L'évaluation des essais de cristallisation bidimensionnelle de protéines membranaires petites pour les études en biologie structurale par cristallographie électronique

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les conditions de cristallisation 2D les plus optimales pour la détermination structurée des protéines membranaires par cristallographie électronique. Ceci est accompli en utilisant d’abord un détergent compatible pendant la purification pour solubiliser la protéine de la bicouche lipidique native. La deuxième étape de la procédure consiste à ajouter des lipides exogènes et à éliminer le détergent par dialyse du mélange de détergent protéique lipidique, ce qui permet d’obtenir des cristaux 2D dans des conditions soigneusement contrôlées.

La troisième étape de la procédure consiste à flasher, congeler les échantillons dans un état vitreux. La dernière étape de la procédure consiste à collecter des données par cryo-em. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui produisent la structure finale de la protéine grâce au traitement d’image computationnel des données.

Bonjour, je suis du laboratoire. J’étudie à l’école de biologie de l’Institut de technologie de Géorgie. Salut, je suis Tina redoutée.

Je viens du laboratoire Berry de l’école de chimie et de biochimie et du laboratoire Schmidt Kray de l’école de biologie du Georgia Institute of Technology. Et je suis Matt Johnson du laboratoire d’Ingleborg Schmidt Cry à l’école de biologie du Georgia Institute of Technology. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’évaluation des essais d’éducation chorale 2D par em.

Nous utilisons ce protocole dans notre laboratoire pour identifier et optimiser les conditions de cristallisation 2D. Pour commencer cette procédure, des échantillons colorés négativement sur des grilles de microscopie électronique à transmission de cuivre de 400 mailles recouvertes de carbone ou TEM sont préparés. Pipetez deux microlitres de l’échantillon de liposomes de protéa sous une grille TEM recouverte de carbone et incubez pendant 60 secondes.

Si l’échantillon ne se répartit pas uniformément, balayez-le doucement avec le côté de la pointe de la pipette. Bloc suivant à partir du bord avec un morceau déchiré de papier filtre watman numéro quatre. Cela garantit une élimination optimale du liquide sans élimination excessive des liposomes de protéa, et aide à préserver le délicat film de carbone.

Immédiatement après le transfert. Appliquez deux microlitres de teinture d’acétate d’urinoir à 1 % après 30 secondes, épongez du bord de la grille. Encore une fois, si l’échantillon contient de fortes concentrations de glycérol ou de saccharose visqueux, généralement de l’ordre de 10 à 20 %, plusieurs cycles de lavage de la grille avec un tampon sans glycérol ou saccharose avant la coloration négative peuvent être utiles pour permettre une coloration correcte avec la solution d’urine tate.

Une fois les grilles préparées, la microscopie électronique est utilisée pour visualiser l’échantillon à faible grossissement afin d’évaluer la distribution et la morphologie de l’occurrence de la membrane et la qualité globale de la grille. Ensuite, un grossissement élevé est utilisé pour obtenir des images et effectuer des transformations RIA des images afin d’identifier les cristaux 2D. Pour commencer à grille basse dans le porte-échantillon du microscope électronique, pour obtenir une première impression de la distribution membranaire moyenne, utilisez un grossissement intermédiaire de 2000 à 10 000 x.

Notez l’étendue de la distribution des membranes, leur morphologie et leur taille dans un cahier de laboratoire. Enregistrez des vues représentatives avec une caméra CCD. Ensuite, si nécessaire, observez les échantillons avec un faible grossissement dans la plage d’environ 400 à 800 x pour avoir une vue d’ensemble des grilles.

Cela peut fournir des informations précieuses pour évaluer la préparation de la grille en révélant des problèmes de concentration d’échantillon, de protéa inégale, de distribution des liposomes et de rupture partielle du film de carbone. Identifiez une zone de grille d’intérêt à un grossissement faible ou intermédiaire. Utilisez ensuite un grossissement élevé pour évaluer l’ordre possible dans différentes membranes.

Ceci est essentiel aux premières étapes des essais de cristallisation 2D. Afin d’identifier des liposomes de protéa prometteurs avec des zones bien ordonnées et de vérifier la reproductibilité lors d’expériences ultérieures pour déterminer le réglage optimal de fort grossissement pour le criblage de cristaux 2D, commencez par un grossissement compris entre 50 000 et 60 000 x. En fonction des dimensions du cristal 2D et de la taille de la cellule unitaire, le réglage de grossissement élevé peut être réduit à 30 000 ou élevé à 80 000.

Ici, sur un emplacement adjacent à la zone d’intérêt de l’image, nous défocalisons d’environ moins 400 nanomètres ou plus s’il y a une incertitude quant à savoir si la zone d’intérêt est effectivement une membrane. Inspectez l’échantillon à la recherche de morceaux de film de carbone, de MICA ou d’autres artefacts qui pourraient être confondus avec des liposomes de protéa. Observez également les bords pour discerner le pliage et la morphologie typiques de la membrane.

Ensuite, inspectez la zone d’intérêt avec une caméra CCD. En collectant une image CCD au réglage optimal de grossissement élevé, le réseau d’une protéine membranaire plus petite et ou principalement hydrophobe peut ne pas être observable par l’évaluation visuelle de l’image CCD elle-même. Dans ce cas, l’image entière est utilisée pour une transformation foer en ligne ou ft.

Cependant, si le réseau ordonné est petit, ce FT contiendra une quantité significative de bruit pour améliorer le rapport signal/bruit, réduire la taille de l’image encadrée, déplacer le boîtier réduit sur l’image, et effectuer un ft en direct, ajuster la fonction gamma du FT en direct pour une identification optimale des réseaux ordonnés. Une valeur gamma trop élevée peut masquer des taches en raison des contributions de bruit, tandis qu’une valeur trop basse empêchera l’identification des points plus faibles. Attendez-vous à ce que la résolution des cristaux 2D colorés négativement soit d’environ 15 angströms à un DFO de moins 400 nanomètres.

Attendez-vous à identifier un à trois ordres de taches. Notez la netteté des taches et de toute mosaïque. Les cristaux 2D d’une petite protéine membranaire de 18 kilodaltons ont une taille allant jusqu’à plusieurs microns.

Des taches sur le FTS, un mouvement net et facilement identifiable de la boîte FT en direct montre que le réseau est continu sans mosaïque. Le réseau d’une protéine plus grande avec un domaine soluble plus étendu peut être identifié sur le petit écran de la collection d’images T-E-M-C-C-D et les FT sont nécessaires pour obtenir une meilleure évaluation de la qualité du réseau, y compris des caractéristiques telles que le bruit de mosaïque dans le FT d’un protéa non ordonné. Les liposomes peuvent être confondus avec des points faibles pour déterminer si les taches sont dues à de petits cristaux de protéines 2D ou au bruit.

Déplacez la boîte pour le pied en direct. Si les taches disparaissent immédiatement, elles sont du bruit, mais si elles restent inchangées sur une petite surface, des cristaux sont probablement présents car les cristaux lipidiques présentent une morphologie et un pied distincts. Ces cristaux lipidiques peuvent également être reconnus par l’inspection visuelle d’une image et par des tailles de cellules unitaires cohérentes.

Des précipitations peuvent se produire lors des premiers essais. L’inspection à fort grossissement est utilisée pour distinguer la précipitation des protéines et les agrégats lipidiques. Dans le cas des agrégats lipidiques, il se peut que la reconstitution se soit produite et les expériences suivantes ne nécessiteront que l’ajustement des paramètres nécessaires pour augmenter la taille de la membrane et produire de l’ordre plutôt que d’induire une reconstitution à 30 000 à 50 000 x.

Les bords de ces structures sombres révèlent qu’elles sont composées de membranes sans protéines. Dans des conditions optimales, les échantillons de précipitation contiendront un grand pourcentage de cristaux 2D. Il n’est pas nécessaire de viser une apparence homogène des membranes, car les cristaux 2D les plus grands et les mieux ordonnés sont sélectionnés visuellement pour la collecte de données.

Ces types d’échantillons seront facilement reconnus lors de la cristallisation, ces échantillons sont utilisés pour la collecte de données cryo EM afin d’obtenir le maximum d’images haute résolution. Nous allons simplement vous montrer comment dépister le cristal 2D de petites protéines à mémoire par TEM lors de cette procédure. Il est important de se rappeler d’être minutieux pour ne pas négliger une condition de cristallisation prometteuse, car vous avez déjà investi beaucoup de temps et d’efforts jusqu’à présent.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.