Reprogrammation des cellules somatiques humaines dans cellules souches pluripotentes induites (CISP) Utilisation vecteur rétroviral avec la GFP

L’objectif global de cette procédure est de générer des cellules IPS humaines via la surexpression médiée par un rétrovirus d’OCT quatre, SOX 2K LF quatre et M avec un système rapporteur GFP. Ceci est accompli en ajoutant d’abord la quantité appropriée de rétrovirus exprimant la GFP individuelle. Ensuite, les cellules infectées par le virus exprimant la GFP sont transférées dans des plaques recouvertes de gélatine à 0,1 % avec des fibroblastes embryonnaires de souris.

La troisième étape de la procédure consiste à remplacer le milieu par un milieu de culture de cellules souches embryonnaires humaines. Enfin, les colonies IPS réduites au silence par la GFP qui présentent une morphologie similaire à celle des cellules souches embryonnaires humaines sont isolées. En fin de compte, les résultats montrent l’expression de marqueurs pluripotents endogènes par coloration immunofluorescente et R-T-Q-P-C-R.

Le principal avantage de cette technique de méthode existante comme la coloration du mode de vie avec un marqueur de surface pluripotent et l’observation d’un changement morphologique est l’iPad désirable. Les colonies cellulaires peuvent être facilement isolées en utilisant la perte d’expression de la GFP comme marqueur pour les cellules pluripotentes pour commencer la culture. Fibroblastes humains dans un milieu de fibroblastes un jour avant la plaque d’infection, une fois 10 à cinquième, fibroblastes humains dans un puits d’une plaque à six puits le lendemain, aspirez le milieu pour éliminer les cellules mortes et ajoutez deux millilitres de milieu de fibroblastes frais avec cinq microgrammes par millilitre de sulfate de protamine.

Ensuite, ajoutez soigneusement la quantité appropriée de chaque virus exprimant la GFP correspondant à une multiplicité d’infection de cinq. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit un jour après l’infection. Retirez le nettoyant surnageant viral trois fois avec deux millilitres de PBS.

Ajoutez ensuite deux millilitres, fibroblaste moyen trois jours après l’infection. Vérifiez la fluorescence de la GFP et remplissez le puits avec deux millilitres. Le lendemain, le milieu fibroblastique plaque une fois 10 à 14 par centimètre carré de cellules irradiées de souris, de fibroblastes embryonnaires ou de méthamphétamine dans un milieu fibroblaste sur une boîte de Pétri de 10 centimètres recouverte de 0,1 % de gélatine.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, détachez les fibroblastes humains infectés avec un millilitre de 0,05 % de tripsin EDTA pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius et centrifugez pendant cinq minutes à 200 G.Remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de milieu de fibroblastes et rejouez les cellules sur de la gélatine pré-enrobée à 0,1 % avec mfs. 24 heures plus tard.

Remplacer le milieu par un milieu de culture HESC et changer le milieu tous les jours. Les colonies de type ESC commenceront à apparaître 20 à 27 jours après l’infection après l’apparition de colonies de type ESC sous un microscope à fluorescence. Vérifiez l’absence de fluorescence de la GFP dans une colonie qui présente une morphologie similaire à celle des CSH.

À l’aide d’une pipette de 10 microlitres. Choisissez des colonies IPSC individuelles et placez-les dans un puits d’une plaque à 12 puits enrobée de gélatine et de méthamphétamine et complétée par un milieu HESC. Changez le milieu de passage quotidien des cellules en lavant la plaque avec un millilitre de DMM F 12.

Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de collagénase et incubez pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Lavez les cellules deux fois avec DM A MF 12. Ensuite, ajoutez deux millilitres de milieu HESC frais.

Ensuite, utilisez un élévateur de cellules pour briser les colonies en petits morceaux et détacher les cellules restantes de la plaque. Transférez les morceaux de colonies remis en suspension dans un puits d’une gélatine et de six enrobés de MEF. Bien plaquer et incuber à 37 degrés Celsius pendant deux jours.

Vérifier les cellules par immunofluorescence. Lavez-les trois fois avec du PBS et fixez-les avec du paraldéhyde à 4 % pendant 20 minutes à température ambiante. Lavez doucement les cellules trois fois avec du PBS et perforcez-les avec 0,2 % de tritton X 100 dans du PBS pendant 30 minutes.

Bloquer la liaison non spécifique en incubant les cellules avec 3 % de BSA dans du PBS pendant deux heures. Ensuite, incubez les cellules avec l’anticorps primaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du PBS et incubez-les avec des anticorps secondaires pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité.

Lavez les cellules trois fois avec du PBS lors du dernier lavage. Ajouter le dappy et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Imagez les cellules à l’aide d’un microscope fluorescent pour des données quantitatives en temps réel.

ARN total d’isolat PCR à partir d’IPC humaines dérivées de fibroblastes humains. À l’aide d’un kit d’isolement d’ARN. Synthétiser l’ADNc du premier brin à l’aide de la transcriptase inverse.

Ensuite, utilisez-le comme modèle pour la QPCR afin de détecter les gènes de pluripotence. Des fibroblastes humains, BJ un qui ont été infectés par un cocktail de rétrovirus porteurs d’OCT quatre, SOX deux, KLF quatre, et Mick montrent ici les changements morphologiques observés lors de la reprogrammation à partir du cinquième jour. Aujourd’hui, 10, 14 et 21, les cellules commencent à montrer la morphologie de type HESC après 21 jours, et les IPC sont reconnues par fluorescence GFP.

Les cellules souches pluripotentes telles que les ESC et les IPC expriment la machinerie moléculaire pour réprimer l’expression des gènes proviraux. Cependant, les vecteurs rétroviraux utilisés ici expriment la GFP avec des gènes de reprogrammation par LTR rétroviraux. Ainsi, les cellules exprimant en continu la GFP sont considérées comme exprimant des transgènes sans silençage génique proviral comme on le voit ici fidèlement, les colonies IPSC reprogrammées qui acquièrent le réseau moléculaire de pluripotence montrent l’absence d’expression de la GFP.

Cette figure montre l’analyse immunohistochimique de colonies dérivées de fibroblastes de Detroit 5 51 avec des anticorps contre TRA 180 1, TRA un 60 SSEA quatre T quatre et nano comme on peut le voir avec succès. Les IPC reprogrammés expriment tous ces marqueurs. De plus, un R-T-P-C-R quantitatif a été réalisé pour analyser l’expression des gènes et a révélé que T quatre SOX deux, KLF quatre M et nano étaient significativement augmentés par rapport aux cellules fibroblastiques parentales, mais proportionnels à ceux des CSH H neuf.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’infecter le virus, d’identifier et de ramasser les cellules IPA entièrement programmées pour les lèvres à l’aide de la microscopie fluorescente.