Normalisation Né pour tomographie par fluorescence de projection optique pour l'imagerie cardiaque entier

Afin d'effectuer une tomographie par projection optique normalisée, l'échantillon est d'abord fixé et inclus dans un cylindre d'agarose. L'échantillon est ensuite fait pivoter autour d'un axe vertical et uniformément éclairé avec une longueur d'onde d'excitation, tandis que la transmission est mesurée à l'aide d'un capteur CCD et d'optiques adaptées. Le signal fluorescent à la longueur d'onde d'émission est mesuré en mode trans-illumination.

Les images fluorescentes et d'absorption obtenues sont utilisées pour déterminer le rapport de Born normalisé et reconstruire la distribution des fluoroquatreurs au sein de l'échantillon. Bonjour, je m'appelle Claudia Naone et je travaille aux Centers for Systems Biology du Mass General Hospital, de la Harvard Medical School. Je suis Danielle Raki de l'Institute for Biological and Medical Imaging de l'Université technique de Munich et d'Al Center Munich.

Je suis Giselle Fido. Je suis directrice des expériences sur Co au C-M-I-C-S-B, Hôpital général du Massachusetts, École de médecine de Harvard. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'imagerie en temps réel d'organes entiers ex vivo utilisant l'approche normalisée de Born pour la tomographie par projection optique.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la distribution de sondes moléculaires fluorescentes dans les organes creux. Commençons donc. Cette vidéo expliquera la procédure d'utilisation de la tomographie par projection optique pour l'imagerie de tissus ou d'organes préparés, ainsi qu'une vidéo accompagnante.

Nous expliquons comment utiliser ce système pour réaliser un imagerie en laps de temps sur des drosophiles en développement. La technique d'imagerie tridimensionnelle appelée tomographie par projection optique nécessite une combinaison unique d'optique et d'une platine rotative. Dans cet extrait de la vidéo, la procédure d'imagerie sera expliquée.

Pour commencer, la source lumineuse principale sert à la fois de source d'illumination et de mesure d'absorption, et pour fournir une excitation fluorescente lors des mesures de fluorescence, la source lumineuse principale est d'abord filtrée à l'aide d'un filtre interférentiel à bande passante étroite. Ensuite, la lumière traverse un ensemble de filtres neutres à densité fixe et variable. Ceux-ci sont combinés à la présence d'un obturateur automatique afin de contrôler la quantité de lumière atteignant l'échantillon et de la maintenir suffisamment faible pour éviter tout photoblanchiment.

L'illumination uniforme de l'échantillon est obtenue à l'aide d'un expander de faisceau et d'une lentille télescope glan combinée à une lentille diffuseur. Enfin, des filtres d'interférence optiques à bande passante étroite sont utilisés pour purifier optiquement la lumière de la source d'excitation. L'échantillon est immergé dans une solution de clarification et maintenu en place pour l'imagerie à l'intérieur d'un tube en verre.

L'échantillon est tourné selon son axe vertical à l'aide d'une platine de rotation haute vitesse ayant une précision absolue de 0,05 degré. Trois contrôleurs manuels distincts permettent d'incliner et d'ajuster l'axe vertical de l'échantillon dans son plan orthogonal. Le signal absorbant est acquis en transmission et détecté directement par une caméra CCD.

Le signal fluorescent est filtré à l'aide d'un filtre interférentiel à bande passante étroite, couplé à un filtre passe-long, puis collecté par un objectif télocentrique. Les objectifs télocentriques présentent l'avantage d'offrir des caractéristiques uniques qui les rendent idéaux pour la tomographie par projection optique.

La présence d'un diaphragme d'ouverture situé dans l'ensemble de la lentille au point focal de celle-ci est essentielle. Elle garantit que l'image se propagera parallèlement à l'axe optique. Cela élimine la distorsion en perspective et assure un grossissement uniforme sur plusieurs plans focaux au sein de la profondeur télécentrique.

Le prochain extrait vidéo décrit une technique de préparation des échantillons. Celle-ci sera suivie par la méthodologie utilisée pour l'imagerie. La préparation de l'échantillon de tissu ou d'organe pour l'imagerie tomographique repose sur une déshydratation à base d'éthanol qui évite le rétrécissement asymétrique.

Ce processus prend plusieurs jours pour être completé. Dans cette vidéo, un cœur de souris est préparé, mais le protocole peut être appliqué à tout tissu ou organe. Nous démontrerons notre méthode d'imagerie par fluorescence en utilisant le cœur d'un animal ayant subi un infarctus contrôlé.

En d'autres termes, une perte de l'apport sanguin conduisant à une nécrose tissulaire évidente en phase avancée. La souris a été injectée avec un capteur fluorescent inactif pro depuis six 80, qui signale l'activité des cathepsines durant la cicatrisation. Anesthésier le myocarde de la souris pour la perfusion et l'extrusion cardiaque à l'aide d'une injection intrapéritonéale de kétamine et de xylazine, puis injecter 50 unités d'héparine par voie intrapéritonéale afin de prévenir la coagulation.

Cinq minutes plus tard, réalisez une laparotomie longitudinale sur l'animal entièrement anesthésié afin d'éliminer le sang. Ouvrez d'abord la veine rénale gauche. Injectez maintenant lentement 20 millilitres de solution saline dans la veine cave inférieure.

Le sérum physiologique remplace le sang après avoir éliminé tout le sang au microscope stéréoscopique. Poursuivez en utilisant les méthodes opératoires standard pour ouvrir la cavité thoracique et retirer le cœur. Fixez ensuite le cœur pendant huit heures dans du PFA à 4 % à quatre degrés Celsius.

À partir de ce moment, les étapes de préparation du tissu doivent être effectuées à l'abri de la lumière afin d'éviter la décoloration des agents de contraste fluorescents ou des protéines appliqués au tissu. Lorsque la fixation est terminée, éliminer le PFA par un rinçage de 15 minutes dans du PBS, puis implanter le cœur nettoyé dans une flaque d'aros à 0,8 %. Une fois l'aros séché, l'agarose est découpée autour du tissu pour former un bloc.

Ensuite, déshydratez le cœur crypté aros au moyen d'une série de cinq étapes consistant à tremper d'abord dans de l'éthanol à 20 %, puis dans des concentrations d'éthanol progressivement plus élevées, et enfin dans de l'éthanol pur. Cette procédure de déshydratation permet d'éviter tout retrait asymétrique de l'échantillon. Les quatre premiers bains dans de l'éthanol dilué doivent être effectués pendant une heure et le bain final dans de l'éthanol à 100 % doit être effectué pendant au moins 10 heures.

Une fois les traitements à l'éthanol terminés, placez l'échantillon dans la solution de clarification de Murray jusqu'à ce que l'échantillon devienne transparent, ce qui peut prendre de quelques heures à plusieurs jours. Cette solution de clarification imite l'eau cellulaire et présente un indice de réfraction compatible avec celui des membranes cellulaires, rendant ainsi le tissu transparent. De faibles traces d'éthanol peuvent subsister à la fin du processus de clarification, provoquant plusieurs artefacts dans les reconstructions en raison du mouvement thermique de l'alcool au sein de la solution elle-même.

Afin d'éviter ce problème, un second cycle de clarification est recommandé. Celui-ci ne devrait pas prendre plus de quatre heures. Une fois terminé, l'échantillon est prêt pour la projection optique.

Tomographie assistée par ordinateur. La reconstruction de l'absorption optique en l'absence de diffusion de la lumière peut être obtenue à l'aide d'un algorithme courant de rétroprojection filtrée de Radon. Ce processus est analogue à la tomographie computed en rayons X en deux dimensions.

Placez le bloc d'aéros dans la chambre d'imagerie transparente remplie de la solution de clarification. Montez maintenant la chambre sur la platine et éclairez l'échantillon avec un faisceau collimaté pour les mesures d'excitation et de transmission. Le choix de la source d'excitation dépend de la protéine fluorescente ou de l'agent de contraste d'imagerie moléculaire sélectionné.

Il est pratique d'aligner l'axe vertical de l'échantillon parallèlement à la colonne de pixels du CCD. Faites tourner l'échantillon selon 360 projections avec des incréments angulaires d'un degré, et acquérez des images à chaque angle en transmission, aux longueurs d'onde d'absorption et de fluorescence. Le logiciel qui gère l'acquisition contrôle automatiquement l'obturateur de la source lumineuse principale afin d'éviter une illumination continue et de réduire le photoblanchiment de l'échantillon.

L'obturateur est particulièrement important lorsqu'on a besoin de temps d'intégration longs pour créer une reconstruction 3D à partir des données d'absorption. Utilisez simplement un algorithme de rétroprojection de Radon filtrée pour la reconstruction 3D à partir des images de fluorescence. D'autres contributions d'absorption doivent être prises en compte, ce qui est décrit dans le prochain segment vidéo.

Après avoir effectué les étapes nécessaires à une reconstruction d'absorption, quelques étapes supplémentaires sont requises pour réaliser une reconstruction fluorescente. La reconstruction d'une carte optique en l'absence de diffusion de la lumière peut être obtenue à l'aide d'un algorithme courant de rétroprojection de Radon filtré. Ce processus est analogue à la tomographie computed en deux dimensions par rayons X.

Lors de la reconstruction de la distribution de fluorescence, les variations spatialement dépendantes de l'absorption rendent incorrecte l'utilisation de la transformée inverse de Radon pour la rétroprojection des images de fluorescence, ce qui affecte gravement les distributions obtenues des protéines fluorescentes ou des sondes moléculaires fluorescentes ainsi que leur capacité de quantification. Chaque rayon à la longueur d'onde d'excitation Lambda X, émis depuis une position arbitraire de la source Xs, est atténué de manière exponentielle lors de son passage à travers l'objet imageé.

Après excitation du fluorochrome situé à la position X, le rayonnement à la longueur d'onde d'émission est filtré et recueilli par le pixel du CCD situé à la position XD à l'aide du système d'imagerie optique Teleric. Bien que la fluorescence émise ne suive pas le même trajet que le rayon d'excitation, l'intensité enregistrée par chaque pixel correspond approximativement à une projection de l'ensemble des fluorochromes excités le long de toute la zone focale correspondant à ce rayon d'excitation particulier. En raison de la forte télécentricité du système, l'objet imageé est ensuite tourné de 360 degrés et plusieurs mesures source-détecteur, UX à la longueur d'onde d'excitation et UFL à la longueur d'onde d'émission, sont acquises à l'aide de la caméra CCD.

Ils sont ensuite combinés sous le champ de Born normalisé UB défini comme le rapport des deux. La reconstruction de la distribution du fluorochrome peut être facilitée en écrivant le modèle direct pour la propagation de la lumière d'excitation et d'émission, la fonction de Green décrivant l'excitation. La propagation des rayons suit une simple loi de Beer-Lambert où moo A est la distribution d'absorption optique déterminée précédemment.

L'intensité lumineuse UX émise par la source située en position excès et mesurée par le détecteur en position XD sur le C.C, D peut s'écrire comme le produit de la fonction verte par une constante B dépendant du système. La distribution précise de l'intensité lumineuse d'excitation GX le long de chaque trajet de rayon peut alors être calculée. L'intensité de fluorescence UFL détectée au détecteur XD, stimulée par la lumière émise par la source Xs, prend en compte la contribution de tous les éléments excités le long du trajet du rayon allant de X à xd.

Le modèle direct de notre problème d'imagerie peut alors s'écrire ub ub, où alpha intègre les constantes inconnues dépendant du système. Le modèle direct est ensuite discrétisé sur le maillage supposé et une inversion est effectuée pour extraire la distribution du fluorochrome, acquérir à la fois le signal de transmission et le signal fluorescent, puis utiliser l'algorithme classique de rétroprojection pour reconstruire l'échantillon. Ici, des reconstructions en tomographie optique de projection en transmission et en fluorescence conventionnelle sont présentées.

Une reconstruction d'un plan unique du cœur est présentée en absorption et en fluorescence. La reconstruction selon la méthode de Born normalisée est affichée et montre la différence dans la distribution du colorant au sein du cœur. Après la normalisation, nous venons de vous montrer comment configurer la tomographie par projection optique et comment éliminer les artefacts dus à l'absorption optique dans les reconstructions de la tomographie de fluorescence.

Il est en effet très important de garder à l'esprit qu'il faut clarifier l'échantillon afin d'éliminer la contribution de la lumière diffusée, mais en même temps, il est également essentiel d'équilibrer le processus de clarification afin de conserver, autant que possible, la contribution de la fluorescence. Une autre chose très importante à retenir lors de l'utilisation de cette approche est de calculer le rapport normalisé par rapport à l'os, obtenu en divisant les images de fluorescence par les images d'absorption. Voilà tout.

Merci de nous avoir suivis dans cette expérience visualisée et bonne chance dans vos propres expériences.