au niveau du plan coronal pour produire des coupes en série à l’épaisseur souhaitée, qui représenteront toute l’extension antérieure et postérieure du cerveau à l’aide de paniers et de conteneurs spécialisés. Le traitement immunologique par lots peut être effectué afin de déterminer le modèle d’expression spatiale d’une protéine dans l’ensemble du cerveau.

Bonjour, je suis la Dre Shaheen Zur du Laboratoire de neurosciences visuelles de l’École d’optométrie de l’Université de Montréal. Bonjour, je suis le Dr Mark Burke, également du Laboratoire de neurosciences visuelles de l’École d’optométrie de l’Université de Montréal. Bonjour, je suis Dr.Mo Petto, directrice du Laboratoire de neurosciences visuelles de l’École d’optométrie de l’Université de Montréal.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’immuno-coloration par lots pour la détection de protéines à grande échelle dans un cerveau de singe entier. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les modèles d’expression des protéines cibles dans l’ensemble du cerveau et pour comparer et contraster l’expression de ces protéines dans le même cerveau. Alors commençons.

Avant le traitement histologique, obtenez un cerveau de primate, qui a été préservé par perfusion systémique et post-fixation et cryoprotégé à l’aide de solutions de saccharose graduées. À ce stade, le cerveau est envoyé à des associés en neurosciences pour être intégré et sectionné gratuitement à l’aide de leur technologie propriétaire. Au retour, on observera que sept points de repère d’alignement sont placés dans la matrice d’encastrement afin que les sections puissent être correctement orientées et réalignées une fois le traitement histologique terminé.

Pendant que la coupe est effectuée, des images numériques sont prises qui peuvent ensuite être utilisées pour la reconstruction 3D de cartes anatomiques. Des neuroscientifiques associent des processus à nos tissus pour produire des sections coronales flottantes en série de 50 micromètres d’épaisseur sur l’ensemble du cerveau. Une fois terminé, nous pouvons commencer le traitement histologique des coupes.

Lorsque nous commençons le traitement histologique, nous avons généralement environ 140 sections à traiter par anticorps ou colorant. Ici, nous démontrerons la technique avec un plus petit échantillon de sections traitées avec l’anticorps SMI 32, qui est un anticorps monoclonal contre les protéines de neurofilaments non phosphorylées. Tout au long de la procédure, des plats et des paniers de coloration spécialisés sont utilisés, ce qui permet de traiter simultanément et efficacement un grand nombre de sections flottantes.

Cela permet de s’assurer que la teinture résultante est uniforme sur toutes les sections. La première étape consiste à incuber les sections dans une solution à base de PBS contenant TRITTON X 100 et du sérum de cheval normal pendant 60 minutes. Cela réduira la liaison non spécifique des molécules d’anticorps qui entraîne une coloration de fond.

Ensuite, les sections sont incubées pendant la nuit. Dans une solution d’anticorps SMI 32 à base de PBS, complétée par du tritton X 100 et du sérum de cheval normal le lendemain, les sections sont lavées pendant trois périodes de 10 minutes dans une solution de lavage, puis incubées pendant deux heures à température ambiante. Dans une solution d’anticorps secondaires biotinylés Muse à base de PBS contenant du Triton X 100 et du sérum de cheval normal.

Après une série de trois lavages supplémentaires de 10 minutes, les sections sont placées dans une solution de complexe de peroxydase de raifort conjuguée à la biotine d’avadon pendant une heure à température ambiante. Enfin, après une autre série de lavages, les sections sont placées dans une réaction D amino benzine pendant 10 minutes, ce qui produit une coloration brune dans les neurones immunoréactifs. La réaction est ensuite arrêtée en retirant le panier de coloration et en immergeant les sections dans du PBS.

Après deux à trois, les rinçages de cinq minutes dans les sections PBS sont prêts à être montés individuellement sur des lames de verre pour commencer le processus de montage à l’aide d’une grande boîte de Pétri et de pinceaux très doux. Les sections sont retirées du récipient tampon PBS et montées individuellement sur des lames de verre recouvertes de gélatine. Le lendemain, les échantillons sont laissés sécher à l’air libre dans une hotte abrasive.

Les sections sont rincées en les trempant dans de l’eau diminéralisée pour éliminer les cristaux de sel qui peuvent rester du processus de montage. Les lames sont ensuite déshydratées dans des étapes d’éthanol graduées, nettoyées au xylène et le couvercle glissé avec un support de montage par montage. À ce stade, les lames doivent être stockées pendant environ une semaine à 10 jours en position horizontale pour permettre au support de montage de durcir.

Ensuite, les lames peuvent être stockées dans une boîte à lames ou soumises à une imagerie par microscopie. Cette méthode produit un profil d’expression complet d’une protéine cible d’intérêt dans l’ensemble du cerveau d’un singe. Ici, nous montrons des sections coronales représentatives qui fournissent un instantané de l’expression de FMRP, du nouveau n et de SMI 32.

Dans le même cerveau de singe. Nous venons de vous montrer comment effectuer une immunocoloration par lots pour une protéine cible d’intérêt dans l’ensemble du cerveau. Lors de cette procédure, il est important de s’assurer que toutes les sections subissent une légère agitation tout en étant incubées dans diverses solutions, et qu’à tout moment elles restent complètement immergées.

De plus, prenez votre temps pendant le montage du verre des dissections et enlevez autant de rides et de plis que possible sans endommager l’intégrité des tissus. Alors c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.