Préparation d’échantillons à l’aide d’une méthode monocouche lipidique pour les études cristallographiques électroniques
20 novembre 2021
Les monocouches lipidiques sont utilisées comme base pour former des cristaux de protéines bidimensionnelles (2D) pour des études structurelles depuis des décennies. Ils sont stables à l’interface air-eau et peuvent servir de matériau de support mince pour l’imagerie électronique. Nous présentons ici les étapes éprouvées de la préparation des monocouches lipidiques pour les études biologiques.
Au fil des ans, les monocouches lipidiques ont été utilisées comme couche de soutien pour favoriser la cristallisation 2D des protéines de la membrane périphérique, ainsi que des protéines solubles. Cette méthode peut également être appliquée à la cristallisation 2D, comme certaines protéines membranaires intégrales. Mais nécessite une étude empirique plus approfondie pour déterminer les conditions de détergent et de dialyse afin de favoriser la partition à la monocouche lipidique.
Une monocouche lipidique se forme à l’interface air-eau, de sorte que les groupes de tête polaire du lipide restent hydratés dans la phase aqueuse. Et les queues d’acyle non polaires de la partition lipidique à l’interface air-eau, qui brise la tension superficielle et aplatit la surface de l’eau. La nature de charge, les fractions chimiques distinctives des groupes de tête lipidique fournissent l’affinité pour les protéines en solution.
Promouvoir la liaison, et en principe la formation de matrices 2D. Tous les cristaux 2D formés sur une monocouche lipidique peuvent être facilement transférés au microscope électronique sur une grille EM recouverte de carbone qui est utilisée pour soulever et soutenir le réseau cristallin sur la couche lipidique. Nous avons décrit dans ce manuscrit, une méthodologie monocouche lipidique pour l’imagerie par microscopie électronique cryogénique.
Préparation monocouche lipidique. Préparation lipidique, préparer un mélange lipidique de 0,01 mg par ml dans du chloroforme 9:1 volume à volume, méthanol. Utilisation de 8,91 ml de chloroforme et de 0,99 ml de méthanol et de 0,1 ml d’une solution lipidique de 10 mg par ml.
Préparation de plaques de téflon. Sonicate une plaque de téflon dans un bain de méthanol pendant cinq minutes. Laver à l’eau chaude pendant 15 minutes, puis rincer à l’eau distillée.
Sécher la plaque de téflon dans un desséché pendant 30 minutes et la garder sous vide jusqu’à utilisation. Formation de monocouche lipidique sur réservoir tampon. Le temps de fonctionnement estimé sera d’une heure et demie.
Placez un papier filtre de type un dans une boîte de Petri et disposez le bloc de téflon sur le dessus du papier filtre. Remplissez les puits de la plaque de téflon avec 60 microlitres de tampon. Ajoutez soigneusement le mélange liquide sur le dessus de la surface tampon goutte par goutte.
Idéalement un microlitre par goutte à l’aide d’une seringue Hamilton. Mouillez le papier filtre avec de l’eau distillée et gardez l’humidité dans la boîte de Pétri. Incuber à température ambiante pendant 60 minutes, le chloroforme doit s’évaporer et une monocouche de lipides à la surface des tampons doit être formée.
Application d’une grille EM sur une monocouche lipidique. Temps de fonctionnement estimé une heure et demie. Placez doucement une grille EM revêtue de carbone sans lueur déversant du carbone vers le bas sur la surface de chaque réservoir tampon.
Injectez soigneusement des protéines dans le puits d’injection latéral, utilisez les concentrations finales de protéines dans le puits autour d’un micromolaire. Incuber 60 minutes à température ambiante. Injecter doucement environ 20 à 30 microlitres de tampon dans l’aisselle d’injection du site pour élever la grille au-dessus de la surface du bloc de téflon.
Cela vous permet de ramasser la grille avec une pince à épiler et de la soulever verticalement de la gouttelette. Résultats représentatifs. Une monocouche lipidique déposée sur une grille EM peut être visualisée au microscope électronique à transmission sans coloration de contraste.
La présence de monocouche peut être reconnue par la différence de contraste par rapport à la zone sans spécimen dans ce trajet de faisceau. Les zones qui ont une couverture monocouche lipidique ont un contraste plus faible que celles qui n’ont pas de couverture. Étant donné que le faisceau d’électrons à travers les trous vides n’a pas de diffusion, il montre un éclairage plus lumineux.
En conclusion, la méthode de la monocouche lipidique offre la possibilité d’étudier les structures protéiques en raison de sa simplicité. Il peut fournir une approche alternative pour faciliter le processus de cristallisation 2D.
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Aperçu
Les monocouches lipidiques servent de base stable pour la cristallisation bidimensionnelle des protéines, facilitant les études structurales. Cette méthode est particulièrement utile pour les protéines membranaires périphériques et les protéines solubles, et peut également être adaptée aux protéines membranaires intégrales moyennant une optimisation soigneuse.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biophysique
- Biologie structurale
- Biochimie
Contexte
- Des monocouches lipidiques se forment à l'interface air-eau.
- Les groupes polaires restent hydratés dans la phase aqueuse.
- Les chaînes acyles non polaires s'orientent vers l'interface air-eau.
- La nature chimique des groupes polaires des lipides influence l'affinité des protéines.
Objectif de l'étude
- Présenter une méthode pour préparer des monocouches lipidiques.
- Faciliter la cristallisation de diverses protéines.
- Améliorer les études structurales grâce à des techniques d'imagerie perfectionnées.
Méthodes utilisées
- Préparation de monocouches lipidiques à l'interface air-eau.
- Optimisation des conditions de détergent et de dialyse.
- Étude empirique du partitionnement des protéines.
- Techniques d'imagerie électronique pour l'analyse structurale.
Résultats principaux
- Les monocouches lipidiques soutiennent efficacement la cristallisation des protéines.
- Certaines conditions améliorent l'affinité des protéines pour la monocouche.
- Les protéines membranaires intégrales peuvent être cristallisées moyennant une optimisation supplémentaire.
- La méthode fournit une plateforme stable pour l'imagerie électronique.
Conclusions
- Les monocouches lipidiques constituent un outil polyvalent pour la biologie structurale.
- Elles facilitent l'étude des protéines membranaires périphériques et intégrales.
- Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour affiner les conditions permettant des résultats optimaux.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Les méthodes de monocouche lipidique permettent la cristallisation contrôlée de protéines en deux dimensions, soutenant la détermination structurale de cibles membranaires et solubles. Cette approche améliore la validation des cibles en fournissant des plateformes reproductibles pour la caractérisation biophysique, réduisant ainsi l'incertitude en phase précoce de la découverte de médicaments. La technique facilite la réduction des risques mécanistiques grâce à des informations structurales à haute résolution, orientant l'optimisation des candidats médicaments et les décisions portant sur le portefeuille de projets.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des interactions protéine-lipide et des états conformationnels liés à la fonction de la cible.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système standardisé pour évaluer la stabilité de la cible et son aptitude au lien.
- Valeur scientifique : Soutient la validation fonctionnelle de la cible en permettant une analyse structurale dans des conditions proches de l'état natif.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des réseaux protéiques homogènes et ordonnés, adaptés à des applications de criblage à haute résolution.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité de la préparation des échantillons, essentielle pour la cohérence des tests entre différentes équipes.
- Valeur scientifique : Produit des données structurales quantifiables permettant une corrélation avec les résultats fonctionnels des tests.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Fournit des informations structurales sur les protéines membranaires cibles, contribuant à la compréhension des mécanismes des maladies.
- Valeur opérationnelle : Permet de créer des échantillons transférables compatibles avec les protocoles cryo-ME en aval.
- Valeur scientifique : Renforce la fiabilité des prédictions en reliant les caractéristiques structurales à l'activité pharmacologique.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode du monocouche lipidique s'intègre aux flux de travail de découverte précoce, soutenant la validation de cibles et l'identification de composés initiateurs par caractérisation structurale.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses grâce à la visualisation structurale des agencements et interactions des protéines.
- Criblage : Permet la préparation de tests en produisant des cristaux bidimensionnels uniformes pour des mesures biophysiques reproductibles.
- Analytique : Fournit des données d'imagerie haute résolution permettant aux équipes de comparer les états structuraux dans différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes structurales à la continuité préclinique en élucidant les mécanismes cibles.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour le criblage structural portant sur plusieurs cibles protéiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à l'observation structurale directe.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation de la préparation des échantillons pour les études structurales.
- Valeur stratégique : Permet de mieux décider d'aller ou non de l'avant en réduisant l'incertitude structurelle dans le choix des cibles.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque fondée sur des données structurales et fonctionnelles validées.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation des lipides, en purification des protéines et en science des interfaces.
- Dépend de l'accès à des équipements compatibles avec les salles blanches, tels que les seringues Hamilton et les substrats en téflon.
- Implique une standardisation des conditions tampons et des durées d'incubation entre laboratoires.
- Suppose des adaptations selon les différentes classes de protéines, en particulier les protéines membranaires intégrales.
- Est limité par la nécessité d'une optimisation empirique des conditions de détergent et de dialyse pour certains objectifs.
