Analyses Multicolor cytométrie de flux de réponse immunitaire cellulaire dans les macaques rhésus

Cette vidéo montre une procédure de stimulation et de coloration des cellules mononucléées du sang périphérique ou PBMC. Pour l’analyse par cytométrie en flux multicolore, Alec Watts de pbmc isolé du sang total est placé dans des plaques de culture tissulaire. Les cellules sont stimulées chimiquement ou biologiquement pour produire une réponse immunitaire.

Après la stimulation, un cocktail d’anticorps est ajouté pour identifier les types de cellules en fonction des marqueurs de surface exprimés. Les cellules sont ensuite imprégnées et un cocktail différent d’anticorps est ajouté pour détecter l’expression des cytokines intracellulaires, les cellules sont ensuite analysées par des faits pour déterminer les profils de cytokines pour des sous-ensembles spécifiques de PBMC. Bonjour, je m’appelle Amy Courtney et je travaille dans le laboratoire du Dr Jagan SAS au Département d’immunologie du MB Anderson Cancer Center de l’Université du Texas

Bonjour, je m’appelle Hong, elle aussi du laboratoire. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une analyse multicytométrique des réponses des lymphocytes T. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les réponses immunitaires cellulaires chez la Maca Reus.

Alors commençons. Commencer ce protocole à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules viables de pbmc de la Maca de Reuss par la méthode d’exclusion du colorant bleu Trian. Travail dans une hotte à flux laminaire reus.

Suspendre les cellules dans un milieu complet à une concentration de 10 millions de cellules par millilitre pour une stimulation non spécifique à 100 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 96 puits. Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieu contenant du PMA et du CIN pour porter le volume total à 0,2 millilitre avec une concentration finale de 50 nanogrammes par millilitre de PMA et de 500 nanogrammes par millilitre de CIN pour les puits de contrôle négatifs, ajoutez 100 microlitres de milieu complet seul à chacun. Eh bien, incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans l’atmosphère humidifiée à 5 % de dioxyde de carbone après 1,5 heure.

A felden A à la culture à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre et incuber pendant 4,5 heures supplémentaires. Le felden A est ajouté aux cytokines de trapp dans l’appareil Gold G pour augmenter la visibilité avec l’immuno-marquage, après une centrifugeuse de stimulation pour éliminer le fluide, puis un lavage en ajoutant 200 microlitres de lavage à froid, de tampon et de centrifugeuse à basse vitesse. Répétez ce lavage, puis renvoyez 50 microlitres de tampon de lavage à flux.

Les cellules sont maintenant prêtes à être colorées pour l’expression de marqueurs de surface dans chaque puits des cellules remises en suspension. Ajoutez un microlitre de colorant réactif aqua fluorescent fixable vivant et mort préparé selon les instructions du fabricant et du S. Incuber à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant 30 minutes pendant que les cellules sont en incubation.

Préparez les solutions de coloration qui seront utilisées pour les faits dans les microtubes. Tout d’abord, préparez un cocktail debout pour inclure les éléments suivants de manière appropriée. Anticorps monoclonaux titrés marqués par fluorescence, anti CD trois PE SCI sept, anti CD huit Alexa 700 anti CD 28 par CCP SCI 5.5, anti CD 95 A PC et anti CD quatre Pacific Blue Inflow Wash Buffer.

Ensuite, préparez des contrôles de compensation, qui seront utilisés pour déterminer les coefficients de débordement de chaque colorant individuel dans d’autres détecteurs en préparant un tube de chaque anticorps conjugué par fluorescence individuellement en tant que colorant unicolore. Enfin, préparez des colorants de fluorescence moins un ou FMO en combinant tous les réactifs sauf celui qui vous intéresse. Cela sera utilisé pour déterminer la limite entre une population positive et négative en dupliquant les niveaux d’autofluorescence et les données présentes dans des échantillons entièrement colorés.

Une fois que les cellules ont incubé dans la tache morte vivante, lavez-les une fois avec un tampon de lavage à froid pour éliminer l’excès de colorant, aspirez le tampon de lavage. Ajoutez ensuite les solutions de coloration préparées. Incuber les cellules à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant 30 minutes.

Lavez les cellules colorées avec un tampon de lavage à froid pour éliminer l’excès d’anticorps. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution de perméation de fixation BD pendant au moins 10 minutes. Conservez les cellules à quatre degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à 24 heures jusqu’à ce qu’elles soient utilisées ou continuez à étiqueter les cytokines intracellulaires pour marquer les cytokines intracellulaires.

Perme d’abord les cellules dans 100 microlitres d’une perme X. Laver le tampon et incuber pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant l’incubation des cellules. Préparez les anticorps de coloration, les contrôles de compensation et les contrôles FMO dans un tampon de lavage x perm comme précédemment.

Après que les cellules aient été incubées pendant 10 minutes, essorez et retirez le tampon de lavage one x perm. Ajoutez les anticorps colorants appropriés. Ensuite, incubez les cellules et les anticorps pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité après l’incubation.

Lavez les cellules deux fois avec la solution de perméation. Après le lavage final, les cellules sont suspendues dans 1 % d’aldéhyde paraforme dans le DPBS pour fixer les cellules. Conservez les cellules à quatre degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elles soient utilisées pendant 24 heures.

Une fois que les cellules ont été colorées, utilisez un cytomètre à deux flux LSR ou un cytomètre en flux cyan DP pour effectuer les faits. Analysez ensuite les données à l’aide de FlowJo ou d’un logiciel similaire. La composition de PBMC dans la Maca de Reuss a été déterminée à l’aide d’une analyse par télécopieur.

Cette figure montre le schéma de contrôle utilisé pour l’analyse des différents sous-ensembles de cellules T à partir d’un animal représentatif. Les lymphocytes ont d’abord été bloqués par le biais d’un FSC à diffusion vers l’avant par rapport à un SSC à diffusion latérale, puis des lymphocytes vivants ont été identifiés sur la base de la population SSC et AQUA négative. Les lymphocytes T ont ensuite été identifiés par l’expression de CD trois, CD quatre positifs, CD huit négatifs et CD quatre négatifs.

Les lymphocytes T CD quatre positifs et CD 8 positifs ont été distingués en différents sous-ensembles sur la base de l’expression de CD 28 et CD 95 en tant que cellules de mémoire centrale naïve et de mémoire effectrice. Cette figure montre la production d’interféron gamma et d’IL deux dans les applications non stimulées et pma. La CIN a stimulé la CD, quatre lymphocytes T positifs et des sous-ensembles.

Notez les profils de cytokines distincts induits par la stimulation. Dans chaque sous-ensemble. Nous devons vous montrer comment effectuer une analyse par cytométrie multi-flux de pbmc.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de configurer à la fois les commandes de compensation de couleur unique et les commandes fluorescentes moins un. Ces deux contrôles sont nécessaires à l’analyse correcte des données de cytométrie en flux. Veuillez consulter notre protocole écrit pour plus d’informations sur le choix des contrôles de rémunération.

N’oubliez pas non plus que lors de l’utilisation d’anticorps marqués au fluor, il est important de couvrir les échantillons pour les protéger de l’exposition à la lumière. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.