Clarification optique et marquage pour la microscopie à fluorescence à nappe de lumière dans l’imagerie cérébrale humaine à grande échelle
26 janvier 2024
Le présent protocole fournit une procédure étape par étape pour l’effacement optique rapide et simultané, le marquage multi-rond et la reconstruction volumétrique 3D de dizaines de coupes de cerveau humain post-mortem en combinant la technique de transformation tissulaire courte (S WITCH - H 2O2 - Antigène Retrieval - 2,2'-thiodiéthanol [TDE]) avec l’imagerie par microscopie à fluorescence à feuille de lumière dans un protocole de routine à haut débit.
Le cerveau humain est un organe complexe qui englobe différentes compétences. Pour comprendre sa fonctionnalité, il est essentiel de construire des capteurs cellulaires détaillés dans l’ensemble du cerveau. Notre protocole de routine à haut débit permet l’analyse de la cytoarchitecture 3D de zones volumétriques du cerveau humain avec une résolution micrométrique, permettant ainsi sa caractérisation structurale.
La reconstruction volumétrique de grandes zones du cerveau humain présente plusieurs défis expérimentaux liés aux dimensions massives des échantillons de cerveau, à la composition biologique complexe, aux conditions variables de fixation et de stockage post-mortem, et aux signaux autofluorescents des pigments de type lipofuscine. Tous ces éléments peuvent compromettre l’efficacité de la compensation optique et démontrer la qualité. Par rapport à d’autres techniques de nettoyage, la méthode de transformation tissulaire courte combinée à l’imagerie par microscopie à feuille de lumière peut être utilisée pour le traitement rapide et simultané de plusieurs sections du cerveau humain.
Il en résulte une reconstruction cérébrale 3D avec une résolution subcellulaire.
Aperçu
Cette étude présente un protocole à haut débit pour le blanchiment optique simultané, le marquage en plusieurs cycles et la reconstruction volumétrique 3D de sections cérébrales humaines post-mortem. En intégrant la technique S WITCH - H 2 O 2 - Antigen R etrieval - 2,2'-thiodiethanol (TDE) SHORT à la microscopie à feuillet lumineux en fluorescence, la méthodologie permet une caractérisation structurale détaillée avec une résolution micrométrique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Histologie
- Immunohistochimie
Contexte
- Le cerveau humain est un organe complexe qui nécessite un examen minutieux à différentes échelles.
- Les défis incluent la manipulation d'échantillons cérébraux de grande taille et la présence de signaux d'autofluorescence provenant de pigments.
- Le protocole présenté corrige les lacunes des techniques de clarification existantes.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole optimisé pour analyser la structure du cerveau humain.
- Améliorer l'efficacité du clarification optique et la qualité d'imagerie des sections de tissu cérébral.
- Permettre une reconstruction 3D avec un haut niveau de détail et de fiabilité.
Méthodes utilisées
- L'étude utilise la microscopie de fluorescence en feuillet lumineux.
- Le tissu cérébral humain est utilisé comme modèle biologique, avec des étapes détaillées de sectionnement et de traitement précisées.
- Les étapes clés incluent l'encapsulation des échantillons dans l'agarose, le traitement avec du TDE et une immunomarquage en plusieurs cycles pour divers marqueurs neuronaux.
- Les durées et températures d'incubation sont précisément définies afin de garantir des conditions optimales de clarification et d'imagerie.
Résultats principaux
- Le protocole permet une clarification optique efficace et un imagerie de haute qualité de la matière grise et de la matière blanche.
- La coloration en plusieurs cycles permet de visualiser des populations neuronales distinctes dans des sections cérébrales humaines.
- La méthode démontre la capacité à capturer des détails subcellulaires dans des reconstructions 3D.
Conclusions
- La présente étude établit une méthode d'analyse complète de la structure cérébrale à une résolution micrométrique.
- L'approche met en évidence le potentiel d'amélioration de notre compréhension de l'architecture cérébrale et de ses implications pour les études neuronales.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'imagerie 3D à grande échelle et à haute résolution de tissus cérébraux humains est essentielle pour faire progresser la validation de cibles thérapeutiques et la compréhension mécanistique en recherche neuropharmaceutique&D. Le protocole SHORT, combiné à la microscopie de fluorescence en feuillet lumineux, permet une cartographie structurale rapide et multiplexée de sous-populations neuronales dans la substance grise et la substance blanche. Cette capacité renforce la confiance prédictive et réduit les risques aux stades précoces de la découverte et aux points critiques de translation.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet une analyse détaillée de l'architecture neuronale et le cartographage des sous-populations pour la validation des cibles.
- Contribue à l'évaluation des mécanismes en révélant le contexte cytoarchitectural dans les tissus cérébraux humains.
- Facilite le tri du portefeuille en fournissant des données structurelles quantitatives riches en informations.
Développement de tests et criblage
- Prépare des sections tissulaires multiplexées et transparentisées, adaptées aux flux de travail d'imagerie quantitative en aval.
- Standardise le traitement des échantillons pour une imagerie et une analyse reproductibles et à haut débit.
- Permet la détection multiplexée de marqueurs neuronaux, soutenant ainsi un développement d'essai robuste.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats d'imagerie structurelle avec l'architecture cérébrale humaine pertinente pour la maladie.
- Assure une continuité du stade de découverte à la validation préclinique en permettant une analyse directe des tissus humains.
- Appuie les décisions d'avancement ajustées au risque grâce à des données complètes de cytoarchitecture en 3D.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole s'intègre à la continuité découverte-préclinique en permettant un imagerie quantitative à haut débit de sections cérébrales humaines pour la validation de cibles et des études mécanistiques.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification des hypothèses et la clarification des voies grâce à une cartographie neuronale détaillée.
- Écrans de sélection : Fournit des échantillons reproductibles et multiplexés, prêts pour l'imagerie et l'analyse quantitative.
- Analytique : Fournit des données multispectrales et à résolution subcellulaire pour l'analyse comparative entre conditions.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte fondamentale et les travaux précliniques en offrant une pertinence directe aux tissus humains.
- Réutilisation en milieu professionnel : Établit un flux de travail évolutif et standardisé, utilisable de manière répétée dans divers programmes en neurobiologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles neurobiologiques.
- Valeur opérationnelle : Assure un traitement et une imagerie des tissus standardisés, évolutifs et reproductibles.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées d'aller ou de ne pas aller de l'avant et une gestion efficace du portefeuille en termes de capital.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et l'avancement, ajustées au risque, des actifs en neuropharmacie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en traitement des tissus, immunomarquage et microscopie avancée.
- Exige un accès à la microscopie à feuillet de lumière et à une infrastructure d'imagerie multicanal.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de préparation des échantillons et d'imagerie.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les régions cérébrales ou les conditions du tissu.
- La manipulation des échantillons et les paramètres d'incubation doivent être rigoureusement contrôlés pour obtenir des résultats optimaux.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
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Introduction
1:18
Preparing Formalin‐Fixed Human Brain Sections for SHORT Tissue Transformation Technique
2:01
SWITCH ‐ H2O2 ‐ Antigen Retrieval — TDE (SHORT) Tissue Transformation Technique
4:55
Sample Mounting for Light‐Sheet Fluorescence Microscopy and Stripping for Multi‐Round Labeling of the Same Specimens
