Normalisation Né pour tomographie par fluorescence de projection optique pour l'imagerie cardiaque entier

Afin d’effectuer une tomographie par projection optique normalisée, l’échantillon est d’abord fixé et noyé dans un cylindre de tarière. L’échantillon est ensuite tourné le long d’un axe vertical, puis éclairé uniformément avec une longueur d’onde d’excitation, et la transmission est mesurée avec une optique adaptée C, CD. Le signal fluorescent à la longueur d’onde est mesuré en mode transillumination.

Les images fluorescentes et d’absorption acquises sont utilisées pour déterminer le rapport de naissance normalisé et reconstruire la distribution des quatre fluorés dans l’échantillon. Bonjour, je m’appelle Claudia Naone et je travaille aux Centers for Systems Biology du Mass General Hospital, Harvard Medical School. Je m’appelle Danielle Raki et je travaille à l’Institut d’imagerie biologique et médicale de l’Université technique de Munich et à l’Al Center de Munich.

Je m’appelle Giselle Fido. Je suis le directeur de Experimental su Co ici au C-M-I-C-S-B, Massachusetts General Hospital, Harvard Med School. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’imagerie ex vivo en temps réel d’un organe entier à l’aide de l’approche normalisée de Born pour la tomographie par projection optique.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la distribution des sondes moléculaires de fluorescence dans les organes creux. Alors commençons. Cette vidéo explique la procédure d’utilisation de la tomographie par projection optique pour imager des tissus ou des organes préparés, ainsi qu’une vidéo d’accompagnement.

Nous expliquons comment utiliser ce système pour effectuer une imagerie en accéléré sur des drosophiles en développement. La technique d’imagerie tridimensionnelle de la tomographie par projection optique nécessite une combinaison unique d’optiques et d’une platine rotative. Dans cette partie de la vidéo, la procédure d’imagerie sera élucidée.

Pour commencer, la source lumineuse primaire sert de source pour les mesures d’éclairage et d’absorption, et pour fournir une excitation fluorescente pour les mesures de fluorescence, la source lumineuse primaire est d’abord filtrée avec un filtre d’interférence passe-bande étroit. Ensuite, la lumière passe à travers un ensemble de filtres à densité neutre fixes et variables. Ceux-ci sont combinés à la présence d’un obturateur automatique pour contrôler la quantité de lumière sur l’échantillon et la maintenir suffisamment basse pour éviter tout blanchiment photo.

L’éclairage uniforme de l’échantillon est obtenu à l’aide d’un expanseur de faisceau et d’une lentille de télescope combinée avec une lentille diffusante. Enfin, les filtres d’interférence optiques passe-partout à bande étroite sont utilisés pour nettoyer optiquement la lumière de la source d’excitation. L’échantillon est immergé dans une solution clarifiante et maintenu en place pour l’imagerie à l’intérieur d’un tube de verre.

L’échantillon est tourné le long de son axe vertical au moyen d’un étage de rotation à grande vitesse avec une précision absolue de 0,05 degré. Trois contrôleurs manuels distincts permettent d’incliner et d’ajuster l’axe vertical de l’échantillon dans son plan orthogonal. Le signal absorbant est acquis en éclairage trans et est directement détecté par une caméra CCD.

Le signal fluorescent est filtré à travers un filtre d’interférence passe-bande étroite, couplé à un filtre passe-long, puis collecté avec un objectif télécentrique. Les téléobjectifs offrent l’avantage d’offrir des caractéristiques uniques qui les rendent idéaux. Pour la tomographie par projection optique.

La présence d’une butée d’ouverture située à l’intérieur de l’ensemble de l’objectif au point focal de l’objectif est essentielle. Il garantit que l’image se déplacera parallèlement à l’axe optique. Cela élimine la distorsion de perspective et fournit un grossissement égal sur de nombreux plans focaux dans la profondeur télécentrique.

Le segment vidéo suivant décrit une technique de préparation d’échantillons. S’ensuivra la méthodologie utilisée pour l’imagerie. La préparation de l’échantillon, du tissu ou de l’organe pour l’imagerie tomographique repose sur une déshydratation de l’échantillon à base d’éthanol qui évite le rétrécissement asymétrique.

Ce processus prend plusieurs jours. Dans cette vidéo, un cœur de souris est préparé, mais le protocole peut être appliqué à n’importe quel tissu ou organe. Nous ferons la démonstration de notre méthode d’imagerie par fluorescence en utilisant le cœur d’un animal ayant subi un infarctus contrôlé.

En d’autres termes, une perte d’apport sanguin entraînant une nécrose tissulaire évidente à l’avance. La souris a été injectée avec pro depuis six 80 inact capteur fluorescent signalant l’activité de la cathepsine dans la guérison. Anesthésie de la souris pour la perfusion et l’extrusion cardiaque à l’aide d’une injection intrapéritonéale de kétamine et de xylazine Puis injectez 50 unités d’héparine intrapéritonéale pour prévenir la coagulation.

Cinq minutes plus tard, effectuez la laparotomie longitudinale sur l’animal complètement anesthésié pour éliminer le sang. Tout d’abord, ouvrez la veine rénale gauche. Injectez maintenant lentement 20 millilitres de solution saline dans la veine cave inférieure.

La solution saline déplace le sang après avoir évacué tout le sang sous un microscope à dissection. Continuez à utiliser les méthodes d’utilisation standard pour ouvrir le thorax et retirer le cœur. Maintenant, fixez le cœur pendant huit heures dans 4 % de PFA à quatre degrés Celsius.

À partir de ce moment, les étapes de préparation des tissus doivent être effectuées dans l’obscurité pour éviter le blanchiment des agents de contraste fluorescents ou des protéines appliquées sur les tissus. Une fois la fixation terminée, rincez le PFA avec un rinçage de 15 minutes dans du PBS, le cœur nettoyé est ensuite incorporé dans une flaque de 0,8 % aros. Une fois que l’aros sèche, l’agarose est coupée autour du tissu pour former un bloc.

Ensuite, déshydratez le cœur crypté aros par une série en cinq étapes de trempage d’abord dans de l’éthanol à 20 %, puis des concentrations progressivement plus élevées d’éthanol, et enfin, de l’éthanol pur. Cette procédure de déshydratation permet d’éviter tout rétrécissement asymétrique de l’échantillon. Les quatre premiers bains dans de l’éthanol dilué doivent être effectués pendant une heure et le dernier bain dans de l’éthanol à 100 % doit être effectué pendant au moins 10 heures.

Une fois les traitements à l’éthanol terminés, mettez l’échantillon dans la solution claire de Murray jusqu’à ce que l’échantillon disparaisse, ce qui varie de quelques heures à plusieurs jours. Cette solution de clarification imite l’eau cellulaire et l’indice correspond aux membranes cellulaires, rendant ainsi le tissu transparent. L’éthanol à l’état de traces minimes peut être présent à la fin du processus de clarification, donnant lieu à plusieurs artefacts dans les reconstructions en raison du mouvement thermique de l’alcool dans la solution de clarification elle-même.

Afin d’éviter ce problème, un deuxième cycle de nettoyage est recommandé. Cela ne devrait pas prendre plus de quatre heures. Une fois terminé, l’échantillon est prêt pour la projection optique.

Tomographie à l’aide d’un ordinateur. La reconstruction de l’absorption optique en l’absence de diffusion de la lumière peut être obtenue à l’aide d’un algorithme commun de rétroprojection du radon filtré. Ce processus est analogue à la tomographie bidimensionnelle par rayons X.

Placez le bloc d’aéros dans la chambre d’imagerie transparente remplie de la solution de clarification. Montez maintenant la chambre sur la platine, éclairez l’échantillon avec un faisceau assemblé pour les mesures d’excitation et de transmission. Le choix de la source d’excitation est basé sur la protéine fluorescente ou l’agent de contraste d’imagerie moléculaire choisi.

Il est pratique d’aligner l’axe vertical de l’échantillon parallèlement à la colonne de pixels du CCD. Faites pivoter l’échantillon sur 360 projections en utilisant des incréments angulaires d’un degré, acquérez des images à chaque angle en éclairage trans aux longueurs d’onde d’absorption et de fluorescence. Le logiciel exécutant l’acquisition contrôle automatiquement l’obturateur sur la source lumineuse primaire pour éviter l’éclairage continu et réduire le blanchiment des photos d’échantillons.

L’obturateur est particulièrement important lorsque de longs temps d’intégration sont nécessaires pour créer une reconstruction 3D à partir des données d’absorption. Il suffit d’utiliser un algorithme de rétroprojection de radon filtré pour la reconstruction 3D à partir des images fluorescentes. D’autres contributions à l’absorption doivent être prises en compte, qui sont décrites dans le segment vidéo suivant.

Après avoir terminé les étapes requises pour une reconstruction par absorption, il reste quelques étapes à franchir pour réaliser une reconstruction par fluorescence. La reconstruction d’une carte optique en l’absence de diffusion de la lumière peut être obtenue à l’aide d’un algorithme commun de rétroprojection du radon filtré. Le processus est analogue à la tomographie bidimensionnelle par rayons X.

Lors de la reconstruction de la distribution de fluorescence. L’absorption variable dépendante de l’espace rend incorrecte l’utilisation du radon inverse pour le dos, projetant les images de fluorescence affectant gravement les distributions de protéines fluorescentes ou de sondes moléculaires fluorescentes obtenues et leur capacité de quantification. Chaque rayon de longueur d’onde d’excitation Lambda X qui est émis à partir d’une position de source arbitraire Xs, est atténué de façon exponentielle lorsqu’il traverse l’objet imagé.

Après excitation, le fluorochrome situé en position X, le rayonnement à la longueur d’onde d’émission est filtré et collecté par le pixel CCDs situé en position XD à l’aide du système de lentille d’imagerie Teleric. Bien que la fluorescence émise ne suive pas le même trajet que le rayon d’excitation, l’intensité enregistrée à chaque pixel se rapproche d’une projection de tous les fluorochromes excités le long de toute la zone focale correspondant à ce rayon d’excitation particulier. En raison de la télécentricité élevée du système, l’objet imagé est ensuite pivoté à 360 degrés et plusieurs mesures du détecteur de sources, UX à la longueur d’onde d’excitation et UFL à la longueur d’onde d’émission sont acquises avec la caméra CCD.

Ceux-ci sont ensuite combinés sous le champ de naissance normalisé UB défini comme le rapport des deux. La reconstruction de la distribution du chrome fluoré peut être facilitée en écrivant le modèle avant pour l’excitation et la propagation de la lumière d’émission, la fonction verte décrivant l’excitation. La propagation des rayons suit une loi de Lambert simple où moo A est la distribution d’absorption optique déterminée précédemment.

L’intensité lumineuse UX émise par la source en excès de position et mesurée par le détecteur à la position XD sur le C.C, D peut être écrite comme le produit de la fonction verte avec une constante B qui dépend du système. La répartition précise de l’intensité lumineuse d’excitation GX le long de chaque trajet de rayon peut alors être calculée. L’intensité de fluorescence UFL détectée au niveau du détecteur XD qui est stimulée par la lumière émise par la source Xs prend en compte la contribution de tous les theros qui ont été excités le long du trajet du rayon de X à xd.

Le modèle direct de notre problème d’imagerie peut alors être écrit ub ub, où alpha incorpore les constantes inconnues qui dépendent du système. Le modèle direct est ensuite discrétisé sur le maillage supposé et une inversion est effectuée pour extraire la distribution du fluorochrome, acquérir à la fois le signal d’émission et le signal fluorescent et utiliser l’algorithme de rétroprojection conventionnel pour reconstruire l’échantillon. Ici, des reconstructions de tomographie par projection optique à transmission et à fluorescence conventionnelle sont présentées.

Une reconstruction d’un seul plan du cœur est montrée à la fois en absorption et en fluorescence. La reconstruction de naissance normalisée est présentée et montre la différence dans la distribution du colorant au sein du cœur. Après la normalisation, nous venons de vous montrer comment être la configuration pour la tomographie par projection optique et comment supprimer les artefacts dus à l’absorption optique dans les reconstructions pour la tomographie à fluorescence.

Il est en fait très important de garder à l’esprit de nettoyer l’échantillon afin d’éliminer la contribution de la lumière diffusée, mais en même temps, il est également important d’équilibrer le processus de nettoyage afin de conserver autant que possible la contribution de la fluorescence. Une autre chose très importante à retenir lors de l’utilisation de cette approche est de calculer le rapport normalisé sur l’os qui est obtenu en divisant les images de fluorescence par celles d’absorption. Donc c’est tout.

Merci de vous joindre à notre expérience visualisée et bonne chance pour vos propres expériences.