Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l'aide mésophases lipidique

Bonjour et bienvenue au Groupe de Biologie Structurale et Fonctionnelle des Membranes. Je m’appelle Martin Caffery. L’objectif de notre recherche est la membrane biologique, dont le schéma est montré sur la première diapositive, la membrane qui entoure la cellule et les organites subcellulaires lorsqu’ils sont présents est une structure moléculairement mince, seulement deux molécules lipidiques de diamètre et parsemée de protéines.

Nous nous intéressons à la structure et aux fonctions appliquées à la fois aux lipides et aux protéines. Cependant, pour les besoins de cette série JO, je limiterai mon attention aux protéines membranaires. Nous cherchons à comprendre comment ces protéines membranaires fonctionnent au niveau moléculaire pour deux raisons.

Tout d’abord, il y a la satisfaction intellectuelle de savoir comment quelque chose fonctionne. Deuxièmement, en sachant comment il fonctionne, tout comme votre vélo ou votre voiture, il y a la perspective de le réparer s’il fonctionne mal. La conception de médicaments est un résultat évident de ce type de travail.

L’approche que nous adoptons pour comprendre le fonctionnement d’une protéine membranaire au niveau moléculaire consiste à déterminer sa structure cristallographique. Il s’agit d’établir l’emplacement dans l’espace tridimensionnel de tous les atomes, ou du moins de tous les atomes non hydrogène qui composent la protéine. La méthode que nous utilisons à cet effet s’appelle cristallographie macromoléculaire aux rayons X MX en abrégé.

Ici, nous voyons un exemple d’une protéine membranaire dont la structure a été déterminée à l’aide de MX à une fraction de qualité cristalline de la protéine est nécessaire pour faire mx. Comme vous pouvez l’imaginer, la détermination structurée à l’aide de la cristallographie macromoléculaire comporte de nombreuses étapes, comme illustré. Ici. Généralement, il s’agit d’identifier une cible protéique membranaire, puis de la produire, de la purifier et de la cristalliser.

Les mesures de diffraction sont effectuées sur le cristal à l’aide d’une source de rayons X domestique ou synchrotron. Les données de diffraction sont traitées, ce qui permet d’obtenir une carte de densité électronique, qui est ensuite ajustée à un modèle moléculaire. Le modèle, une fois affiné, peut être utilisé pour explorer le mécanisme d’action de la protéine et pour la conception de médicaments basés sur la structure.

L’objectif de cet article est de vous montrer comment nous produisons des cristaux de protéines membranaires de qualité fraction en utilisant des phases méso lipidiques par la méthode dite in meso. Une revue récente de la méthode et de son champ d’application est disponible dans la première référence. Le protocole étape par étape que nous suivrons ici est décrit en référence à un organigramme résumant les étapes impliquées et le temps nécessaire à la mise en place d’un essai final de cristallisation des protéines mésomembranaires est montré ici.

Cette vidéo couvre les étapes entourées de lignes rouges pointillées. Les éléments que vous devrez effectuer en mésocristallisation en mode manuel sont présentés ici. Ils comprennent une solution concentrée de la protéine membranaire lipidique purifiée pour créer la maladie hôte, généralement mono ole pour rendre le lipide plus évident.

Dans cette vidéo, il a été dopé avec des solutions de précipitation de colorant rouge, des dispositifs de caresse de tuyau d’eau purifié et des embouts jetables et un assortiment de seringues Hamilton étanches au gaz, certaines avec des aiguilles amovibles, un coupleur à alésage étroit utilisé pour mélanger la solution protéique avec le lipide pour produire la malaise. Un distributeur répétitif de lames de microscope en verre Hamilton et de lamelles de couverture. Ruban d’espacement à double bâton perforé idéalement siloisé pour la création de puits : pince à épiler, mouchoirs en papier ébréchés, calculatrice et, surtout, votre cahier de laboratoire.

La procédure suivante est utilisée pour préparer une plaque de cristallisation sandwich en verre. Pour le chargement, placez une lame de microscope siloisée sur la paillasse. Retirez le couvercle en papier protecteur d’une surface d’une bande de ruban d’espacement perforé à double bâton.

Placez le ruban adhésif vers le bas en contact avec la surface de la pression de la glissière. Scellez le ruban sur la diapositive. À l’aide d’un brayer ou d’un rouleau, une feuille d’aluminium peut être placée entre le ruban et le rouleau pour protéger la base des puits.

Retirez le deuxième couvercle en papier du ruban adhésif pour exposer sa surface collante supérieure. Cette procédure génère une plaque de verre qui est prête à être chargée et un plafond ultérieur dès que le chargement est terminé. Des lamelles de recouvrement individuelles siloisées à proximité de la plaque permettent un plafond rapide et efficace des puits.

Placez le lipide dans un bloc à température contrôlée à 45 degrés Celsius pendant trois minutes pour le rendre fondu. Notez que le lipide utilisé est généralement monoterrestre. Dans cette vidéo, le lipide a un colorant rouge ajouté pour la visibilité pendant que le lipide fond.

Préparez deux seringues Hamilton étanches au gaz de 100 microlitres pour l’utilisation Dans l’étape de mélange des protéines lipidiques, retirez l’huile de fourrure de téflon de la seringue qui contiendra la solution protéique. Placez la seringue qui contiendra le lipide à côté. Dans ce cas, le fal est laissé en place.

Placez le coupleur à alésage étroit entre les deux seringues, puis connectez le coupleur au doigt de la seringue lipidique. Serrez le coupleur à la seringue, mais ne serrez pas trop. Retirez le piston du corps de la seringue lipidique.

Assurez-vous que le lipide est fondu. Réglez la pipette à 30 microlitres et prélevez lentement 30 microlitres de coiffe lipidique fondue. Le flacon lipidique.

Le lipide doit être stocké sous l’azote ou l’argon à moins 80 degrés Celsius. Administrez lentement la plus grande quantité de lipide fondu possible dans l’extrémité ouverte de la seringue. En prenant soin de ne pas introduire d’espaces d’air.

Placez le piston dans le canon en contact avec le léopard en fusion et avancez lentement le piston vers le haut du canon avec la seringue tenue verticalement. Comme indiqué, la bulle d’air piégée par inadvertance monte au cours du processus et est libérée. Nous avons maintenant un bouchon de lipide fondu dans le canon dont vous devez déterminer le volume avec précision.

Cela peut être fait en lisant les marques sur le corps de la seringue. Dans ce cas, le volume est de 23 microlitres, qui est enregistré dans le cahier de laboratoire. Faites glisser la fourrure sur l’aiguille qui s’étend du coupleur.

Utilisez le piston pour forcer le lipide fondu à monter dans le cylindre et lentement et doucement dans l’aiguille au cœur du coupleur. Si l’aiguille est légèrement trop remplie, on verra le lipide battre à son extrémité ouverte. En reculant légèrement le piston, l’excès de lipide peut être retiré dans le coupleur jusqu’à ce qu’il soit juste au ras de la pointe de l’aiguille du coupleur.

Dans ce cas, l’unité de coupleur de seringue est entièrement chargée et prête à être combinée avec la seringue protéine. La solution doit être essorée à 14 000 G pendant 10 min, cinq à 10 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les gros agrégats. Avant de mettre en place des essais de cristallisation, prélevez la solution protéique du seau à glace et équilibrez-la à température ambiante.

Calculez le volume de protéines, donc la solution à utiliser pour former la phase cubique à ou près de l’hydratation complète pour un oléan a 20 degrés Celsius. L’hydratation complète avec de l’eau se produit à près de 40 % en poids d’eau, comme dans le diagramme de phase. Rappelons que nous avons chargé la seringue lipidique avec 23 de mono à une densité de 0,94 milligrammes par microlitre.

Cela correspond à 21,6 milligrammes de lipides, donc 21,6 fois quatre divisés par six ou 14,4 milligrammes ou 14,4 microlitres de solution protéique sont nécessaires avec une seringue Hamilton de 25 ou 50 microlitres, prélevez le volume requis de solution protéique, transférez la solution sur l’embout en téflon du piston dans le baril de la solution protéique. En prenant soin d’éviter les bulles d’air, retirez soigneusement l’aiguille et mesurez le volume de solution protéique dans la seringue. Il doit correspondre à la valeur fournie à l’étape précédente.

En préparation de l’association avec la seringue chargée de lipides. Poussez soigneusement la solution protéique dans le baril pour qu’elle finisse au ras de son extrémité ouverte. Cela peut être observé en regardant vers le bas à travers l’extrémité de terminaison du canon.

La solution protéique de lipine, les seringues chargées sont maintenant prêtes à être combinées en prévision de Mex pour ce faire, vissez la seringue protéique dans l’extrémité ouverte du coupleur attaché à la seringue lipidique. Après avoir combiné deux seringues par le biais du coupleur. Un volume continu de liquide doit exister à partir des lipides dans une seringue à travers le coupleur jusqu’à la solution protéique dans l’autre seringue.

En préparation du mélange, l’unité assemblée est maintenue dans l’une avec une seringue dans la main droite et l’autre dans la gauche. Un couple est appliqué aux deux canons jusqu’à l’attelage, à l’aide des doigts et du pouce des deux mains pour s’assurer que l’étanchéité contre les sillons de l’attelage reste intacte lors du serrage. Le dispositif de mélange assemblé à ce stade endommagera l’ALS et provoquera des fuites lors du serrage, ce qui entraînera également des fuites.

C’est une question d’expérience avec les inévitables essais et erreurs et la perte occasionnelle d’échantillon. Il vaut donc la peine de s’entraîner avec des lipides et de l’eau ou une solution tampon pour se faire une idée du système avant de se lancer dans l’utilisation d’une solution protéique précieuse pour affecter le mélange, avancez le piston du côté protéique de l’unité de mélange assemblée jusqu’à sa limite avec le pouce ou l’index poussant la solution protéique hors de la seringue protéique à travers le coupleur et dans la seringue lipidique. Si l’unité a été scellée efficacement, cette action provoquera un mouvement égal et opposé du piston du côté lipidique.

Le piston du côté lipidique est maintenant utilisé pour ramener le contenu de la seringue lipidique à travers le filtre et dans la seringue à protéines. Ce processus est répété de nombreuses fois. Parfois, une centaine de passages ou plus sont nécessaires pour produire une misa phase homogène.

Au début du mélange, le mouvement de va-et-vient du matériau à travers le coupleur peut être inégal et parfois une force supplémentaire est nécessaire pour effectuer le mélange. Il faut s’y attendre. Le mélange initial s’accompagne généralement du développement d’une turbidité non uniforme dans l’échantillon et est à nouveau attendu.

Au fur et à mesure que l’homogénéisation progresse. La texture, telle qu’elle est perçue par la force nécessaire pour déplacer les pistons d’avant en arrière, devient plus uniforme et caractéristique de la phase cubique du viscus, tout comme l’aspect visuel de la phase cubique émergente. Si les conditions sont appropriées et que la phase cubique se forme, la dispersion doit apparaître optiquement transparente dans le corps de la seringue.

Ainsi, les marquages sur le corps de la seringue doivent être clairement lisibles à travers la phase méso dans le cylindre. Dans le cas de protéines colorées, la phase méso aura la couleur de la protéine, mais sera optiquement transparente. Un très léger refroidissement de l’échantillon pendant le mélange en plaçant le mélangeur à seringue pendant une courte période sur de la glace peut accélérer l’homogénéisation et l’obtention de la transparence.

Cependant, il est important de ne pas surdimensionner l’échantillon, il faut veiller à éviter un mélange extrêmement vigoureux, car cela peut entraîner une augmentation de la température de l’échantillon en raison de l’échauffement par friction. À ce stade, la phase misa cubique s’est formée et la protéine est reconstituée en claie lipidique. La phase misa est maintenant prête à être distribuée dans les puits individuels des plaques de cristallisation.

Cependant, la phase méso doit d’abord être transférée dans une seringue Hamilton de 10 microlitres montée sur un distributeur à répétition. Commencez ce processus en couplant la seringue au distributeur mince. Chargez la seringue avec le mease cubique.

Retirez l’aiguille et le piston de la seringue. Laissez le fal en téflon en place. Retirez l’écrou de retenue du distributeur à l’aide d’une petite pièce de monnaie.

Avec le bras à cliquet complètement retiré. Insérez la seringue sans son piston et son aiguille à travers l’anneau de maintien du distributeur. Replacez le côté du joint du nœud de retenue face à la seringue et vissez-le fermement sur l’extrémité ouverte de la seringue.

Il faut veiller à ce que la seringue soit correctement centrée dans l’anneau de maintien et que le corps soit aligné parallèlement au bras à cliquet. Ces deux exigences sont importantes car si le piston ne fonctionne pas librement et que la pression s’accumule dans la seringue source pendant le chargement et qu’une fuite peut se produire. Passez le piston dans la bague de préhension avec l’écrou de préhension, dévissez quelques tours et guidez le piston dans l’extrémité ouverte de la seringue.

Appuyez à fond sur le bras à cliquet, déplacez le piston dans le canon et vérifiez qu’il se déplace librement et à travers le canon. Si la vis et le guide-chaîne ont été desserrés, resserrez-les et vérifiez à nouveau que le piston se déplace librement. La seringue de distribution est maintenant prête à être chargée.

Déplacez le piston d’un côté de l’unité de mélange assemblée jusqu’à la graduation de zéro microlitre. Pour transférer la phase méso à l’autre seringue et au coupleur. Débranchez la seringue vide avec son UL en place de l’unité de mélange et connectez immédiatement la seringue chargée avec le coupleur fixé à l’extrémité filetée de la seringue distributrice de 10 microlitres.

Le degré d’étanchéité avec lequel l’accouplement est effectué est critique. Comme déjà noté, chargez la seringue distributrice en appuyant sur le piston de la seringue de 100 microlitres afin que la phase méso soit transférée à travers le coupleur. Si l’accouplement est serré et que le piston de la seringue de distribution fonctionne librement, le piston doit commencer à se déplacer dans la direction du mouvement du piston de chargement pendant que la seringue de distribution se remplit.

Débranchez la seringue de chargement avec le coupleur attaché de la seringue de distribution. Fixez une aiguille courte à pointe plate à l’extrémité en acier de la seringue de distribution et serrez-la soigneusement en place. Fixez le piston au bras à cliquet en serrant le nœud dans l’anneau de préhension.

Il faut veiller à ne pas trop serrer le nœud. Comme cela peut entailler et déformer le piston, le rendant inutilisable. Il est important que la plage de course fournie au bras à cliquet à l’état serré soit limitée à un pouce maximum.

Comme le montre ci-dessus, le piston aura tendance à se déformer et la livraison peut échouer. J enfoncez plusieurs fois le tambour à cliquet pour faire avancer le piston dans le canon, remplissant ainsi le volume vide de l’aiguille et chargeant l’aiguille. Cette étape doit être répétée jusqu’à 10 fois jusqu’à ce qu’une chaîne continue de la phase mesa émerge de la pointe de l’aiguille.

L’aiguille est maintenant prête à être utilisée pour la mise en place d’essais de cristallisation, qui devraient commencer immédiatement. Il n’est pas conseillé de conserver la phase cubique chargée en protéines trop longtemps avant de mettre en place les essais de cristallisation. Comme certaines protéines sont instables dans la phase cubique sans précipitant ajouté, placez une plaque de cristallisation à plusieurs puits et une lamelle de recouvrement sur une surface, surélevée de quelques centimètres au-dessus du banc pour faciliter le chargement.

Un contraste optimal et une meilleure visibilité sont obtenus lorsque la surface est légèrement sombre. Homogénéiser les solutions de précipitation et déboucher les flacons. Réglez le dispositif de distribution du précipitant à un microlitre avec la seringue de distribution tenue verticalement dans une main, utilisez la main libre pour positionner la pointe de l’aiguille au centre et directement au-dessus de la base du puits.

numéro un. Appuyez sur le bouton de la boîte du distributeur répétitif pour expulser un bolus de mease sur la surface en verre. Le volume du bolus est de 200 nanolitres.

Lorsque le distributeur répétitif standard est utilisé avec une seringue de 10 microlitres, la pointe de l’aiguille ne doit pas être à plus de quelques centaines de micromètres au-dessus de la base du puits. Il suffit d’un peu de pratique. Une fois que les quatre puits adjacents ont été chargés de mease, placez un microlitre de solution de précipitant sur chaque bolus de mease.

À l’aide d’un tampon de deux microlitres par brevet et d’embouts jetables standard le plus rapidement possible, placez une lamelle de recouvrement carrément sur les puits remplis pour les couvrir uniformément afin d’assurer une étanchéité à l’eau. À l’aide d’une spatule, appliquez une pression sur la lamelle de recouvrement à l’endroit où elle entre en contact avec la surface collante exposée du ruban d’espacement. Le processus de distribution de mease et de précipitant peut être répété jusqu’à ce que tous les puits de la plaque soient chargés et scellés.

La plaque est maintenant prête pour l’inspection et l’incubation. Étiquetez clairement la plaque à des fins de suivi. Les protéines sensibles à la lumière sont généralement manipulées en enveloppant les plaques dans du papier d’aluminium avant de les placer dans la chambre d’incubation.

Ceux-ci peuvent être retirés et examinés au microscope sous une lumière tamisée ou de couleur appropriée. Placez les plaques dans une chambre à température contrôlée, généralement à 20 degrés Celsius ou environ, selon un horaire régulier. Inspectez les parois pour la croissance cristalline à l’aide d’un microscope à lumière polarisée avec une rencontre de 10 ou 20 fois.

Objectif, l’horaire utilisé dans le labo de l’auteur est le suivant, jour 0 1 2 3 5 7 14 21 30 post set. Inspectez soigneusement le bolus de mease. Réglage de la profondeur de champ dans l’échantillon de 140 microns d’épaisseur.

L’examen doit être effectué à la fois à la lumière normale et entre des polariseurs croisés, des cristaux de protéines membranaires incolores se développant en phase cubique lorsqu’ils sont observés à la lumière normale. Ressemble à ça. Les cristaux de protéines membranaires incolores qui poussent dans le méso lorsqu’ils sont vus avec une lumière polarisée ressemblent à ceci ou à ceci : les protéines membranaires naturellement colorées qui poussent dans le méso lorsqu’elles sont vues avec une lumière normale ressemblent à ceci ou à cela.

Les prochaines étapes du processus global de détermination structurée consistent à récolter et à cryorefroidir les cristaux, ainsi qu’à enregistrer et à traiter la diffraction des rayons X à partir de ceux-ci. Ces sujets sont abordés dans des articles JoVE séparés de cette série.