Name: De Constructs à cristaux - Vers Structure Détermination de β-cylindre externe protéines membranaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Découvrez une méthode robuste pour produire des quantités milligrammes de protéines membranaires β-cylindre et les cristalliser pour la détermination structurale. Cette technique facilite l'étude du repliement et du transport des protéines membranaires.

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Nous tenons à remercier Hervé Celia du CNRS pour avoir fourni les images UV et Chris Dettmar et Garth Simpson du Département de chimie de l’Université Purdue pour avoir fourni les images SONICC. Nous tenons à souligner le financement de l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales et du Programme de recherche intra-muros des Instituts nationaux de la santé. De plus, nous tenons à souligner le financement supplémentaire de l’Institut national des sciences médicales générales (A.M.S. et C.J.), de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses (N.N. 1K22AI113078-01) et du Département des sciences biologiques de l’Université Purdue (N.N.).

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<li>Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-dependent+transporters%3A+regulation%2C+structure%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function.</a> Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).</li>
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<li>Cornelissen, C. N., Hollander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-Dependent+Transporters+Expressed+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae.</a> Front in Micro. 2 (117), (2011).</li>
<li>Dautin, N., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+in+gram-negative+bacteria+via+the+autotransporter+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway.</a> Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).</li>
<li>Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+V+secretion%3A+mechanism%28s%29+of+autotransport+through+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+of+the+Royal+Soc+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane.</a> Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).</li>
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<li>Yamashita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+Ail-mediated+adhesion+in+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis.</a> Structure. 19, 1672-1682 (2011).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

β-baril OMP jouent des rôles essentiels dans les bactéries Gram-négatives, les mitochondries et les chloroplastes et sont des cibles importantes pour l&#39;analyse structurelle qui offrent une multitude d&#39;informations sur les mécanismes moléculaires essentiels aux membranes extérieures de ces organites respectives. Cependant, la production d&#39;échantillon suffisant pour l&#39;analyse structurelle est pas toujours simple et, par conséquent, un pipeline général est présenté pour la production de quantités suffisante...

β-baril OMP ne peuvent être trouvés dans la membrane externe des mitochondries, des chloroplastes, et des bactéries Gram-négatives 1-3. Bien qu&#39;elles remplissent des fonctions similaires comme les protéines alpha-hélicoïdale, ils ont un pli très différent consistant en un domaine β-baril membrane-embedded centrale allant de 8-26 brins ß antiparallèles avec chaque brin étant relié intimement aux deux brins voisins (figures 1 et 2). Les premiers et derniers brins du domaine β-baril puis interagissent les uns avec les autres, presque exclusivement d&#39;une manière anti-parallèle (à l&#39;exception des VDAC mitochondrial), pour fermer et sceller le domaine β-canon de la membrane entourant. Tous les OMP β-baril ont des boucles extracellulaires de faire varier la séquence et la longueur, qui jouent un rôle important dans les interactions ligand et / ou des contacts protéine-protéine, avec ces boucles étant parfois aussi grande que 75 résidus, tels que trouvés dans la liaison de Neisseria transferrine proUne protéine (TbpA) 4. β-baril OMP peuvent également avoir des extensions périplasmiques N-terminales ou C-terminales qui servent de domaines supplémentaire pour but fonctionnel de la protéine (par exemple BamA 5-7, FimD 8,9, FADL 10). Alors que de nombreux types de OMP β-baril existent 11, deux des types les plus courants sont décrits ci - dessous à titre d&#39; exemples pour ceux qui sont moins familiers avec le terrain, (1) transporteurs TonB-dépendants et (2) autotransporters. Transporteurs TonB-dépendants (par exemple, FEPA, TbpA, BTub, Cir, etc.) sont essentiels pour l&#39; importation d&#39;éléments nutritifs et contiennent un domaine de prise N-terminal constitué de ~ 150 résidus qui se trouve replié à l&#39; intérieur d&#39; un 22 brin β- C-terminal baril domaine incorporé dans la membrane externe 12 (figure 3). Bien que ce bouchon empêche domaine substrat de passer librement à travers le domaine du canon, la liaison au substrat induit un changement conformationnel dans le domaine du bouchon thà conduit à la formation de pores (soit par prise réarrangement ou partielle complète d&#39;éjection / de la fiche) qui peut alors faciliter le transport du substrat à travers la membrane externe dans le périplasme. Les transporteurs TonB-dépendants sont particulièrement importantes pour la survie de certaines souches pathogènes de bactéries Gram-négatives telles que Neisseria meningitidis qui ont évolué à des transporteurs spécialisés qui détournent des nutriments tels que le fer directement à partir de protéines de l&#39; hôte humain 4,13,14. Autotransporteurs appartiennent au système de sécrétion de type V de bactéries Gram-négatives et sont OMP tonneau ß qui se composent d&#39;un domaine β-canon (typiquement 12 brins comme avec ESTA et ESPP) et un domaine passager qui est soit sécrétées ou présentés à la surface de la cellule 15,16 (figure 3). Ces OMP β-baril servent souvent un rôle important dans la survie des cellules et la virulence avec le domaine passager servant soit comme une protéase, une adhésine, et / ou d&#39;autres effecteur qui médie la pathogenèse. méthodes structurelles telles que la cristallographie aux rayons X, spectroscopie RMN, et la microscopie électronique (EM) nous permettent de déterminer des modèles pour les OMP à résolution atomique qui peut à son tour être utilisés pour déchiffrer exactement comment ils fonctionnent dans la membrane externe. Cette information précieuse peut alors être utilisé pour le développement de vaccins et de médicaments le cas échéant. Par exemple, la liaison de la transferrine protéine A (TbpA) se trouve sur la surface de Neisseria et est nécessaire pour la pathogenèse , car il se lie directement la transferrine humaine, puis extrait et importe le fer pour sa propre survie. Sans TbpA, Neisseria ne peut pas récupérer le fer de l&#39;hôte humain et sont rendus non pathogènes. Après que la structure cristalline de la transferrine humaine lié à TbpA 4 a été résolu, il est devenu beaucoup plus clair comment les deux protéines associées, quelles régions de TbpA médiés l&#39;interaction, ce que les résidus étaient importants pour l&#39; extraction de fer par TbpA etcomment on peut développer des thérapeutiques contre Neisseria ciblant TbpA. Par conséquent, étant donné l&#39;importance des OMP β-baril dans les bactéries Gram-négatives pour la survie et la pathogenèse, ainsi que dans les mitochondries et la fonction chloroplaste, et la nécessité d&#39;informations structurelles supplémentaires sur cette classe unique de protéines membranaires et les systèmes dans lesquels ils fonctionnent , les protocoles généraux sont présentés dans le but général d&#39;exprimer et de purifier les OMP cibles à des niveaux élevés pour la caractérisation par des méthodes structurelles.

<table><tbody><tr><td>Robot de cristallisation</td><td>TTP Labtech, Art Robbins-Any</td><td></td> <td>devrait fonctionner ici, à l’exception</td></tr> du <tr><td>thermocycleur PCR</td> de cristallisation LCP <td>Eppendorf, BioRad-Media</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick, spectromètre Infors HT-UV-vis</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Eppendorf-SDS-PAGE</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>appareil</td><td>BioRad</td><td>1645050, 1658005</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE et gels natifs</td><td>BioRad, Life Technologies</td><td>4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)</td><td></td></tr><tr><td>AkTA Prime</td><td>GE</td> <td>Healthcare-AkTA</td><td></td></tr> <tr><td>Purifier</td><td>GE</td> <td>Healthcare-Microcentrifugeuse</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Eppendorf-Centrifuge</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(basse-moyenne vitesse)</td><td>Beckman-Coulter-Ultracentrifuge</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(haute vitesse) vitesse)</td><td>Rotor Beckman-Coulter-SS34</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Rotor Sorvall-Type</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>45 Ti</td><td>Rotor Beckman-Coulter-Type</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>70 Ti</td><td></td><td></td> Homogénéisateur Fisher Scientific <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>06 435C</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex</td><td>Avestin-Dialysis</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>tubing</td><td>Sigma</td><td>D9652</td><td></td></tr><tr><td>Outils LCP</td><td>Hamilton, TTP Labtech-VDX</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plaques à 24 puits</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>Plaques sandwich</td><td>Hampton Research, Dimensions moléculaires</td><td>HR3-151, MD11-50 (MD11-53)</td><td></td></tr><tr><td>Grace Feuilles de cristallisation</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>875238</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep S300 HR colonne</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1167-01</td><td></td></tr><tr><td>Colonne Q-Sepharose</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td></td></tr><tr><td>Écrans de cristallisation</td><td>Hampton Research, Qiagen, Dimensions</td> moléculaires-Seringue <td></td><td></td></tr><tr><td>étanche aux gaz (100 ml)</td><td>Hamilton&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de constructs à cristaux - vers structure détermination de β-cylindre externe protéines membranaires

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Les protéines membranaires remplissent des fonctions importantes dans les cellules telles que le transport des nutriments, la motilité, la signalisation, la survie et la virulence, mais ne constituent que ~1 % des structures connues. Il existe deux types de protéines membranaires, α-hélicoïdale et β-baril. Alors que les protéines membranaires α-hélicoïdales peuvent être trouvées dans presque toutes les membranes cellulaires, les protéines membranaires à β-baril ne peuvent être trouvées que dans les membranes externes des mitochondries, des chloroplastes et des bactéries à Gram négatif. Un goulot d’étranglement courant dans les études structurelles des protéines membranaires en général est d’obtenir suffisamment d’échantillon pur pour l’analyse. Dans l’espoir d’aider ceux qui s’intéressent à résoudre la structure de leur protéine de membrane externe (OMP) à β-baril préférée, des protocoles généraux sont présentés pour la production d’OMP cibles à β-baril à des niveaux utiles pour la détermination de la structure par cristallographie aux rayons X et/ou spectroscopie RMN. Ici, nous décrivons la conception de constructions pour l’expression native et pour l’expression dans les corps d’inclusion, la purification à l’aide d’un marqueur d’affinité et la cristallisation à l’aide de techniques de criblage au détergent, de bicelle et de phase cubique lipidique. Ces protocoles ont été testés et se sont avérés efficaces pour la plupart des OMP à partir de bactéries à Gram négatif ; Cependant, il existe certaines cibles, en particulier pour les mitochondries et les chloroplastes, qui peuvent nécessiter d’autres méthodes d’expression et de purification. En tant que telles, les méthodes ici devraient être applicables à la plupart des projets qui impliquent des OMP à partir de bactéries à Gram négatif, mais les niveaux d’expression et la quantité d’échantillon purifié varieront en fonction de l’OMP cible.

Yiur est un transporteur de fer dépendant de TonB qui est une cible pour un vaccin contre Yersinia pestis putatif. Il a été identifié à l&#39; origine en utilisant une analyse de puces à ADN. Ici, les mesures qui ont été prises pour déterminer la structure de yiur utilisant cristallographie aux rayons X sont décrits (Figure 9). Pour le clonage, la séquence d&#39;ADN de yiur (sans la séquence signal N-terminale) a été amplifié par PCR à partir d&#39;ADN génomique...

<classe p='jove_content'>β protéines de membrane externe (OMP) remplissent de nombreuses fonctions au sein des membranes externes des bactéries à Gram négatif, des mitochondries et des chloroplastes. Ici, nous espérons pallier un goulot d’étranglement connu dans les études structurales en présentant des protocoles pour la production d’OMP à β-baril en quantités suffisantes pour la détermination de la structure par cristallographie aux rayons X ou spectroscopie RMN.

De Constructs à cristaux - Vers Structure Détermination de β-cylindre externe protéines membranaires

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

L'objectif général de cette méthode est d'obtenir des quantités de l'ordre du milligramme de protéines membranaires externes en forme de tonneau bêta qui cristallisent et diffractent. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du repliement et du transport des protéines membranaires, notamment la manière dont les protéines en forme de tonneau bêta s'insèrent dans les membranes cellulaires. Le principal avantage de cette technique est sa robustesse pour les protéines en forme de tonneau bêta.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car le choix des détergents pour la purification, la cristallisation et la défracturation est délicat. Jeremy Guerin, un postdoctorant du laboratoire de Susan Buchanan, démontrera la procédure, en plus de moi-même et de mes collègues du laboratoire. Commencez cette procédure par la construction d'un vecteur d'expression T7 contenant le gène du protéine membranaire externe cible, ou gène OMP, optimisé au niveau des codons, pour une expression in vivo dans la membrane, comme décrit dans le protocole textuel.Transformer le plasmide dans une souche bactérienne d'expression en introduisant un microlitre de plasmide dans 50 microlitres de cellules chimiquement compétentes BL21(DE3), puis mélanger délicatement par aspiration et expulsion répétées à la pipette. Incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Après incubation, appliquer un choc thermique à 42 degrés Celsius pendant 30 secondes à l’aide d’un bain-marie, puis replacer immédiatement sur la glace pendant une minute.Ajouter un millilitre de milieu SOC préalablement réchauffé et agiter à 37 degrés Celsius pendant une heure à 1000 tr/min à l’aide d’un incubateur agitateur de banc. Après l’incubation, étaler 100 microlitres de cellules sur des boîtes de gélose LB contenant un antibiotique approprié et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius, renversées. Ensuite, réaliser des tests d’expression à petite échelle en inoculant cinq millilitres de milieu LB contenant un antibiotique avec une colonie isolée.Répétez l'opération pour cinq à 10 colonies. Incubez à 37 degrés Celsius sous agitation jusqu'à une densité optique à 600 nanomètres d'environ zéro virgule six. Induisez l'expression de la PROT membranaire cible en ajoutant cinq microlitres de IPTG un molaire à chaque tube de culture et laissez pousser encore une à deux heures.Pour comparer les niveaux d'expression de toutes les colonies, centrifuger un millilitre de chaque culture pendant une minute à 15 000 ×g, en utilisant une microcentrifugeuse. Éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans 200 microlitres de tampon de charge 1X pour électrophorèse SDS-PAGE. Incuber à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis centrifuger à nouveau à 15 000 ×g pendant cinq minutes.Analyser les échantillons par électrophorèse SDS-PAGE en pipetant 20 microlitres dans chaque puits d'un gel à dix pour cent. Faire migrer le gel pendant 35 minutes à une tension constante de 200 volts. Enfin, récolter les cellules par centrifugation à 6000 × g pendant dix minutes.Resuspendre les cellules dans le tampon de lyse selon un rapport de cinq millilitres par gramme de pâte cellulaire. Lysér les cellules à l’aide d’un pressoir français ou d’un homogénéisateur cellulaire. Ensuite, centrifuger les cellules lysées à 15 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius afin d’éliminer les cellules non lysées et les débris cellulaires.Transférez le surnageant dans un tube propre et centrifugez à nouveau à grande vitesse pendant une heure à quatre degrés Celsius. Le culot obtenu correspond à la fraction membranaire contenant la protéine d'intérêt. À l’aide d’un homogénéisateur Dounce, resuspendez la fraction membranaire.Tout d'abord, transférez les membranes, puis ajoutez le tampon de solubilisation à une concentration 2X sans détergent. Versez les membranes resuspendues dans un cylindre gradué et ajoutez de l'eau jusqu'à l'obtention d'une concentration finale de tampon de solubilisation 1X. Transférez l'échantillon dans un bécher et ajoutez lentement le détergent jusqu'à une concentration finale d'environ 10 fois la concentration micellaire critique.Ensuite, agiter de 0,5 à 16 heures à quatre degrés Celsius, selon la facilité avec laquelle la protéine cible est extraite des membranes. Enfin, centrifuger l'échantillon solubilisé à 300 000 ×g pendant une heure à quatre degrés Celsius. Préparer une colonne IMAC d'un à cinq millilitres ou utiliser une colonne pré-remplie.Effectuez les étapes ultérieures de chromatographie à quatre degrés Celsius. Rincez à l'eau pour éliminer toute trace de conservateurs. Si vous utilisez un système de purification automatisé, installez la colonne conformément aux instructions du fabricant.Préparez 500 millilitres de tampon A IMAC sans imidazole et 250 millilitres de tampon B IMAC avec un molaire d’imidazole. Équilibrez la colonne IMAC à l’aide de 10 volumes de colonne de tampon A IMAC. Ajoutez de l’imidazole à l’échantillon protéique jusqu’à une concentration finale de 25 millimolaire et mélangez. Ensuite, chargez l’échantillon sur la colonne IMAC équilibrée à raison de deux millilitres par minute.Recueillez le flux sortant. Ensuite, lavez la colonne IMAC avec cinq volumes de colonne de concentrations croissantes d’imidazole, en utilisant le tampon B. Récoltez les lavages en fractions de deux millilitres. Éluiez l’échantillon avec une concentration finale de 250 millimolaire pendant cinq volumes de colonne et collectez l’échantillon élué en fractions de deux millilitres.Analyser le flux sortant, les fractions de lavage et les fractions d'élution par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), en fonction de leur absorbance à 280 nanomètres. Rassembler les fractions contenant la protéine membranaire extérieure (OMP) cible en forme de tonneau bêta, telles qu'identifiées par l'analyse SDS-PAGE. Ensuite, éliminer la marque histidine 6X en ajoutant la protéase TEV à l'échantillon regroupé et en incubant toute la nuit à quatre degrés Celsius avec un balancement doux.Chargez à nouveau l'échantillon de solution protéase sur une colonne IMAC afin de séparer la protéine membranaire à structure en bêta-barillet cible des étiquettes clivées et de tout échantillon non clivé. Le flux passant contiendra l'échantillon clivé dépourvu de l'étiquette. Pour préparer la cristallisation, chargez l'échantillon sur une colonne de filtration sur gel dans un tampon contenant le détergent qui sera utilisé pour la cristallisation.Recueillir des fractions d'un millilitre et analyser par électrophorèse SDS-PAGE en fonction de leur absorbance à 280 nanomètres. Regrouper les fractions contenant la protéine cible, puis concentrer à environ 10 milligrammes par millilitre. Avant la préparation des échantillons, assembler le dispositif pour gel.Utilisez un tampon de migration pour gel prérefroidi ou faites migrer le gel dans une chambre froide. Filtrez l'échantillon à l'aide d'un filtre centrifuge de 0,22 micron afin d'éliminer les particules et les précipités. Ensuite, pipetez 0,25 microlitre de l'échantillon dans deux tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.Étiquetez un tube comme « boiled » et l'autre comme « RT ». Ajoutez ensuite 9,75 µL de tampon d'échantillonnage dans chaque tube et mélangez par pipetage. Ajoutez également à chaque échantillon 10 µL de tampon de charge 2X SDS et mélangez délicatement par pipetage. Incubez l'échantillon « boiled » à 95 °C pendant cinq minutes, tandis que l'échantillon « RT » reste à température ambiante.Ensuite, centrifuger brièvement l'échantillon bouilli. Puis, charger 20 microlitres des deux échantillons sur le gel natif pré-assemblé. Après avoir fait migrer le gel pendant 60 minutes à une tension constante de 150 volts, retirer le gel et le faire tremper dans la solution de coloration pour visualiser les résultats.Procéder à des essais de cristallisation dans du détergent, des bicellules et une phase cubique lipidique, en utilisant les méthodes JoVE publiées précédemment. Les têtes de cristallisation sont visualisées au microscope UV afin de vérifier que les cristaux sont bien des protéines et non des cristaux de lipide ou de détergent. Les cristaux prometteurs sont analysés à l’aide d’une source domestique ou d’un synchrotron pour déterminer s’ils diffractent.Après l'acquisition des données à partir de cristaux qui diffractent bien, traiter les données à l'aide d'un logiciel de traitement, tel que HKL2000. Transférer les fichiers obtenus vers une suite logicielle dédiée à la détermination de structure, comme Phoenix Suit, puis effectuer un remplacement moléculaire pour la phase initiale et la détermination de la structure. La structure cristalline de YIUR a été déterminée à une résolution de 2,6 Å à l'aide de cette méthode.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux semaines, si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment exprimer et purifier des protéines membranaires externes bactériennes pour des études structurales.

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JoVE Journal

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Chimie

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L&#39;évaluation des essais de cristallisation bidimensionnelle de protéines membranaires petites pour les études en biologie structurale par cristallographie électronique

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Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Ici est décrit procédures mises en place dans la membrane Caffrey structurale et fonctionnelle du Groupe Biologie des cristaux de récolte et de cryo-cool protéines membranaires lipidiques cultivés dans des phases cubiques et une éponge pour une utilisation dans la détermination de la structure macromoléculaire à l'aide cristallographie aux rayons X.

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Découvrez une méthode robuste pour produire des quantités milligrammes de protéines membranaires β-cylindre et les cristalliser pour la détermination structurale. Cette technique facilite l'étude du repliement et du transport des protéines membranaires.

De Constructs à cristaux - Vers Structure Détermination de β-cylindre externe protéines membranaires

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