Un multi-électrode système de patch-clamp assistée par ordinateur

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer des enregistrements de patch clamp d’un maximum de 12 cellules en mode cellule entière. Pour ce faire, il suffit d’abord de marquer la position de chaque cellule d’intérêt et d’attribuer une pipette à chaque cellule. La deuxième étape consiste à localiser l’extrémité de chaque pipette et à déplacer automatiquement les pipettes à côté des cellules qui leur sont attribuées.

Ensuite, approchez-vous de chaque cellule avec une pipette à la fois. Pour établir des joints étanches avec la membrane cellulaire, l’étape finale consiste à rompre la membrane des cellules et à effectuer des enregistrements de cellules entières. En fin de compte, l’enregistrement assisté par ordinateur est utilisé pour montrer les propriétés de réseau de petits circuits neuronaux avec une haute résolution.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le patch clamp manuel est que le nombre de connexions pouvant être observées dans un réseau augmente avec le carré du nombre de neurones enregistrés. La démonstration visuelle de cette technique est importante car les étapes de patch clamp peuvent être difficiles à apprendre en raison de la complexité et de la vitesse à laquelle elles doivent être effectuées. Commencez cette procédure en plaçant une tranche de cerveau avec la région d’intérêt au centre de la plage de déplacement du microscope.

Ensuite, identifiez les cellules d’intérêt. Enregistrez ensuite la position des cellules en fonction du système de coordonnées du microscope. L’interface graphique affichera les cellules sélectionnées ainsi que les micro-pipettes pour une vue d’ensemble, et le logiciel ajoutera un marqueur sur la position de la cellule qui sera superposé sur les images.

De plus, une image de la cellule est capturée pour référence future. Après avoir sélectionné les cellules qui vous intéressent, attribuez les pipettes qui seront utilisées pour enregistrer les cellules individuelles en définissant les commandes d’assignation dans l’interface graphique. Visualisez un aperçu de la configuration finale en cochant la case afficher les positions finales.

Préparez maintenant les pipettes avec une solution intracellulaire et placez-les sur leurs supports. Placez les étages de tête dans leurs fixations, mais ne les faites pas glisser vers l’avant. Pour éviter de toucher le bain avec la pointe de la pipette, activez la commande de pression positive et sélectionnez toutes les pipettes.

Pour vous assurer que les pointes resteront propres, faites glisser doucement chaque étage de tête en place. Ensuite, positionnez le microscope en position centrale avec une mise au point de deux millimètres au-dessus de la tranche en appuyant sur le bouton R deux tout en maintenant le bouton A.Utilisez la position correspondante pour chaque manipulateur telle qu’enregistrée à partir de l’expérience précédente en appuyant sur le bouton L deux tout en maintenant le bouton A.At ce point, il doit y avoir soit une ombre distinctive de la pipette en vue, soit un petit mouvement le long de l’axe des pipettes doit suffire pour l’observer. La compensation des légères différences de forme de la pipette doit être effectuée manuellement.

Ensuite, faites la mise au point sur la pointe de la pipette. Placez ensuite l’embout sur le point central rouge de l’écran vidéo. Sans déplacer le microscope, informez le logiciel que la pipette se trouve au centre de l’écran en appuyant sur le bouton Z tout en maintenant le bouton C du contrôleur.

Une fois que la pointe de pipette individuelle est localisée, envoyez cette pipette vers l’arrière afin que la suivante puisse être localisée en appuyant sur le bouton L tout en maintenant le bouton a enfoncé. Une fois que toutes les pointes de pipette ont été localisées avec précision et que chaque pipette est attribuée à une cellule. Positionnez automatiquement les pipettes à proximité de leurs cellules respectives en cliquant simplement avec le bouton droit de la souris au centre du groupe de cellules dans la fenêtre de représentation graphique et en sélectionnant le groupe d’options dans le menu contextuel.

Dans la fenêtre des options du cluster, sélectionnez toutes les pipettes que vous souhaitez positionner à ce moment et cliquez sur OK avec les pipettes cochées. Répétez cette procédure pour chaque groupe de cellules d’intérêt. Pour effectuer l’approche finale, spécifiez la position des pipettes par rapport aux cellules à 200 microns de la cellule dans l’axe de la pipette et à 200 microns au-dessus de celle-ci dans le sens vertical, ce qui est suffisant pour maintenir la pointe de la pipette à l’extérieur du tissu.

Attendez ensuite que le positionnement des pipettes soit terminé. Déplacez ensuite le microscope vers la pipette en appuyant sur le bouton R un tout en maintenant le bouton C.Recalibrez chaque position de pipette en focalisant le microscope sur sa pointe n’importe où sur l’affichage vidéo et en appuyant sur le bouton B tout en maintenant le bouton C.Une grille carrée devrait apparaître brièvement indiquant la position identifiée de la pipette. Si la position n’est pas correcte, placez l’embout sur le point central de l’écran vidéo et appuyez sur la touche Z tout en maintenant la touche C de la manette.

Vérifiez maintenant que la cellule d’intérêt de la pipette actuelle est correctement marquée, activement marquée. Sinon, déplacez le microscope pour qu’il corresponde à la cellule d’intérêt avec le point rouge central marquant la cellule en appuyant sur le bouton Y tout en maintenant le bouton C.Appuyez ensuite sur le bouton L deux tout en maintenant le bouton enfoncé C.To positionnez la pipette à 200 microns de sa cellule assignée, le microscope se déplacera automatiquement vers la position correspondante. Ajustez la position de la pipette pour qu’elle corresponde au point rouge.

Ajustez ensuite le décalage de la pipette en appuyant sur le bouton R one. Tout en maintenant le bouton x. Activez l’impulsion de test en appuyant sur le bouton L one tout en maintenant le bouton x enfoncé.

Après cela, déplacez lentement la pipette vers la cellule qui lui est attribuée. Après avoir observé la formation d’une fossette à la surface de la membrane de la cellule, appliquez une brève impulsion de pression négative en appuyant sur le bouton Y tout en maintenant le bouton Z enfoncé pour permettre à la pression appliquée d’atteindre la cellule. Un potentiel de maintien d’environ moins 65 millivolts doit être établi à ce stade en appuyant sur le bouton L deux tout en maintenant le bouton x enfoncé.

Une fois qu’un giga joint est formé pour chaque cellule, commencez à rompre les membranes en appliquant une pression négative. Ensuite, utilisez le système d’acquisition de stimulation pour effectuer l’enregistrement. Appliquez des impulsions ou des trains d’impulsions sur des cellules individuelles une par une, et observez les réponses des cellules restantes pour cartographier la connectivité entre ces cellules enregistrées.

Une fois les enregistrements terminés, retirez lentement les pipettes du tissu en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le bouton radio de la table. Sélectionnez les pipettes reculées de 500 microns pour que les pipettes reculent sur une courte distance le long de leurs axes. Observez ensuite la dérive du potentiel des cellules à reculer des pipettes.

Réglez la vitesse de positionnement sur rapide et répétez la même opération, mais choisissez l’option tout. Retirez les pipettes usagées en les faisant glisser doucement vers l’extérieur des étages de tête et en dévissant les pipettes des supports. Voici un exemple de réseaux de connexions synaptiques directes cartographiés dans des expériences individuelles.

Ces trois diagrammes de connectivité sont des ensembles de 12 cellules paramétalliques enregistrées dans la couche cinq avec des distances intersomatiques respectives. Et voici le schéma de connectivité superposé à la coloration morphologique des cellules paramétalliques enregistrées. Cette figure montre l’effet de voisinage commun.

Les colonnes bleues indiquent les paires de neurones qui sont connectées simultanément à au moins un autre neurone du réseau échantillonné. Graphique A : Probabilité considérablement accrue d’être interconnectés. Ici, on voit que les paires de neurones partageant plusieurs voisins communs se produisent plus souvent que prévu par hasard dans les réseaux échantillonnés, la probabilité de connexion au sein des paires de neurones augmente en fonction du nombre de voisins communs partagés par le payeur.

Ces propriétés donnent à leur tour naissance à des réseaux groupés de petits mondes. Cette figure montre la quantification du recrutement des cellules de Martinnty. Il s’agit d’une représentation graphique d’une cellule paramétallique en rouge qui forme des synapses sur une cellule de Martin nty en bleu, qui à son tour forme une synapse sur une deuxième cellule paramétallique.

Chez le noir, la stimulation supra-seuil de la cellule paramétallique conduit au recrutement de la cellule de Martin. Par l’intégration de potentiels post-synaptiques excitateurs facilitants, la cellule de Martin recrutée inhibe ensuite la deuxième cellule paramétallique. Ce diagramme représente la stimulation d’un nombre croissant de cellules paramétalliques à patch clampé et les effets sur une autre cellule paramétallique.

Voici les potentiels postsynaptiques inhibiteurs moyens enregistrés à partir d’une cellule paramétallique en fonction du nombre d’autres cellules paramétalliques voisines qui sont stimulées. L’amplitude de l’inhibition synaptique de DYS dans un circuit local a tendance à saturer lorsque neuf cellules paramétalliques ou plus sont stimulées et la fraction de cellules recevant l’inhibition synaptique de DYS augmente rapidement à un lorsque le nombre croissant de cellules paramétalliques est stimulé. Lors de cette procédure, il est important de garder les pointes des pipettes propres et de minimiser la distorsion des tissus en évitant les vaisseaux sanguins et autres cellules pendant la phase d’approche.

À la suite de cette procédure, des méthodes supplémentaires peuvent être utilisées, telles que la photostimulation, pour répondre à des questions supplémentaires telles que l’innovation des cellules de serrage patchées par un autre type de cellule. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’accélérer et d’effectuer la procédure de serrage du patch pour plusieurs neurones.