Encyclopedia of Experiments: Biology
Un abonnement à JoVE est nécessaire pour afficher ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Begin met een druppel bufferoplossing op een microscoopschuif en breng intacte wormen over naar de druppel. Zodra de wormen op hun plaats zijn, gebruikt u een pluisvrij weefsel om de buffer op te nemen en te verwijderen. Bevestig het monster door de monsters meerdere keren met 90% ethanol te baden, zodat het na elke toepassing kan verdampen.
Zodra de ethanol na de laatste spoeling is verdampt, voegt u een oplossing met de nucleïnezuurkleurstof DAPI toe aan het monster. DAPI bindt bij voorkeur aan adenine- en thyminebases in de kleine groef van DNA. Wanneer gebonden, absorbeert het DAPI-DNA-complex UV-licht en zendt zichtbaar blauw licht uit.
Voeg vervolgens een anti-fade conserveermiddel toe om de houdbaarheid van het monster te verlengen. Breng een afdekstrip aan en sluit het af op de dia. Gebruik vervolgens een fluorescerende microscoop met een blauw filter om DAPI-lichamen te visualiseren, die, afhankelijk van de cel en de cyclusstatus, enkelvoudige chromosomen, zusterchromatidenparen of hele kernen kunnen vertegenwoordigen. In dit experiment tellen we DAPI-gebeitst zusterchromatidenparen in oöcyten, om tetraploïde stammen van Caenorhabditis elegans te identificeren.
- Tetraploïde stammen hebben 12 chromosoomparen, die kunnen worden gevalideerd door de DAPI-bevlekte lichamen in onbevruchte oöcyten te tellen. Laat hiervoor vijf tot tien microliters M9-buffer op een dia vallen en breng zes tot tien putatieve tetraploïden in de druppel over. Onder een ontleedmicroscoop neemt u het grootste deel van de M9 voorzichtig op in een pluisvrij reinigingsweefsel.
Laat vervolgens 10 microliters van 90% ethanol op de wormen vallen en kijk hoe de ethanol volledig verdampt. Zodra de verdamping is voltooid, herhaalt u het proces van het toevoegen van ethanol en het zien verdampen. Voeg in totaal 10 microliters toe in vier toepassingen. Voeg na de laatste druppel zes microliters DAPI toe aan twee nanogram per microliter, of een vergelijkbare vlek.
Voor langdurige opslag van de dia's, monteer de wormen in een in de handel verkrijgbare of zelfgemaakte anti-fade. Voeg vervolgens een coverslip toe en sluit de randen af met nagellak. Nadat de nagellak is opgedroogd, kunnen de dia's worden gescoord. Gebruik een fluorescerende microscoop en 100 x vergroting.
Zoek eerst de meest volwassen onbevruchte oöcyt, die direct grenst aan de spermatheca, en nog niet in de spermatheca of de baarmoeder is gekomen. De DAPI-lichamen hier zijn vermoedelijk enkele chromosoomparen. Richt je vervolgens op de kern van de oöcyt en gebruik de fijne focus van de microscoop om deze langzaam te scannen, van boven naar beneden, terwijl je de DAPI-lichamen telt. Vertel vervolgens de DAPI-lichamen in dezelfde kern door de focus van onder naar boven te verplaatsen.
Wilde type oöcyten hebben gemiddeld zes DAPI-lichamen. De aanwezigheid van 12 DAPI-lichamen geeft aan dat de dieren in deze stam gedeeltelijke of volledige tetraploïden zijn. Analyseer ten minste 10 dieren per stam. Vaak zullen chromosoomparen zeer dichtbij zijn of aanraken, dus het aantal DAPI-lichamen is vaak kleiner dan het werkelijke aantal chromosoomparen.
