De Constructs à cristaux - Vers Structure Détermination de β-cylindre externe protéines membranaires

L’objectif global de cette méthode est d’obtenir des quantités de milligrammes de protéines bêta-barils de la membrane externe qui vont cristalliser et se défracter. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du repliement et du transport des protéines membranaires, telles que la façon dont les protéines bêta-barils sont insérées dans les membranes cellulaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est robuste pour les protéines bêta-baril.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, car le choix des détergents pour la purification, la cristallisation et la défraction est un défi. Jeremy Guerin, un postdoctorant du laboratoire de Susan Buchanan, fera une démonstration de la procédure, en plus de moi-même et de mes collègues du laboratoire. Commencer cette procédure par la construction d’un vecteur d’expression T7 contenant la protéine de membrane externe cible optimisée pour le codon, ou gène OMP, pour l’expression in vivo sur la membrane, comme décrit dans le protocole de texte.

Transformez la construction en une souche d’expression de bactéries pour l’expression en pipetant un microlitre de plasmide dans 50 microlitres de cellules chimiquement compétentes BL21(DE3), et mélangez doucement en pipetant de haut en bas. Incuber sur glace pendant 30 minutes. Après l’incubation, chauffer à 42 degrés Celsius pendant 30 secondes à l’aide d’un bain-marie, puis remettre sur de la glace pendant une minute.

Ajoutez un millilitre de milieu SOC préchauffé et agitez à 37 degrés Celsius pendant une heure à 1000 tr/min à l’aide d’un incubateur à secousses de paillasse. Après l’incubation, placez 100 microlitres de cellules sur des plaques de gélose LB contenant un antibiotique approprié et incubez pendant la nuit à 37 degrés Celsius, inversé. Ensuite, effectuez des tests d’expression à petite échelle en inoculant cinq millilitres de culture d’antibiotiques contenant LB avec une seule colonie.

Répétez l’opération pour cinq à 10 colonies. Croissance à 37 degrés Celsius avec secousse jusqu’à une densité optique de 600 nanomètres d’environ zéro virgule six. Induire l’expression de l’OMP cible en ajoutant cinq microlitres d’une molaire IPTG dans chaque tube de culture et laisser croître une à deux heures supplémentaires.

Pour comparer les niveaux d’expression de toutes les colonies, centrifuger un millilitre de chaque culture pendant une minute à 15 000 fois G, à l’aide d’une microcentrifugeuse. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 200 microlitres de tampon de chargement 1X SDS-PAGE. Chauffez à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis centrifugez à nouveau à 15 000 fois G pendant cinq minutes.

Analysez les échantillons à l’aide de SDS-PAGE en pipetant 20 microlitres dans chaque puits d’un gel à dix pour cent. Faites fonctionner le gel pendant 35 minutes à une tension constante de 200 volts. Enfin, récoltez les cellules par centrifugation à 6000 fois G pendant dix minutes.

Remettez les cellules en suspension dans le tampon de lyse à raison de cinq millilitres par gramme de pâte cellulaire. Lyser les cellules à l’aide d’une presse française ou d’un homogénéisateur de cellules. Ensuite, faites tourner les cellules lysées à 15 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les cellules non lysées et les débris cellulaires.

Transférez le surnageant dans un tube propre et centrifugez-le à nouveau à grande vitesse pendant une heure à quatre degrés Celsius. La pastille résultante est la fraction membranaire qui contient la protéine d’intérêt. À l’aide d’un homogénéisateur Dounce, remettre en suspension la fraction membranaire.

Tout d’abord, transférez les membranes, puis ajoutez un tampon de solubilisation à une concentration de 2X sans détergent. Versez les membranes remises en suspension dans un cylindre gradué et ajoutez de l’eau jusqu’à ce qu’une concentration finale de tampon de solubilisation 1X soit atteinte. Transférez l’échantillon dans un bécher et ajoutez lentement le détergent jusqu’à une concentration finale d’environ 10 fois la concentration micellaire critique.

Ensuite, remuez pendant 0,5 à 16 heures à quatre degrés Celsius, selon la facilité avec laquelle la protéine cible est extraite des membranes. Enfin, centrifugez l’échantillon solubilisé à 300 000 fois G pendant une heure à quatre degrés Celsius. Préparez une colonne IMAC d’un à cinq millilitres ou utilisez une colonne pré-emballée.

Effectuez les étapes de chromatographie suivantes à quatre degrés Celsius. Rincer à l’eau pour éliminer toute trace de conservateurs. Si vous utilisez un système de purification automatisé, installez la colonne conformément aux instructions du fabricant.

Préparez 500 millilitres de tampon IMAC A sans imidizole et 250 millilitres de tampon IMAC B avec une molaire d’imidizole. Équilibrez la colonne IMAC à l’aide de 10 volumes de colonne de tampon IMAC A.Ajoutez de l’imidizole à l’échantillon de protéines jusqu’à une concentration finale de 25 millimolaires et mélangez. Ensuite, chargez l’échantillon sur la colonne IMAC équilibrée à raison de deux millilitres par minute.

Récupérez le flux continu. Ensuite, lavez la colonne IMAC avec cinq volumes de colonne chacun contenant des concentrations croissantes d’imidizole, à l’aide du tampon B. Collectez les lavages en fractions de deux millilitres. Eluter l’échantillon avec une concentration finale de 250 millimolaires pour cinq volumes de colonne et recueillir l’échantillon élué en fractions de deux millilitres.

Analysez l’écoulement, les fractions de lavage et les fractions d’élution à l’aide de l’analyse SDS-PAGE basée sur leur absorbance à 280 nanomètres. Regroupez les fractions contenant l’OMP bêta-baril cible tel que vérifié par l’analyse SDS-PAGE. Ensuite, retirez l’étiquette d’histadine 6X en ajoutant de la protéase TEV à l’échantillon mélangé et en incubant pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec un léger balancement.

Chargez à nouveau la solution de protéase de l’échantillon sur une colonne IMAC pour séparer l’OMP du baril bêta cible des marqueurs clivés et de tout échantillon non clivé. Le flux contiendra l’échantillon clivé sans l’étiquette. Pour préparer la cristallisation, chargez l’échantillon sur une colonne de filtration sur gel dans un tampon contenant le détergent à utiliser pour la cristallisation.

Collectez des fractions d’un millilitre et analysez-les à l’aide de l’analyse SDS-PAGE basée sur leur absorbance à 280 nanomètres. Regroupez les fractions contenant la protéine cible, puis concentrez-vous à environ 10 milligrammes par millilitre. Avant de préparer les échantillons, assemblez l’appareil à gel.

Utilisez un tampon de coulage de gel pré-refroidi ou faites fonctionner le gel dans la chambre froide. Filtrez l’échantillon à l’aide d’un filtre centrifuge de 0,22 micron pour éliminer les particules et les précipitations. Ensuite, pipetez 0,25 microlitre de l’échantillon dans deux microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre.

Ensuite, ajoutez 9,75 microlitres de tampon d’échantillon dans chaque tube et mélangez par pipetage. Aux deux échantillons, ajoutez également 10 microlitres de tampon de chargement 2X SDS et mélangez doucement par pipetage. Faites bouillir l’échantillon bouilli à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, tout en laissant l’échantillon RT à température ambiante.

Ensuite, faites tourner brièvement l’échantillon bouilli. Ensuite, chargez 20 microlitres des deux échantillons sur le gel natif pré-assemblé. Après avoir fait fonctionner le gel pendant 60 minutes à une tension constante de 150 volts, retirez le gel et trempez-le dans une solution de coloration pour visualiser les résultats.

Procéder à des essais de cristallisation en phase détergente, bicellulaire et cubique lipidique, en utilisant les méthodes Jove publiées précédemment. Les têtes de cristallisation sont visualisées au microscope UV pour vérifier que les cristaux sont, bien des protéines et non dissous, des lipides ou des détergents. Les cristaux de plomb sont tamisés à l’aide d’une source domestique ou au synchrotron pour voir si les cristaux se défractent.

Après la collecte de données de cristaux qui se défractent bien, traitez les données à l’aide d’un logiciel de traitement, tel que HKL2000. Transférez les fichiers résultants vers une suite logicielle pour la détermination de la structure, telle que Phoenix Suit, et effectuez le remplacement moléculaire pour la mise en phase initiale et la détermination de la structure. La structure cristalline de YIUR a été déterminée à une résolution de 2,6 angström à l’aide de cette méthode.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux semaines, si elle est correctement exécutée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exprimer et de purifier les protéines de la membrane externe bactérienne pour les études structurales.