Un test de cytométrie en flux pour identifier des sous-ensembles de cellules immunitaires dans des cellules mononucléées du sang périphérique

Prenez les cellules mononucléées du sang périphérique ou PBMC, une population de cellules mixtes comprenant des lymphocytes et des monocytes.

Ajoutez un colorant de viabilité fluorescente pour distinguer les cellules mortes et un cocktail d’anticorps marqués par fluorescence pour identifier les différents types de cellules.

Les anticorps conjugués au fluorochrome A se lient à des marqueurs de surface - CD3 sur les lymphocytes T, récepteur des lymphocytes T γδ ou TCR sur les lymphocytes T γδ et CD56 sur les cellules tueuses naturelles ou NK.

Les anticorps fluorochromes conjugués B se lient aux CD4 et CD8 sur les lymphocytes T, aux CD19 sur les lymphocytes B et aux CD14 sur les monocytes.

À l’aide de la cytométrie en flux, identifiez les sous-ensembles de cellules vivantes.

Alors que les lymphocytes T CD8⁺ et CD4⁺ sont des CD3⁺, les lymphocytes CD4⁺ se situent entre les lymphocytes CD3 simples positifs et les CD3-CD8 doublement positifs.

Les lymphocytes T γδ expriment des TCR γδ et des CD3 plus élevés que les lymphocytes CD4⁺ et CD8⁺.

Les lymphocytes B et les lymphocytes NK sont CD3^-, mais sont identifiés par CD19 sur les lymphocytes B et CD56 sur les lymphocytes NK.

Les monocytes sont identifiés par l’expression de CD14.

Pour préparer les PBMC à la coloration, transférez 100 microlitres de chaque échantillon sur une plaque à fond en V de 96 puits. Centrifugez la plaque à 350 fois g pendant trois minutes à température ambiante. Soigneusement, aspirez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Dans chaque puits, ajoutez 100 microlitres de PBS contenant un colorant fixable vivant/mort qui réagit avec l’amine libre sur les protéines, et remettez le mélange PBMC en suspension avec précaution.

Par la suite, laissez la plaque reposer pendant 10 minutes à température ambiante pour le marquage des cellules mortes. Pour chaque échantillon, préparez 30 microlitres d’un mélange contenant les sept anticorps. À ce stade, des anticorps titrés contre différentes molécules cibles et dans différents fluorochromes peuvent également être ajoutés. Centrifugez la plaque à 96 puits à 350 fois g pendant trois minutes à température ambiante et aspirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille de cellule.

Ajoutez le cocktail d’anticorps dans chaque puits et remettez en suspension avec précaution sans générer de bulles. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Après 30 minutes, ajoutez 150 microlitres de tampon de coloration dans chaque puits et centrifugez la plaque à 350 fois g pendant trois minutes à température ambiante. Aspirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille cellulaire, et remettez les cellules en suspension dans 200 microlitres de PBS. Les cellules sont maintenant prêtes pour l’analyse par cytométrie en flux.

Pour commencer cette stratégie de contrôle à deux fluorochromes et sept marqueurs, sélectionnez la porte des lymphocytes et créez un diagramme à points avec l’un des deux fluorochromes utilisés dans ce protocole sur chaque axe. Porte sur les lymphocytes T CD8 positifs, identifiés comme des cellules CD3 et CD8 doublement positives dans le coin supérieur droit du graphique à points. Excluez la population CD8 faible, qui pourrait contenir des lymphocytes T NK. Gate sur les lymphocytes T CD4 positifs, identifiés comme la population située entre les lymphocytes T CD8 positifs et les populations CD3 mono-positives.

Porte sur les lymphocytes T gamma-delta, identifiés comme des cellules CD3 élevées. Subdivisez les lymphocytes T gamma-delta en CD8 positifs et CD8 négatifs. Gate sur les cellules NK, identifiées comme la population située entre les cellules CD3 positives et CD3 négatives. Subdivisez les cellules NK en Gate CD8 positif et CD8 négatif sur les cellules B, identifiées comme la population CD3 négative et CD19 positive dans le coin inférieur droit du graphique à points.

Sélectionnez la porte monocytaire et créez un diagramme à points avec l’un des deux fluorochromes utilisés dans ce protocole sur chaque axe. Porte sur la population CD3 négative et CD14 positive.