Photostimulation motifs avec les périphériques numériques Micromirror chargé d'enquêter sur l'intégration à travers des points dendritiques Direction

L’objectif global de cette procédure est de contrôler des motifs complexes de lumière dans le temps et l’espace afin qu’elle puisse être utilisée pour stimuler les neurones. Pour ce faire, il suffit de positionner d’abord une puce DMD sur un plan d’image conjugué approprié dans le chemin optique du microscope. La deuxième étape de la procédure consiste à éclairer correctement le DMD avec une source de lumière intense telle qu’un laser.

La troisième étape de la procédure consiste à éliminer l’effet de moucheture d’un éclairage cohérent. La dernière étape de la procédure consiste à intégrer une interface utilisateur graphique pour manipuler la puce DMD. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent que des expériences qui étaient auparavant difficiles à réaliser peuvent maintenant être réalisées relativement facilement grâce à la lyse multisite de neurotransmetteurs en cage à l’aide du système DMD.

Bonjour, je m’appelle Michael Mohammed et je suis le laboratoire du Dr Chaman Tang au département de neurologie de l’Université du Maryland. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de générer des motifs complexes d’élimination dans un microscope optique. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l’intégration dendritique.

Alors commençons. Ce protocole démontrera le fonctionnement d’un dispositif numérique à micro-miroirs ou d’un système d’éclairage DMD pour les neurosciences expérimentales. Un DMD est une puce semi-conductrice optique avec plusieurs centaines de milliers de miroirs mobiles microscopiques disposés en un réseau rectangulaire À sa surface, la position de chaque miroir correspond au pixel d’une image.

Chaque miroir peut être contrôlé individuellement pour s’incliner entre deux orientations. Dans l’orientation éteinte, la lumière est dirigée à l’opposé de l’axe optique de l’éclairage de l’échantillon. Dans l’orientation on, la lumière est dirigée le long de l’axe optique.

La DMD est bien adaptée à la lyse car elle tolère une lumière UV très intense, génère des rapports de contraste élevés entre les pixels allumés et éteints et peut passer d’un état à l’autre en quelques dizaines de microsecondes. L’application des DMD pour la recherche biomédicale est facilitée par l’utilisation généralisée de logiciels et de matériel de manipulation d’images, et par l’intérêt commercial dans le domaine de l’affichage d’images. Les composants modulaires sont commercialisés par Texas Instruments sous forme de kits de découverte DLP qui fournissent les pilotes électroniques de support pour adapter le DMD à un système microscopique.

Les concepts de base concernant l’optique de la microscopie doivent être compris. Le microscope fluorescent moderne de base se compose d’un chemin d’imagerie et d’un chemin d’éclairage. Il est composé d’un objectif, d’un cube de filtre et de deux lentilles de tube distinctes pour le chemin d’imagerie et d’éclairage.

Le microscope est conçu pour avoir des positions conjuguées au plan d’image de l’échantillon, où les objets mis au point dans le plan de l’échantillon apparaîtront également nets dans ces plans d’image conjugués. Un corollaire de ce concept est que toute image brillante créée au niveau du plan d’image conjugué serait également projetée de manière nette sur le plan d’image de l’échantillon. Cette stratégie est utilisée pour projeter un motif d’éclairage généré par ordinateur sur l’échantillon.

Le faisceau laser sert de source lumineuse très brillante qui éclairera le motif mis en œuvre par les micro-miroirs sur les puces DMD positionnées sur un plan d’image conjugué. La conception d’un système d’éclairage DMD dépend des lumières d’excitation utilisées pour les expériences d’optogénétique, qui utilisent la lumière dans la longueur d’onde visible. Le motif éclairé peut être amené à travers la trajectoire de la caméra.

Par conséquent, la puce DMD peut simplement être montée sur l’un des deux ports de caméra d’un module de port de caméra double. À l’inverse, pour les expériences qui utilisent la lumière dans la gamme UV, telles que la lyse de composés en cage, la lumière doit être amenée à travers le chemin d’éclairage épi et un plan d’image conjugué plus accessible doit être créé. En effet, la lentille du tube d’imagerie n’est pas conçue pour la transmission UV.

Au lieu de cela, la lentille du tube d’éclairage est utilisée pour la transmission UV et effectue un travail adéquat dans la formation de l’image. Chaque micro-miroir du DMD peut basculer entre une inclinaison positive et une inclinaison négative de 12 degrés par rapport au plan de la puce. En fonction de l’entrée numérique qu’il reçoit de l’ordinateur, l’axe de rotation se trouve le long des coins diagonaux de chaque miroir, à 45 degrés par rapport aux côtés rectangulaires de la puce.

L’orientation de l’inclinaison du miroir est indiquée par un triangle de couleur or à un coin de la surface avant de la puce. L’inclinaison du micro-miroir dicte l’alignement de l’inclinaison et de l’azimut du faisceau d’éclairage entrant. Pour éclairer le DMD, configurez d’abord l’inclinaison du faisceau d’éclairage pour qu’il soit de 24 degrés par rapport à l’axe perpendiculaire de la puce DMD et configurez l’azimut pour qu’il soit perpendiculaire à l’axe de rotation du miroir.

Un alignement précis du faisceau est essentiel pour un fonctionnement efficace. Pour les expériences de lyse. Utilisez une source laser pour générer le faisceau focalisable de haute intensité nécessaire à un décantage rapide.

Ici, un laser ND ate triplé à fréquence solide pompé par diode quasi continue est utilisé, utilisez un laser de puissance relativement élevée car seule une petite fraction de la sortie laser est réellement délivrée à l’échantillon. Lorsque vous utilisez un système DMD, lancez la sortie du laser dans une fibre multimode afin qu’il puisse être facilement positionné et orienté le long du bon axe d’éclairage du DMD afin de fournir une solution au pointillé. Problème généré par l’éclairage cohérent transmettre la lumière à travers la fibre optique.

La fibre est enroulée autour d’une civière à fibre pazo électrique qui est entraînée pour la faire osciller autour de 40 kilohertz. L’étirement microscopique de la fibre est suffisant pour déplacer le motif de chatoiement plusieurs fois pendant la durée de la milliseconde de chaque impulsion de photostimulation, éliminant ainsi efficacement le chatoiement. Enfin, la sortie de la fibre optique est assemblée avec un objectif de microscope UV pour éclairer les DMD afin de co-enregistrer le pixel CCD avec le logiciel d’image DMD qui corrèle les miroirs DMD individuels à des pixels spécifiques de la caméra CCD d’imagerie qui a été écrite.

L’interface utilisateur graphique du logiciel permet à l’utilisateur d’attribuer l’orientation du miroir DMD qui correspond à la région de l’image CCD avec la souris de l’ordinateur à l’aide de l’interface utilisateur graphique. Marquez l’emplacement de la stimulation photo en déplaçant le curseur sur l’image affichée sur l’écran de l’ordinateur et cliquez sur la région d’intérêt balisée pour programmer le magasin de modèles de diffusion de lumière. Le motif marqué sur l’écran de l’ordinateur sous la forme d’une série d’images distinctes programme la synchronisation des impulsions laser pour chaque motif spatial dans le logiciel.

Cela s’intégrera avec le programme d’acquisition de données P clamp. Enfin, utilisez le programme d’acquisition de données pour coordonner le timing de l’électronique DMD, le déclenchement du laser et l’acquisition du signal électrique par patch clampé à partir du neurone cible. Ici, un étalonnage de la résolution du système optique est montré.

La taille minimale du spot est mesurée à partir d’une cible fluorescente. La résolution physiologique effective est mesurée par l’amplitude du flux de courant en fonction de la photostimulation. Ici, le glutamate en cage a été photographié à côté d’une branche dendritique de deux micromètres de diamètre.

Comme le spot a été déplacé. Orthogonalement à travers les dite, les réponses électriques à la photostimulation de différentes intensités sont illustrées. Les réponses en fonction de l’intensité de la lyse sont présentées.

La stimulation dendritique distribuée peut être facilement mise en œuvre à l’aide d’un système basé sur la DMD. Ici, l’intensité de l’entrée a été modifiée en augmentant le nombre de points de stimulation photographique marqués par des cercles sur les deux branches dendritiques. La sommation spatiale peut être non linéaire entre les points de branche.

Il devient de plus en plus super linéaire avec des amplitudes d’entrée croissantes arrivant sur les deux portes des branches. Ces résultats illustrent clairement la manière non linéaire de sommation entre les points de branche dendritiques. La super linéarité est largement médiée par les récepteurs NMDA et non par les canaux voltage-dépendants.

Cela peut être démontré par l’application de deux antagonistes NMDA A PV et MK 8 0 1 élimine en grande partie le comportement non linéaire. Nous venons de vous montrer la conception et le fonctionnement de base d’un système basé sur DMD pour la photostimulation de motifs du tissu neural. Le système peut être adapté pour la stimulation par la lumière visible, comme utilisé pour les expériences optogénétiques.

Il peut également être adaptatif aux lumières proches UV comme utilisé pour la lyse de photons uniques. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que si une lumière à une longueur d’onde inférieure à 400 nanomètres doit être utilisée et que la plupart des gens sortent par le chemin d’éclairage épi, l’alignement précis du faisceau éclairant à quelques degrés près est essentiel, et que si une lumière cohérente est utilisée, le chatoiement doit être efficacement éliminé. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.