Vidéo analyse bioinformatique des droits de croissance de la tige colonie de cellules embryonnaires

Ce protocole démontre la méthode de bio-informatique vidéo pour mesurer la croissance des colonies de cellules souches embryonnaires humaines en analysant des vidéos en accéléré collectées dans un incubateur CT de biostation icône, équipé d’une caméra pour l’imagerie vidéo. Les cellules souches embryonnaires humaines ou les colonies HESC sont cultivées à 70 % de fluidité, replaquées et incubées pendant 48 heures, après quoi les colonies HESC sont filmées pendant 48 heures supplémentaires dans le ct de Biot. Le taux de croissance est déterminé à l’aide de recettes d’amélioration de la segmentation et de mesure développées avec le logiciel quantitatif CL.

Les recettes sont validées par comparaison avec Adobe Photoshop, un outil d’analyse d’images qui permet un ajustement manuel précis du masque à chaque colonie. Le domaine émergent de la bio-informatique vidéo peut être utilisé pour automatiser le traitement, l’analyse et l’extraction de données biologiques à partir de vidéos microscopiques. Bonjour, je suis Serena Lin du laboratoire du Dr Prou Talbot au Département de biologie cellulaire et de neurosciences ici à l’Université de Californie à Riverside.

Bonjour, je m’appelle Sean Fino, je travaille également au laboratoire Talbot. Bonjour, je m’appelle TI Satish et je travaille dans le cadre du programme d’études supérieures en biologie moléculaire cellulaire et du développement. Aujourd’hui, nous allons vous montrer comment mesurer la croissance des colonies de cellules souches embryonnaires humaines à l’aide d’outils bioinformatiques vidéo.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour mesurer les effets des substances toxiques environnementales sur le comportement des cellules souches embryonnaires humaines. Nous ferons la démonstration de cette procédure dans notre nouvelle plateforme de cellules souches. Alors commençons.

Pour préparer HESC à l’analyse vidéo, cultivez HESC Sur des plaques à six puits enduites de matrigel jusqu’à 70 % de milieu d’aspiration confluent d’un puits contenant de l’HESC et rincez deux fois avec un millilitre de PBS. Ajoutez un millilitre d’Accutane et incubez pendant une minute à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, ajoutez 10 à 12 perles de verre dans le puits et secouez doucement la plaque jusqu’à ce que les colonies se détachent complètement.

Neutralisez Accutane à l’aide d’un millilitre de milieu d’entretien de cellules souches embryonnaires humaines, ou de fibroblastes embryonnaires de souris. Prélever les cellules détachées sans les billes dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger à 200 G pendant trois minutes. Décantez le SUP natant et cassez la pastille avec 500 microlitres de milieu d’entretien de cellules souches embryonnaires humaines fraîches ou une plaque M-T-E-S-R 100 microlitres de la suspension HESC goutte à goutte dans plusieurs puits d’une plaque revêtue de matrigel à 12 puits.

Balancez doucement la plaque d’avant en arrière et observez les cultures au microscope optique pour que les amas de cellules soient uniformément répartis dans les puits. Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés et à 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures pour vous assurer que les cellules sont fixées à plat et suffisamment grandes pour être facilement visualisées. Après 48 heures, aspirez le milieu et lavez bien avec 500 microlitres de PBS pour éliminer les cellules détachées, puis ajoutez 500 microlitres de milieu M-T-E-S-R à chacun.

Placez immédiatement la plaque dans le CT de Biot et commencez à collecter des images en accéléré. Essayez de sélectionner des champs avec des colonies uniques discrètes qui ne risquent pas de se transformer en d’autres colonies. Dans ce protocole, les cellules sont enregistrées sur vidéo pendant 48 heures supplémentaires avec des images à sept minutes d’intervalle.

Pour créer d’abord la recette de segmentation, analysez manuellement l’intégralité de la vidéo pour vérifier qu’elle contient une seule colonie qui reste concentrée tout au long de la période d’enregistrement. Ensuite, ouvrez l’assistant de segmentation dans le logiciel CL quants et cliquez sur le bouton suivant. Sélectionnez le canal d’image approprié et cliquez sur le bouton suivant.

Choisissez la correspondance paramétrable et cliquez sur Suivant. Sélectionnez une ou deux régions souhaitées en encerclant le bord extérieur jusqu’à la zone centrale de la colonie. Cette zone doit être aussi petite que possible, mais doit être représentative de l’ensemble de la colonie.

Ne choisissez pas trop de régions car cela pourrait entraîner une application de masque imprécise. Cliquez sur le bouton suivant. Sélectionnez Régions à ne pas vouloir en encerclant les régions qui ne font pas partie de la colonie et qui ne font pas partie de l’arrière-plan.

Ces régions ont des motifs qui doivent être supprimés, tels que les débris et les cellules mortes. Cliquez sur suivant. Sélectionnez l’arrière-plan en encerclant les régions qui ne sont pas des colonies, des débris ou des cellules mortes.

L’arrière-plan doit être uniforme et susceptible d’apparaître dans chaque image. En règle générale, nous sélectionnons le fond gris autour de la colonie. Cliquez sur le bouton suivant.

Un masque coloré doit être affiché sur la région d’intérêt si le masque ne couvre pas précisément la région d’intérêt. La plage de seuil de segmentation dans le coin inférieur droit de l’écran peut être augmentée ou diminuée si un changement de masque est nécessaire. Sélectionnez Met à jour les régions de correspondance réversible.

Cela permet de modifier les zones Ne veut pas ou Arrière-plan. Si le masque est satisfaisant, sélectionnez appliquer le seuil et enregistrer mon masque. Cliquez ensuite sur le bouton suivant.

Le masque sera alors affiché dans une couleur différente. Sélectionnez Terminer. La recette doit être affichée dans le coin supérieur droit du logiciel en tant que recette de segmentation.

Renommez la recette si vous le souhaitez en faisant un clic droit et en saisissant un nouveau nom. Pour appliquer la recette. Faites un clic droit et placez la souris dessus.

Appliquer la recette. Un menu s’affiche permettant de sélectionner le nombre de cadres à utiliser. Réglez l’intervalle d’images sur toutes les 20 images pour garantir la fidélité du masque.

Vérifiez manuellement de manière aléatoire 10 % des images auxquelles le masque a été appliqué pour créer une recette d’amélioration qui élimine les zones indésirables dans les débris. Cliquez avec le bouton droit sur le dossier de la recette d’amélioration, puis cliquez sur Nouveau. Une nouvelle recette d’amélioration doit être affichée à partir du champ de vision d’origine.

Passez la souris sur les icônes de la barre d’outils pour identifier le bouton du module d’amélioration situé à droite de l’image et cliquez dessus. Sélectionnez le menu déroulant Étiquetage. Sélectionnez l’étiquetage pour les deux connectés. Sélectionnez l’étiquetage pour les deux connectés.

Une nouvelle barre des tâches doit s’afficher. Saisissez le masque initial de la recette de segmentation et faites-le glisser vers la zone de saisie. La barre doit maintenant afficher le numéro du masque de saisie.

Faites glisser l’icône avec le numéro de masque d’entrée vers l’icône zéro du masque. Recherchez la taille minimale dans la barre des tâches et ajustez le nombre jusqu’à ce que seule la région d’intérêt s’affiche. Assurez-vous de cliquer sur exécuter pour chaque essai de montage.

Une fois que l’ajustement de la taille minimale est satisfaisant, cliquez sur la recette d’amélioration précédente en bas de l’écran, sélectionnez Enregistrer dans la recette. Le logiciel vous invite maintenant à écraser la recette sélectionnée et à sélectionner l’endroit oui. Vérifiez la recette d’amélioration en utilisant la même procédure que celle de la segmentation par vérification ponctuelle.

Si vous êtes satisfait des recettes de segmentation et d’amélioration, passez à la création du modèle de mesure. Pour commencer la sélection, créez un modèle de mesure dans la barre d’outils de droite. Dans la fenêtre de mesure, sélectionnez Déplacer le curseur sur la figure de la cellule d’image clipart.

Maintenez la touche Ctrl enfoncée et sélectionnez la cellule sous la section morphologie, décochez le paramètre par défaut et cochez le paramètre de zone. Quittez ensuite la fenêtre du modèle. Sélectionnez l’icône.

Créez une recette de mesure. Renommez la recette. Dans le coin supérieur droit, faites glisser et déposez le modèle de mesure précédemment créé sur la fenêtre de mesure.

Cliquez sur Oui pour continuer dans la fenêtre de recette de mesure, sélectionnez Mappages de canaux. Ensuite, la cellule entière sélectionne les mappages de masque. Sélectionnez ensuite l’option de cellule entière Pour un masque amélioré, sélectionnez la recette de mesure sous l’onglet recette.

Dans la fenêtre principale, sélectionnez l’icône d’enregistrement dans la fenêtre de la recette de mesure. Fermez ensuite la fenêtre Suivant et rouvrez le champ de vision. Cliquez avec le bouton droit sur le dossier de la liste de recettes, puis cliquez sur nouveau, faites glisser les recettes dans l’ordre de l’application nécessaire dans la liste de recettes, sélectionnez Verrouiller la liste de recettes et exécutez les recettes de manière séquentielle sur les données vidéo à l’aide d’Adobe Photoshop.

Toutes les 20 images des mêmes colonies ont été analysées. Ouvrez manuellement le cadre d’une image de colonie dans Adobe Photoshop. Cliquez sur l’outil baguette magique dans la barre d’outils.

Cliquez sur la zone autour de la colonie pour que tout le champ soit couvert à l’exception de la région de la colonie. Assurez-vous que la ligne pointillée autour de la colonie s’adapte juste autour de la périphérie de la colonie et non à l’intérieur de celle-ci. Si la ligne pointillée ne se trouve pas autour de la périphérie, modifiez la valeur de tolérance dans la barre d’outils supérieure en conséquence.

Cliquez sur Modifier en mode masque rapide dans la barre d’outils et cliquez sur la colonie pour la sélectionner. Allez dans la fenêtre, dans le menu déroulant et cliquez sur histogramme. Le cache doit être défini sur un.

Si le cache est de deux, cliquez sur le point d’expression exclamation pour remplacer le cache par un. Enregistrez la valeur du pixel dans une feuille de calcul. Répétez le processus ci-dessus toutes les 20 images.

Les données collectées à l’aide de Photoshop et des logiciels quantitatifs CL peuvent ensuite être tracées ensemble. Notre protocole de quantification de la croissance des colonies d’HESC démontre une application de la bio-informatique vidéo à un problème biologique. Nous montrons ici un graphique comparant l’augmentation de la taille de la colonie sur 48 heures, déterminée à l’aide du logiciel CL quant et d’Adobe Photoshop.

Le graphique montre cinq colonies différentes, chacune analysée par les deux logiciels. Chaque colonie est représentée par une couleur différente. Les lignes pleines ont été dérivées à l’aide du logiciel sail quant, tandis que les lignes pointillées ont été collectées à l’aide de Photoshop.

Le graphique des données brutes montre que les deux méthodes de mesure sont en bon accord pour tenir compte du fait que les colonies ont une taille de départ différente. Cette figure montre les données représentées en pourcentage d’augmentation de la taille de la colonie. Les taux de croissance sont similaires quelle que soit la taille de la colonie de départ, et les deux mesures d’analyse donnent des résultats similaires.

Le graphique suivant montre les moyennes des données précédentes sur la croissance des colonies de HESC. Ce graphique montre clairement une bonne concordance entre l’analyse réalisée à l’aide de la bioinformatique vidéo et d’Adobe Photoshop. Nous venons de vous montrer comment mesurer la croissance d’une colonie de cellules souches embryonnaires humaines à l’aide d’outils de bioinformatique vidéo.

Lorsque vous effectuez cette procédure à l’aide de la microscopie à contraste de phase, assurez-vous d’inclure le halo autour de la colonie pour une sélection précise de la colonie par le logiciel. Il est également important de se rappeler que d’autres méthodes de culture, d’incubation et de collecte de vidéos peuvent être utilisées à la place du protocole que nous avons démontré. Une fois les recettes développées et validées, elles effectueront l’analyse beaucoup plus rapidement et avec moins de variations expérimentales que l’analyse manuelle.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.