Préparation d’échantillons à l’aide d’une méthode monocouche lipidique pour les études cristallographiques électroniques

Au fil des ans, les monocouches lipidiques ont été utilisées comme couche de soutien pour favoriser la cristallisation 2D des protéines de la membrane périphérique, ainsi que des protéines solubles. Cette méthode peut également être appliquée à la cristallisation 2D, comme certaines protéines membranaires intégrales. Mais nécessite une étude empirique plus approfondie pour déterminer les conditions de détergent et de dialyse afin de favoriser la partition à la monocouche lipidique.

Une monocouche lipidique se forme à l’interface air-eau, de sorte que les groupes de tête polaire du lipide restent hydratés dans la phase aqueuse. Et les queues d’acyle non polaires de la partition lipidique à l’interface air-eau, qui brise la tension superficielle et aplatit la surface de l’eau. La nature de charge, les fractions chimiques distinctives des groupes de tête lipidique fournissent l’affinité pour les protéines en solution.

Promouvoir la liaison, et en principe la formation de matrices 2D. Tous les cristaux 2D formés sur une monocouche lipidique peuvent être facilement transférés au microscope électronique sur une grille EM recouverte de carbone qui est utilisée pour soulever et soutenir le réseau cristallin sur la couche lipidique. Nous avons décrit dans ce manuscrit, une méthodologie monocouche lipidique pour l’imagerie par microscopie électronique cryogénique.

Préparation monocouche lipidique. Préparation lipidique, préparer un mélange lipidique de 0,01 mg par ml dans du chloroforme 9:1 volume à volume, méthanol. Utilisation de 8,91 ml de chloroforme et de 0,99 ml de méthanol et de 0,1 ml d’une solution lipidique de 10 mg par ml.

Préparation de plaques de téflon. Sonicate une plaque de téflon dans un bain de méthanol pendant cinq minutes. Laver à l’eau chaude pendant 15 minutes, puis rincer à l’eau distillée.

Sécher la plaque de téflon dans un desséché pendant 30 minutes et la garder sous vide jusqu’à utilisation. Formation de monocouche lipidique sur réservoir tampon. Le temps de fonctionnement estimé sera d’une heure et demie.

Placez un papier filtre de type un dans une boîte de Petri et disposez le bloc de téflon sur le dessus du papier filtre. Remplissez les puits de la plaque de téflon avec 60 microlitres de tampon. Ajoutez soigneusement le mélange liquide sur le dessus de la surface tampon goutte par goutte.

Idéalement un microlitre par goutte à l’aide d’une seringue Hamilton. Mouillez le papier filtre avec de l’eau distillée et gardez l’humidité dans la boîte de Pétri. Incuber à température ambiante pendant 60 minutes, le chloroforme doit s’évaporer et une monocouche de lipides à la surface des tampons doit être formée.

Application d’une grille EM sur une monocouche lipidique. Temps de fonctionnement estimé une heure et demie. Placez doucement une grille EM revêtue de carbone sans lueur déversant du carbone vers le bas sur la surface de chaque réservoir tampon.

Injectez soigneusement des protéines dans le puits d’injection latéral, utilisez les concentrations finales de protéines dans le puits autour d’un micromolaire. Incuber 60 minutes à température ambiante. Injecter doucement environ 20 à 30 microlitres de tampon dans l’aisselle d’injection du site pour élever la grille au-dessus de la surface du bloc de téflon.

Cela vous permet de ramasser la grille avec une pince à épiler et de la soulever verticalement de la gouttelette. Résultats représentatifs. Une monocouche lipidique déposée sur une grille EM peut être visualisée au microscope électronique à transmission sans coloration de contraste.

La présence de monocouche peut être reconnue par la différence de contraste par rapport à la zone sans spécimen dans ce trajet de faisceau. Les zones qui ont une couverture monocouche lipidique ont un contraste plus faible que celles qui n’ont pas de couverture. Étant donné que le faisceau d’électrons à travers les trous vides n’a pas de diffusion, il montre un éclairage plus lumineux.

En conclusion, la méthode de la monocouche lipidique offre la possibilité d’étudier les structures protéiques en raison de sa simplicité. Il peut fournir une approche alternative pour faciliter le processus de cristallisation 2D.