Name: Reprogrammation des cellules somatiques humaines dans cellules souches pluripotentes induites (CISP) Utilisation vecteur rétroviral avec la GFP (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Découvrez la reprogrammation de fibroblastes humains en cellules souches pluripotentes induites par vecteur rétroviral avec GFP. Cette méthode permet d'identifier facilement les colonies iPSC par perte de fluorescence.

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Ce travail a été financé par l&#39;École de médecine de Yale et de bourses de recherche santé de l&#39;enfant à partir de Charles Hood Foundation.

1. Reprogrammation par rétrovirus exprimant les facteurs de reprogrammation <ol><li> Des fibroblastes humains sont cultivées dans un milieu des fibroblastes (10% de FBS dans DMEM avec Pen / Strep). </li><li> Un jour avant l&#39;infection, la plaque de 1x10 5 fibroblastes humains dans un puits d&#39;une plaque à 6 puits. </li><li> Aspirer à moyen et à éliminer les cellules mortes et ajoutez 2 ml de milieu de fibroblastes frais. Ajouter du sulfate de protamine à une concentration finale de 5 ng / ml. </li><li> Soigneusement ajouter la quantité appropriée de chacun des virus GFP-exprimer correspondant à une multiplicité d&#39;infection (MOI) 5 5. </li><li> Un jour après l&#39;infection, retirer le surnageant viral, laver trois fois avec 2 ml de PBS, puis ajoutez les 2 moyennes des fibroblastes ml. </li><li> Trois jours après l&#39;infection, vérifier la fluorescence de la GFP et de reconstituer le puits avec 2 moyennes des fibroblastes ml. </li><li> Quatre jours après l&#39;infection, la plaque de 1x10 cellules nourricières 4 / cm 2 de fibroblastes embryonnaires irradiés (MEF) dans le milieu des fibroblastes SUR UNE10-cm boîte de Pétri revêtues de 0,1% de gélatine. Incuber à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> Cinq jours après l&#39;infection, se détacher des fibroblastes humains infectés avec 1 ml 0,05% typsin / EDTA pendant 5 minutes à 37 ° C, et centrifuger pendant 5 minutes à 200 g. Aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules avec 10 ml de milieu de fibroblastes. Transférer les cellules dans un pré-enduit la plaque de 10 cm. </li><li> Après 24 heures, remplacer le milieu de milieu de culture des CSEh (20% Knock-Out de remplacement du sérum, DMEM/F12, 0,1 ml non-acides aminés essentiels, 4 ng / ml de bFGF, Pen / Strep / glutamate, le bêta-merceptoethanol). Changer le support quotidien. ESC-like colonies commencent à apparaître 20 à 27 par jour après l&#39;infection. </li></ol> 2. L&#39;isolement et l&#39;expansion des CSPi <ol><li> Sous un microscope à fluorescence, vérifier l&#39;absence de fluorescence de la GFP dans une colonie qui montre une morphologie similaire à CSEh. </li><li> En utilisant une pipette de 10 ul, choisissez individuels colonies IPSC et les placer dans un puits d&#39;une gélatine et MEF-coaTed de 12 puits de plaque et complétée avec le milieu de CSEh. Changer le milieu tous les jours. </li><li> Pour repiquage, laver la plaque avec 1 ml de DMEM/F12, puis ajoutez 0,5 ml de collagénase, et incuber pendant 10 minutes à 37 ° C. </li><li> Laver les cellules deux fois avec DMEM/F12. </li><li> Ajouter 2 ml de milieu CSEh frais. L&#39;utilisation d&#39;un lève-cellule, de briser les colonies en petits morceaux et détacher les cellules restantes de la plaque. </li><li> Transférer les morceaux de remises en suspension des colonies dans un puits d&#39;une gélatine et MEF-enduit des plaques 6 puits. </li></ol> 3. Analyse par immunofluorescence de marqueurs pluripotentes <ol><li> Laver les cellules trois fois avec du PBS et le fixer avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Lavez délicatement les cellules trois fois avec du PBS et perméabiliser avec 0,2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 30 min. </li><li> Bloquer non-spécifiques de liaison par incubation des cellules avec de la BSA 3% dans du PBS pendant deux heures. </li><li> Incuber les cellules avec l&#39;anticorps primaire nuit à 4 ° C. </li> &lt;li&gt; Laver les cellules trois fois avec du PBS et laisser incuber les cellules avec l&#39;anticorps secondaire spécifique pendant une heure à température ambiante, le blindage de la lumière. </li><li> Laver les cellules trois fois avec du PBS et ajouter DAPI lors du dernier rinçage suivie d&#39;une incubation à température ambiante pendant 5 minutes. </li><li> Détecter la coloration avec un microscope à fluorescence. </li></ol> 4. Quantitative en temps réel PCR pour les marqueurs pluripotentes <ol><li> Isoler l&#39;ARN total à partir des CSPi humaines dérivées de fibroblastes humains en utilisant le kit RNeasy de Qiagen. </li><li> Synthétiser l&#39;ADNc de premier brin en utilisant la transcriptase inverse SuperScript II. </li><li> Effectuer qPCR pour détecter les gènes de pluripotence en utilisant des amorces précédemment rapportés. 6 </li></ol> 5. Les résultats représentatifs <ol><li> Changement morphologique lors de la reprogrammation Nous fibroblastes humains infectés BJ1 et Detroit 551 avec un cocktail de rétrovirus transportant OCT4, SOX2, KLF4 et MYC,et étaient capables de détecter des changements morphologiques lors de la reprogrammation (Figure 1). Vingt-et-un jours après l&#39;infection, nous reconnaissons de petites colonies iPSC par leur morphologie CSEh. En outre, nous reconnaissons CSPi par la fluorescence de la GFP. Les cellules souches pluripotentes, comme les CES et iPSCs, expriment la machinerie moléculaire de réprimer l&#39;expression du gène proviral 7-9. Notre unique vecteur rétroviral exprime la GFP en collaboration avec la reprogrammation des gènes par LTR rétroviral. Ainsi, les cellules exprimant la GFP en continu sont considérés à exprimer des transgènes sans gene silencing proviral. Fidèlement reprogrammées colonies iPSC qui acquièrent le réseau pluripotence moléculaire montrent l&#39;absence d&#39;expression de GFP (Figure 2) 10. </li><li> Caractérisation de la pluripotence des CSPi humaines Nous avons analysé colonies issues de Detroit-551 fibroblastes par l&#39;intermédiaire d&#39;immunohistochimie avec Tra-1-81, Tra-1-60, AESS-4, SSEA-3, et des anticorps OCT4 NANOG ( <strong&gt; Tableau 2). CSPi succès reprogrammées exprimer l&#39;ensemble de ces marqueurs (figure 3A). Nous avons également analysé l&#39;expression génique par l&#39;intermédiaire RT-PCR quantitative d&#39;analyse. Nous avons observé que l&#39;expression de OCT4, SOX2, KLF4, MYC et NANOG a été significativement augmenté par rapport à des cellules de fibroblastes parentaux, mais en rapport avec celle de CSEh H9 (figure 3B). </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig1.jpg" /> Figure 1. Les modifications morphologiques des rétrovirus-infectés fibroblastes humains. (AD) Progressive changement morphologique dans les colonies de Detroit-551 fibroblastes infectés avec des facteurs de reprogrammation. Jour 5 (A), Jour 10 (B), Jour 14 (C), jour 21 (D). Les cellules montrent la morphologie de CSEh comme après 21 jours. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig2.jpg" /> Figure 2. Représentant GFP fluorescente expression dans les cellules subissant une reprogrammation. </strong&gt; BJ et Detroit 551 fibroblastes ont été infectées par le rétrovirus exprimant quatre facteurs de reprogrammation 4, et incubées dans un milieu CSEh pendant quatre semaines. Fibroblastes BJ (A, B) et Detroit 551 (C, D) montrent similaires morphologique. De jour 21, les colonies GFP négatifs commencent à se former, qui représentent les CSPi de bonne foi 10. (E, F) montrent transformé Detroit 551 cellules qui n&#39;ont pas subi une reprogrammation appropriée. (A, C, E) des colonies sous vue contraste de phase. (B, D) correctement reprogrammé les cellules qui montrent le silence GFP. (F) expression de la GFP lumineux de la colonie transformée. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig3.jpg" /> Figure 3. Caractérisation des humains cellules souches pluripotentes induites. (A) de l&#39;homme des colonies de cellules iPS-551-K1 expriment des marqueurs communs aux cellules pluripotentes. Coloration DAPI indique le contenu de la cellule total par domaine. (B) quantitative en temps réel-PCR (RT-qPCR) pour l&#39;expression de OCT4, SOX2, KLF4, MYC dans f parentaleibroblast, 551-iPS-K1 CSPi et H9 cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). Les données ont été normalisées par rapport gène de ménage β-actine et tracées par rapport au niveau d&#39;expression dans les cellules de fibroblastes parentaux 4.

<ol><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 3, 1180-1186 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Hotta, A., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vector+silencing+during+iPS+cell+induction%3A+an+epigenetic+beacon+that+signals+distinct+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Retroviral vector silencing during iPS cell induction: an epigenetic beacon that signals distinct pluripotent states.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 105, 940-948 (2008).</li>
<li>Matsui, T., Leung, D., Miyashita, H., Maksakova, I. A., Miyachi, H., Kimura, H., Tachibana, M., Lorincz, M. C., Shinkai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proviral+silencing+in+embryonic+stem+cells+requires+the+histone+methyltransferase+ESET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proviral silencing in embryonic stem cells requires the histone methyltransferase ESET.</a> Nature. 464, 927-931 (2010).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+use+ZFP809+to+silence+retroviral+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells use ZFP809 to silence retroviral DNAs.</a> Nature. 458, 1201-1204 (2009).</li>
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<li>Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin,, Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Ban, H., Nishishita, N., Fusaki, N., Tabata, T., Saeki, K., Shikamura, M., Takada, N., Inoue, M., Hasegawa, M., Kawamata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM28+mediates+primer+binding+site-targeted+silencing+of+murine+leukemia+virus+in+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM28 mediates primer binding site-targeted silencing of murine leukemia virus in embryonic cells.</a> Cell. 131, 46-57 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., Huo, H., Maherali, N., Ahfeldt, T., Shimamura, A., Lensch, M. W., Cowan, C., Hochedlinger, K., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Kim, K. Y., Hysolli, E., Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+maturation+defect+in+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neuronal maturation defect in induced pluripotent stem cells from patients with Rett syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14169-14174 (2011).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Nous n&#39;avons rien à communiquer.</p

L&#39;expression de facteurs de transcription quatre fibroblastes humains à la reprogrammation des CSPi. De nombreuses tentatives ont été faites pour produire des CSPi humaines en utilisant des approches non-intégration ou non-génétiques pour générer CSPi cliniquement sûres. Jusqu&#39;à présent, ces méthodes montrent l&#39;efficacité très faible et nécessitent une optimisation plus poussée pour améliorer la reproductibilité 11-14. Rétro-méthodes ou lentiviral sont facilement utilisée pour calculer et applique...

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td>80 %</td></tr><tr><td>Substitut de sérum Knockout</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>20 %</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>0,1 mM</td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;éthanol (14,3 M) ou MTG</td><td>Invitrogen</td><td>M-6250</td><td>0,1 mM</td></tr><tr><td>bFGF-2 10 &amp;mu;g/ml</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>GF003AF</td><td>4 ng/ml</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1 %</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td>90 %</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10407028</td><td>10 %</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1 %</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tableau 1. Milieu de culture&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Abcam</td><td>Ab19857</td><td>1:500</td></tr><tr><td>SSEA3</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SSEA4</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560218</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560173</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-60</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560174</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>Abcam</td><td>Ab21624</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>pMIG-OCT4</td><td>Addgene</td><td>17225</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-SOX2</td><td>Addgene</td><td>17226</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-KLF4</td><td>Addgene</td><td>17227</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-MYC</td><td>Addgene</td><td>18119</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104019</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Gélatine, porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 1890</td><td>0,1 %</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td>0,2 %</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47608</td><td>4 %</td></tr><tr><td>BSA</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01800</td><td>3 %</td></tr><tr><td>Cellules nourricières MEF</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-N</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie en fluorescence : microscope inversé avec filtre GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tableau 2. Réactifs et équipements&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

reprogrammation des cellules somatiques humaines dans cellules souches pluripotentes induites (cisp) utilisation vecteur rétroviral avec la gfp

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont pluripotentes et une source précieuse pour cellulaires dans la modélisation des maladies in vitro et la médecine régénérative 1. Il a été montré précédemment que des cellules somatiques humaines peuvent être reprogrammées pour la pluripotence par l&#39;expression ectopique de quatre facteurs de transcription (Oct4, Sox2, Klf4 et Myc) et devenir cellules souches pluripotentes induites (CISP) 2-4. Comme les CSEh, CSPi humaines sont pluripotentes et une source potentielle de cellules autologues. Nous décrivons ici le protocole de reprogrammer des cellules de fibroblastes humains avec les quatre facteurs de reprogrammation clonés dans GFP-rétroviral contenant un squelette 4. En utilisant le protocole suivant, nous générons CSPi de l&#39;homme dans les 3-4 semaines dans des conditions de culture des CSE humaines. Homme colonies iPSC ressemblent CSEh dans la morphologie et afficher la perte de la GFP de fluorescence en résultat de l&#39;inactivation transgène rétroviral. colonies isolées iPSC mécaniquement sous un microsco fluorescencepe se comporter de la même façon que les CSEh. Dans ces cellules, nous avons détecter l&#39;expression de multiples gènes de pluripotence et des marqueurs de surface.

Une méthode pour générer de l&#39;homme cellules souches pluripotentes induites (CISP) via un rétrovirus médiation expression ectopique de OCT4, SOX2, KLF4 et MYC est décrite. Un moyen pratique pour identifier l&#39;homme colonies iPSC fondées sur l&#39;expression de GFP est également discuté.

Reprogrammation des cellules somatiques humaines dans cellules souches pluripotentes induites (CISP) Utilisation vecteur rétroviral avec la GFP

Les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) sont pluripotentes et constituent des sources cellulaires inestimables pour la modélisation de maladies in vitro et la médecine régénérative1. Il a été...

L'objectif général de cette procédure est de générer des cellules IPS humaines par surexpression médiée par un rétrovirus des facteurs OCT4, SOX2, KLF4 et c-Myc, en utilisant un système rapporteur GFP. Cela est réalisé en ajoutant d'abord la quantité appropriée de rétrovirus individuels exprimant GFP. Ensuite, les cellules infectées par le virus exprimant GFP sont transférées dans des plaques revêtues de gélatine à 0,1 % contenant des fibroblastes embryonnaires de souris.La troisième étape de la procédure consiste à remplacer le milieu par un milieu de culture de cellules souches embryonnaires humaines. Enfin, des colonies IPS dans lesquelles le gène GFP est silencé et qui présentent une morphologie similaire à celle des cellules souches embryonnaires humaines sont isolées. En définitive, les résultats montrent l'expression de marqueurs pluripotents endogènes par coloration immunofluorescente et par R-T-Q-P-C-R.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la coloration vitale avec des marqueurs de surface pluripotents et l'observation d'un changement morphologique, est l'iPad souhaitable. Les colonies cellulaires peuvent être facilement i

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Cette vidéo montre la procédure pour générer des cellules souches pluripotentes induites à l'aide de lentivirus inductibles qui expriment Oct4, Sox2, c-Myc et Klf4.

Générer des cellules iPS de MEFS travers l&#39;expression forcée de Sox-2, Oct-4, c-Myc et Klf4

Inductible Stemgent Dox souris Lentivirus TF Set peut reprogrammer des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) pour souches pluripotentes induites (iPS). Ici nous démontrons le protocole de DOX-expression inductible de facteurs de transcription de souris reprogrammation Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc pour générer des colonies iPS qui expriment des marqueurs communs MES pluripotence.

Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris avec un facteur de transcription Quatre, doxycycline inductible système de transduction lentiviraux

Nous démontrons le protocole pour la génération de cellules souches pluripotentes induites à partir des cellules somatiques humaines en utilisant des lentivirus médiée par la livraison des facteurs humains Oct4, Sox2, Nanog, et Lin28. Pluripotence a été confirmée par la morphologie et la présence de cellules souches embryonnaires (ES) de cellules de marqueurs spécifiques.

Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes humains avec les lentivirus TF Stemgent Homme Set

Malgré les progrès récents dans la modification génétique, la transfection de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) reste un processus capricieux. A notre connaissance, les méthodes systématiques et efficaces pour transfecter l'homme cellules souches pluripotentes induites (CISP) n'ont pas été signalés. Ici, nous décrivons les protocoles robustes pour transfecter efficacement et nucleofect iPSCs de l'homme.

Transfection et Nucleofecting homme cellules souches pluripotentes induites

Nous présentons un protocole de reprogrammation efficace des cellules somatiques humaines dans l'homme cellules souches pluripotentes induites (hiPSC) en utilisant des vecteurs rétroviraux codant Oct3 / 4, Sox2, Klf4 et c-myc (OSKM) et l'identification des hiPSC correctement reprogrammé par coloration en direct avec des Tra 1-81 anticorps.

Colonies sélectionner et isoler de l&#39;homme cellules souches pluripotentes induites à partir de fibroblastes adultes Reprogrammed

Ici, nous vous présentons notre méthode établie pour reprogrammer des cellules somatiques humaines dans CSPi humaines sans transgène avec le virus de Sendai, qui montre des résultats cohérents et une efficacité accrues.

Génération efficace d&#39;origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus

Nous décrivons un protocole pour la dérivation de cellules souches pluripotentes humaines induites par des facteurs lentiviraux, reprogrammées et caractérisées et leur conversion dans des conditions de qualité clinique présumées.

Préparation et caractérisation d&#39;un libre-Transgene humain souches pluripotentes induites lignée cellulaire et la conversion en des conditions définies de qualité clinique

L’édition de gènes médiée par TALEN au locus AAVS1 permet l’ajout de transgènes à haute efficacité dans les iPSC humaines. Ce protocole décrit les procédures de préparation des CSPi pour l’administration de TALEN et du vecteur donneur, la transfection des CSPi, ainsi que la sélection et l’isolement des clones de CSPi afin de réaliser l’intégration ciblée d’un gène GFP pour générer des lignées rapporteures.

Transfection, sélection et Colony-cueillette des induite par l&#39;homme Cellules souches pluripotentes TALEN ciblées avec un gène de la GFP dans le AAVS1 Safe Harbor

Génération de cellules souches pluripotentes induites offre des perspectives fascinantes pour la dérivation de la greffe autologue. Toutefois, la progression à travers un état pluripotent et laborieux re-différenciation entrave encore la traduction clinique. Nous décrivons ici la dérivation des fibroblastes humains adultes et leur conversion directe dans des cellules progénitrices neurales induites et la différenciation ultérieure dans les lignées neurales.

Dérivation des adultes fibroblastes humains et de leur conversion directe dans les cellules progénitrices neurales extensible

Cellules souches pluripotentes induites (CISP) représentent une source de tissus spécifiques au patient pour des applications cliniques et la recherche fondamentale. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour reprogrammer les cellules humaines périphériques mononucléaires du sang (de PBMNCs) obtenus à partir de couches leucocytaires congelés en CSPi virales sans l'aide de non-intégration des plasmides épisomiques.

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Frozen Buffy Manteaux en utilisant non-intégration épisomique plasmides

La reprogrammation cellulaire nécessite l'introduction de gènes clés, qui régulent et maintiennent l'état cellulaire pluripotent. Le protocole décrit permet la formation de colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de fibroblastes dermiques humains sans méthodes virales/intégratrices, mais en utilisant des ARN non modifiés (NM-ARN) combinés à des facteurs d'évasion immunitaire réduisant les mécanismes de défense cellulaire.

Isolement des fibroblastes dermiques humains adultes de la peau abdominale et génération de cellules souches pluripotentes induites à l'aide d'une méthode de non-intégration

Découvrez la reprogrammation de fibroblastes humains en cellules souches pluripotentes induites par vecteur rétroviral avec GFP. Cette méthode permet d'identifier facilement les colonies iPSC par perte de fluorescence.

Reprogrammation des cellules somatiques humaines dans cellules souches pluripotentes induites (CISP) Utilisation vecteur rétroviral avec la GFP (Vidéo) | JoVE Journal

Reprogrammation des cellules somatiques humaines dans cellules souches pluripotentes induites (CISP) Utilisation vecteur rétroviral avec la GFP

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