Préparation du Primat tissu cérébral non humain pour immunohistochimie pré-enrobage et microscopie électronique

L’objectif global de cette expérience est d’obtenir une immunocoloration fiable du tissu cérébral de non-primates pour la microscopie électronique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuroanatomie, telles que l’incidence synaptique d’une innervation donnée dans une structure cérébrale précise. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode facile et peu coûteuse pour marquer des innervations spécifiques adaptées à la microscopie électronique.

Commencez par transférer des sections de 50 microns d’acroléine fixe de cerveau de primate non humain contenant la région d’intérêt vers une plaque de 12 puits contenant du PBS. Lavez les sections flottantes trois fois dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante, puis incubez les sections dans une solution de borohydrure de sodium fraîchement préparée pendant 30 minutes à température ambiante. Balancez-vous doucement sans couverture.

Une fois les 30 minutes écoulées, aspirez le borohydrure de sodium et ajoutez du PBS dans chaque puits. Placez l’assiette sur une bascule et secouez vigoureusement pendant 10 minutes. Répétez le lavage deux fois de plus ou jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gaz de réaction.

Bloquez les sections en les incubant dans une solution de 2 % de sérum normal et de 0,5 % de gélatine de poisson froide diluée dans du PBS pendant une heure à température ambiante avec un léger balancement. Une fois le temps d’incubation écoulé, incubez les sections dans une solution d’anticorps primaires avec un léger balancement pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain, après avoir lavé les sections comme précédemment, incubez les sections dans une solution d’anticorps secondaire pendant une heure et demie à température ambiante avec un léger balancement.

Après avoir lavé les sections comme précédemment, incuber dans une solution d’avidine-biotine-peroxydase ou ABC pendant une heure avec balancement. Ensuite, préparez une solution fraîche de 0,05 %3, 3'Diaminobenzidine avec 0,005 % de peroxyde d’hydrogène dilué dans du TBS. Après le lavage, incubez des sections dans la solution DAB pendant trois à sept minutes avec un balancement doux.

Une fois que le précipité brun s’est développé jusqu’à la couleur souhaitée, arrêtez la réaction en lavant rapidement deux fois à froid, puis à travers une série de lavages TBS et PB chronométrés. Transférez la plaque contenant les sections tachées DAB dans la hotte de ventilation. Transférez les sections dans une plaque à six puits remplie de PB et aplatissez complètement les sections en pipetant soigneusement le PB hors de la plaque, puis ajoutez une solution de tétroxyde d’osmium goutte à goutte pour éviter de perturber les sections aplaties.

Couvrez la plaque d’une feuille d’aluminium pour protéger les sections de la lumière et incubez pendant 30 minutes à température ambiante sans agitation. Pendant l’osmification, préparez de la résine époxy hydrofuge en ajoutant des quantités appropriées de chaque composant du mélange de résine époxy dans un grand gobelet en plastique. Remuez avec un bâtonnet en bois ou une pipette en plastique jusqu’à l’obtention d’une couleur brune homogène, puis transférez des quantités égales de résine dans des tasses en aluminium de taille appropriée pour le nombre de sections à traiter et laissez-la reposer.

Une fois la période d’osmification écoulée, lavez les sections trois fois en PB pendant 10 minutes avec un balancement à basse vitesse. Après le lavage, déshydratez les sections de la série suivante d’éthanol classé pendant deux minutes chacune. Ensuite, transférez les sections dans des flacons en verre remplis d’oxyde de propylène et incubez dans de l’oxyde de propylène trois fois pendant deux minutes chacune pour terminer le processus de déshydratation.

Transférez ensuite soigneusement les sections, une par une, dans les gobelets en aluminium, en évitant autant que possible le contact avec l’air. Enfoncez à plat les sections dans de la résine époxy hydrofuge préalablement mélangée et incubez-les pendant la nuit sous la hotte de ventilation à température ambiante. Le lendemain, enduisez d’huile minérale les lames de verre et les lamelles en plastique, puis ramollissez la résine en incubant les gobelets en aluminium à 60 degrés Celsius pendant 12 à 15 minutes au maximum.

Aplatissez soigneusement les sections du côté graissé de la lame de verre. Placez la lamelle graissée et expulsez soigneusement l’air restant. Incuber les lames à 60 degrés Celsius pendant 48 heures.

Après 48 heures, retirez la lamelle en plastique, laissant la section enfermée dans de la résine. Commencez par utiliser des jumelles pour localiser la région d’intérêt, puis utilisez un scalpel pour couper un petit morceau de tissu quadrangulaire d’environ un millilitre carré. Ensuite, limez la pointe d’un bloc de résine, puis collez le morceau de tissu quadrangulaire dessus.

Après séchage, placez le bloc de résine dans le plateau de l’ultramicrotome en position verticale et utilisez une lame de rasoir tranchante pour couper progressivement chaque côté du bloc de résine pour former un trapèze aux côtés lisses. Ensuite, mettez le plateau en position horizontale et faites pivoter le bloc jusqu’à ce que le côté le plus long du trapèze soit tourné vers le bas. Placez un outil de taille diamanté ou un couteau en verre dans un espace dédié.

Réglez l’ultramicrotome pour couper des sections de 300 microns à un millimètre par seconde. Ajustez le couteau pour qu’il soit parallèle verticalement à la pièce quadrangulaire et pour afficher un très petit angle horizontal d’environ un degré et coupez la surface de la pièce quadrangulaire jusqu’à ce que le tissu commence à apparaître. Maintenant, passez à un couteau diamanté ultra 45 degrés équipé d’un bateau rempli d’eau distillée pour couper des sections de 80 microns d’épaisseur.

Lissez les sections en les recouvrant d’un morceau de papier absorbant à pointe de xylène sans toucher la surface de l’eau, et collectez les sections en série sur des grilles de cuivre nues de 150 mailles. Placez les grilles dans une boîte de stockage de grille, puis préparez une solution individuelle de citrate de plomb, de solution mère et d’eau distillée, et filtrez à travers un filtre à seringue de 0,2 micron. Couvrez le flacon d’une feuille d’aluminium pour le protéger de la lumière.

Placez chaque grille sur une goutte de solution de citrate de plomb dilué, avec la section en contact avec la solution Ensuite, utilisez une petite pince à épiler pour tenir la grille et rincez-la abondamment dans deux béchers contenant de l’eau distillée. Retirez délicatement l’excès d’eau avec du papier absorbant et placez les grilles dans une boîte à grille. Après 30 minutes, les coupes peuvent être examinées par microscopie électronique à transmission.

Cette micrographie électronique du globus pallidus interne du singe écureuil montre un matériel bien conservé après perfusion transcardiaque acroléine-PFA dans la technique de l’immunoperoxydase diaminobenzidine. Comme on le voit là-bas, la procédure permet de voir la gaine de myéline d’un gros axone, indiquée par la pointe de la flèche. Cette micrographie électronique du globus pallidus externe met en évidence les profils dendritiques, indiqués par la lettre d, les petits axones non myélinisés, indiqués par a, et les varicosités axonales, étiquetées av, peuvent être facilement identifiées.

Les flèches montrent un exemple de varicosité axonale établissant un contact synaptique symétrique avec le profil dendritique. Les éléments immunomarqués peuvent être facilement identifiés par leur cytoplasme ou leur axoplasme rempli d’un précipité DAB à forte densité d’électrons. Ici, une dendrite immunomarquée pour la choline acétyltransférase dans le GPi reçoit un contact synaptique d’une varicosité axonale non marquée.

Cette micrographie électronique montre un axone myélinisé dans la GPe avec une gaine de myéline relativement intacte dont l’axoplasme est immunomarqué pour la tyrosine hydroxylase. Cet exemple montre une varicosité axonale dans la GPi immunomarquée pour le transporteur de la sérotonine qui établit un contact synaptique symétrique avec une dendrite. Dans cet exemple, le précipité DAB tapisse la membrane plasmique et la surface externe des organites.

La varicosité axonale montrée ici a été observée dans le GPe et immunomarquée pour la tyrosine hydroxylase. Il s’agit d’un exemple de précipité DAB remplissant entièrement l’axoplasme, les vésicules synaptiques étant visibles mais plus difficiles à délimiter. Suite à cette procédure, d’autres méthodes, comme la double immunohistochimie de pré-intégration, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que les colocalisations de protéines ou de récepteurs au niveau synaptique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation de l’immunohistochimie de pré-intégration du tissu cérébral non primate, procéder à l’intégration dans de la résine époxy et ultracouper la région d’intérêt en sections de 80 micromètres d’épaisseur adaptées à la microscopie électronique.