Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris avec un facteur de transcription Quatre, doxycycline inductible système de transduction lentiviraux

Bonjour, je m’appelle Brad Hamilton. Je suis dans le département de recherche et développement ici à STEM Gen. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour générer des cellules souches pluripotentes induites à partir de fibroblastes embryonnaires de souris.

Cette procédure peut être utilisée à la fois pour générer des cellules souches pluripotentes induites et pour étudier le processus de reprogrammation. Alors commençons. Commencez par ensemencer des fibroblastes embryonnaires de souris, ou cellules de méthamphétamine, dans une boîte enrobée de gélatine de 15 centimètres à une densité de quatre fois 10 des cinquièmes cellules par boîte.

Ajoutez maintenant 30 millilitres de milieu de culture de méthamphétamine et incubez les cellules pendant deux jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à environ 80 %. Une fois terminé, l’incubation aspire le milieu et ajoute 30 millilitres de croissance. Milieu complété par un lentivirus concentré.

Secouez doucement le plat pour assurer une répartition uniforme du fluide. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec transduction virale terminée. Passons à la reprogrammation induite par la doxycycline.

Pour commencer à reprogrammer 20 à 24 heures après la transduction, la trypsine est les cellules transduites et les centrifuge à 200 G pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez soigneusement le milieu de la pastille cellulaire et remettez les cellules en suspension dans le milieu de croissance. Une fois les graines en suspension, les mès transduits à une concentration appropriée pour la taille de la boîte de culture cellulaire que vous utilisez.

Ici, nous utilisons 2,5 fois 10 à la cinquième cellule par boîte de 10 centimètres pour les expériences de reprogrammation d’efficacité et l’isolement des colonies IPS et deux fois 10 à la quatrième cellule par puits dans quatre plaques de puits pour les expériences d’immunochimie. Pour surveiller l’efficacité de la transduction, incubez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. À ce stade, les cellules peuvent être congelées dans de l’azote liquide pour une analyse future si nécessaire.

Le lendemain, aspirez le milieu et remplacez-le par un milieu de croissance frais qui a été complété par de la doxycycline jusqu’à une concentration finale de deux microgrammes par millilitre. Nous incluons un témoin négatif contenant un milieu sans doxycycline. Enfin, incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Nous avons entamé le processus de reprogrammation. En général. Les colonies de cellules souches pluripotentes seront suffisamment grandes pour être isolées après 16 à 22 jours.

Avant de démontrer cette procédure, nous devons d’abord vérifier l’efficacité de la transduction à l’aide de la chimie pour déterminer l’efficacité de la transduction. Des tests d’immunochimie sont effectués sur les cellules replaquées dans quatre plaques de puits 48 heures après l’induction de la doxycycline. Tous les volumes énumérés dans ce protocole doivent être ajustés en fonction de la taille de la plaque de culture cellulaire, en commençant par laver les cellules doucement.

Une fois que le PBS ne contient pas d’ions magnésium ou calcium, fixez les cellules avec 500 microlitres de 4 % d’aldéhyde paraforme dans du PBS pendant 15 minutes. À température ambiante, lavez à nouveau doucement les cellules deux fois avec du PBS. Ensuite, permutez les cellules en ajoutant 500 microlitres de glace 0,2 % Tween 20 dans PBS incuber pendant 10 minutes à température ambiante.

Après avoir lavé les cellules deux fois de plus. Ajouter 200 microlitres de tampon de blocage pendant une heure à température ambiante pour bloquer la liaison des anticorps non spécifiques. Ajoutez maintenant 200 microlitres de l’anticorps primaire souhaité.

Ici, nous utilisons les marqueurs de pluripotence T 4K LF quatre, SOX deux et cmic. Incuber les cellules pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain. Après avoir lavé doucement les cellules deux fois avec du PBS, incubez-les avec 200 microlitres d’anticorps secondaires pendant une heure à température ambiante, en protégeant les plaques de la lumière.

Ici, nous utilisons les anticorps secondaires appropriés conjugués à des fluoro-quatre pour la visualisation, à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée après l’incubation. Lavez les cellules deux fois de plus, puis ajoutez du DPI et incubez à nouveau pendant 10 minutes pour visualiser les noyaux. Enfin, après un dernier lavage, ajoutez antifa aqua mount avant d’imager les cellules avec le microscope à fluorescence inversée pour déterminer l’efficacité de la transduction.

Commencer l’isolement et l’expansion des cellules souches pluripotentes. Après avoir lancé le processus de reprogrammation, surveillez les cultures tous les jours et remplacez le milieu approprié toutes les 48 heures. Nous utilisons un milieu supplémenté en doxycycline pour cultiver les cellules pendant les 12 premiers jours, puis nous retirons ensuite la doxycycline du milieu.

Les colonies de cellules souches pluripotentes induites ou IPS sélectionnées manuellement pour l’expansion sont la doxycycline. Les cellules indépendantes doivent être surveillées quotidiennement pour détecter des changements morphologiques indiquant le processus de reprogrammation. Chaque expérience sera différente, mais les colonies sont généralement assez grandes pour être isolées entre 16 et 22 jours après l’induction de la SD, la veille du début du processus d’isolement et de reprogrammation des colonies par la trypsine.

Préparez une plaque de 24 puits en ensemenceant une couche nourricière irradiée aux rayons gamma de mets à une densité de cinq fois 10 à la quatrième cellule par puits. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, choisissez manuellement chaque colonie IPS et essayez de l’aniser pour dissocier les agrégats cellulaires, reconstituer les cellules IPS dans un milieu de cellules souches embryonnaires de souris dans les puits individuels de la plaque de 24 puits précédente, incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Changement de support toutes les 24 heures. Surveillez quotidiennement les colonies IPS pour la croissance et la fluorescence de la GFP. Nous avons incubé nos cultures pendant six jours avant de les emballer sur des plaques à quatre puits pour l’analyse de la pluripotence.

Déterminez quels puits de la plaque à 24 roues expriment uniformément la GFP Les puits qui ont une bonne expression de la GFP peuvent être déclenchés, inisés et passés de un à huit dans quatre plaques de puits qui ont été précédées de couches d’alimentation irradiées aux rayons gamma. Ces plaques peuvent ensuite être utilisées pour l’analyse ICC de la pluripotence afin de commencer l’analyse de la pluripotence. Lavez doucement les cellules deux fois avec du PBS ne contenant pas d’ions magnésium ou calcium.

Ajouter 0,5 millilitres par puits de glace 0,2 % entre 20 dans le PBS et incuber les cellules pendant 10 minutes. Après trois autres lavages en bloc PBS, liaison non spécifique avec 200 microlitres de tampon de blocage pendant une heure à température ambiante. Ajoutez maintenant 200 microlitres de l’anticorps primaire souhaité.

Ici, nous avons utilisé SSEA un nanog et OCT quatre pour incuber les cellules pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Après avoir lavé doucement les cellules deux fois, incubez-les avec 200 microlitres d’anticorps secondaires pendant une heure à température ambiante, en les gardant à l’abri de la lumière. Ici, nous utilisons les anticorps secondaires appropriés conjugués à la force fluorée pour la visualisation, en utilisant un microscope à fluorescence inversée après deux autres lavages, en ajoutant du DPI et en incubant les cellules pendant 10 minutes.

Maintenant, après un dernier lavage, ajoutez antifa aqua mount avant d’imager les cellules avec le microscope à fluorescence inversée. Les colonies IPS peuvent également être analysées pour l’activité de la phosphatase alcaline à l’aide de kits disponibles dans le commerce. L’ensemble de lentivirus TF de souris inductible par stem gent docs peut être utilisé pour reprogrammer mes en cellules IPS après transduction de l’expression MES des facteurs de transcription.

T quatre, SOX deux, KLF quatre et seic peuvent être détectés dans les cellules traitées avec la doxycycline, mais peu ou pas d’expression peut être détectée dans les cellules non traitées. Les changements morphologiques progresseront au fil du temps pour générer des colonies plus grandes et plus semblables à des cellules ES avec des bords de colonie définis et une croissance tridimensionnelle. Lorsque docs est retiré, il y a une inversion notable de la morphologie cellulaire pour certaines colonies de type cellules ES.

Cependant, de nombreuses colonies ont conservé leur morphologie IPS. Ces colonies IPS se manifestent lorsqu’elles sont cueillies et passées. Expression typique du marqueur de pluripotence de la phosphatase alcaline, nano T quatre et SSEA un.

Le type de cellules de méthamphétamine utilisé dans cette expérience exprimait la GFP à partir du locus endogène nag. Lorsqu’elle est reprogrammée à l’état de pluripotence, l’expression de la GFP peut donc être utilisée comme indicateur préliminaire d’une reprogrammation réussie. Nous venons de vous montrer comment induire la reprogrammation de fibroblastes embryonnaires de souris pour induire des cellules souches pluripotentes à l’aide d’un système antiviral inductible à quatre facteurs de transcription doxycycline.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que lors de la conception d’expériences de reprogrammation, plusieurs variables doivent être prises en compte pour optimiser l’efficacité de la reprogrammation. Tout d’abord, il est possible de modifier le rapport entre le virus actif et la cellule cible au cours de l’étape de l’infection primaire afin d’augmenter ou de diminuer l’efficacité de la transduction, affectant ainsi le nombre de virus intégrés dans la population cellulaire cible. Deuxièmement, l’ajustement de la durée d’exposition des cellules aux docs peut affecter le nombre de colonies IPS générées.

Troisièmement, la capacité proliférative des cellules cibles peut avoir un impact sur la reprogrammation, car les cellules, qui sont en croissance et en division actives, sont plus susceptibles d’être reprogrammées. Enfin, lors de la modification du protocole pour différents nombres de cellules ou des boîtes de culture de tissus de différentes tailles, il est recommandé que le nombre de cellules cibles soit ajusté proportionnellement à la surface de la boîte de culture. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.