Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Commencez par une boîte de Pétri contenant des embryons dans le milieu E3. Ajoutez de la tricaine pour anesthésier les embryons et la phénylthiouria, solution PTU, pour inhiber la formation de pigments. À l’aide d’un microscope disséquant, déchorionnaliser les embryons.
Utilisez une pipette en verre pour transférer l’un des embryons déchorionnés dans une petite boîte de Pétri avec un fond de verre peu profond bien au centre et enlever l’excès de milieu. Ensuite, placez une solution d’agarose à une concentration optimale pour minimiser la distorsion et la motilité de l’embryon dans un tube de microfuge et chauffez-le. Faites baisser la température à 30 degrés Celsius pour éviter d’endommager l’embryon en raison de la chaleur.
Verser la première couche d’agarose sur l’embryon, en remplissant complètement le puits peu profond. Placer un autre verre de couverture sur le puits et ajouter 1 % d’agarose sur le dessus. La deuxième couche maintient le verre de couverture en place.
Une fois que l’agarose se solidifie, remplissez la boîte de Pétri avec le milieu E3 contenant de la tricaine. Il s’agit de la troisième couche et maintient l’agarose et l’embryon hydratés. Dans le protocole suivant, nous effectuerons le montage en couches d’agar d’embryons de poisson zèbre pour une imagerie prolongée du laps de temps.
- Juste avant le montage, chauffer la solution agarose à 65 degrés Celsius, puis laisser refroidir à environ 30 degrés Celsius afin que l’embryon ne soit pas blessé par la chaleur et ajouter de la tricaine à la solution agarose. Utilisez des plats de fond en verre de 35 millimètres avec un fond de verre couvert numéro zéro. Placez délicatement un embryon déchorionné avec l’un de ses côtés latéraux vers le fond du plat avec une pipette en verre ou une micropipette. Puis retirez soigneusement tout E3 restant avec une micropipette.
ajouter le premier Agarose solution À le petit puits créé par le couvrir verre attaché À le fond de le plat À couvrir le embryon confection sûr cela le Agarose Couvre le petit puits mais fait non déborder il. couvrir le petit puits avec le couvrir verre À créer un étroit rempli d’agarose espace avec le embryon entre le Deux couvrir lunettes. lieu un couche de 1% Agarose solution sur Retour au début de le couvrir verre tout sur le fond de le plat quel volonté garder le couvrir verre dans lieu comme il Se solidifie. alors remplir le restant part de le plat avec E3 (E3) contenant 0.02% tricaine (tricaine) À garder le système Hydraté. À identifier le optimal Agarose concentration pour couche Un monter le Embryons dans croissant Concentrations de Agarose et exécuter timelapse (timelapse) imagerie À identifier le concentration cela Minimise embryon distorsion et motilité alors test un plus fine gamme de Concentrations Basé sur le résultats.
- L’étape la plus critique de ce protocole consiste à identifier la concentration optimale d’agarose pour la première couche. Tester différentes concentrations nanométriques d’agarose telles que 0,030%, 0,032%, et cetera, pour trouver la concentration optimale.
