Comparative In vivo Etude de gp96 adjuvanticité de la grenouille Xenopus laevis

Le but global de cette procédure est d'étudier la conservabilité évolutive de la protéine de choc thermique G 96 à induire des réponses des lymphocytes T CD huit spécifiques aux antigènes chez la grenouille Xenopus laevis. Ceci est réalisé en premier lieu par la collecte de leucocytes péritonéaux au moyen d'une lavage péritonéal. La deuxième étape de la procédure consiste à pulser les leucocytes péritonéaux avec la GP 96 d'origine tumorale, qui accompagne les antigènes mineurs et tumoraux, après incubation et lavages.

Les leucocytes péritonéaux sont transférés de façon adoptive par injection intrapéritonéale à des grenouilles naïves afin de sensibiliser ces animaux contre des antigènes tumoraux ou des antigènes mineurs d'histocompatibilité. La troisième étape de la procédure consiste à greffer une peau ou à administrer une lignée tumorale aux grenouilles sensibilisées, puis à surveiller l'apparition de la greffe cutanée, le rejet ou la formation de tumeur. La dernière étape consiste à prélever du sang périphérique afin de caractériser les lymphocytes T impliqués dans les réponses de rejet cutané et anti-tumorale.

En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant une accélération significative du rejet de greffes cutanées, ainsi qu'un retard dans l'apparition de tumeurs chez les grenouilles préparées avec la GP 96, respectivement grâce aux tests de greffe cutanée et de provocation tumorale. Bonjour, je suis Christina Koska au laboratoire du Dr Jacque Robert, du département de microbiologie et d'immunologie du centre médical de l'Université de Rochester. Je suis Tanya Cruz, également du laboratoire du Dr River.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de mise en condition de grenouilles clonées par transfert adoptif de leucocytes péritonéaux, suivie d'analyses de greffes cutanées et de transplantation de tumeurs. De plus, nous vous montrerons également comment prélever du sang périphérique chez ces animaux. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la capacité de la protéine chaufferonne GP96 à favoriser des cellules CDAT spécifiques des antigènes chez Salla, ainsi que pour analyser les types cellulaires impliqués.

Très bien, commençons. Les grenouilles utilisées dans nos expériences sont des clones génétiques ISO provenant de notre colonie d'élevage à l'Université de Rochester. Pour induire la production de leucocytes péritonéaux, ou pls, en vue de leur prélèvement, utilisez une aiguille de calibre 25 de cinq huitièmes pour injecter par voie intrapéritonéale, dans la grenouille anesthésiée, une préparation d’e coli tuée par la chaleur. Trois jours après l'injection, les pls sont récoltés par lavage intrapéritonéal.

Pour commencer cette procédure, désinfectez l'abdomen de la grenouille anesthésiée avec une petite quantité d'éthanol à 70 %. Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 18 de 1,5 pouce pour injecter cinq millilitres de solution saline tamponnée au phosphate amphibienne stérile, ou du PBS préalablement porté à température ambiante, dans la cavité péritonéale. Retirez l'aiguille et massez doucement la grenouille pendant une minute afin de garantir que le tampon injecté s'équilibre avec le liquide présent dans la cavité corporelle.

Ensuite, insérez une nouvelle aiguille de calibre 18 de 1,5 sans seringue dans l'abdomen de la grenouille. En évitant les vaisseaux sanguins, recueillez le liquide péritonéal qui s'écoule à l'arrière de l'aiguille dans un tube conique propre de 50 millilitres. Veillez à récupérer autant que possible le volume injecté initialement après la récolte des pls.

Placer la grenouille dans un récipient contenant de l'eau peu profonde jusqu'à ce qu'elle se réveille, moment auquel elle peut être replacée dans sa cage. Une fois les PLS récoltés, centrifuger à 1000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, éliminer le surnageant et resuspendre les PLS. Suspendre les PLS dans du PBS A froid.

Transférez le PLS REMIS EN SUSPENSION dans un tube micro de 1,5 millilitre. Pour pulser le PLS avec la GP 96, ajoutez la quantité appropriée de GP 96 au PLS et mélangez par pipetage. Incubez sur glace pendant une heure ; après une heure.

Centrifuger les cellules à 14 000 tr/min pendant une minute. Pour éliminer toute GP 96 non liée, retirer le surnageant. Ajouter du PBS A froid et resuspendre.

Effectuez une nouvelle centrifugation du PLS. Lavez le S avec du A-P-B-S-A froid un total de trois fois afin de vous assurer qu'aucun résidu de G 96 n'est présent après le dernier lavage. Resuspendez le PLS pulsé à une concentration de cinq fois 10 à la puissance cinq PLS par 300 microlitres de PBS afin de transférer adoptivement les PLS chez six receveurs naïfs LG.

Injecter par voie intrapéritonéale 300 microlitres de pls pulsés par animal. Les grenouilles doivent être primées au moins trois jours avant les expériences de greffe cutanée ou de challenge tumoral, qui seront présentées ensuite. La peau destinée à la greffe est prélevée sur une grenouille donneuse LG 15 anesthésiée.

Utilisez des ciseaux pour découper et retirer un petit morceau de peau ventrale, c'est-à-dire la peau abdominale qui présente un aspect argenté. En raison de la présence de quatre cellules pigmentées ARI lors de la manipulation de la greffe. Il est essentiel de manipuler le tissu le moins possible, car cela pourrait endommager la greffe.

Tenez la peau très délicatement avec la pince et placez-la dans une boîte de Pétri contenant du PBS A froid. Maintenez la boîte de Pétri à basse température. Placez la peau sur une lame de verre propre et utilisez un rasoir pour découper des greffons individuels en morceaux de cinq millimètres sur cinq millimètres.

Gardez les fragments dans du PBS sur de la glace pour greffer la peau sur six grenouilles réceptrices. Commencez par faire une petite incision sur la peau dorsale de la grenouille réceptrice anesthésiée. Insérez ensuite le greffon de cinq millimètres sur cinq millimètres sous la peau, côté argenté vers le haut.

Veillez à noter les marques de ciseaux et de forceps sur les greffons, car celles-ci ne sont pas comptabilisées comme un rejet de greffon. Une fois le score commencé 24 heures plus tard, une partie de la peau hôte recouvrant le greffon doit être retirée. Utilisez des ciseaux pour découper une fenêtre autour du greffon afin que celui-ci puisse être visualisé librement.

Veillez à ne pas toucher la peau du donneur ni à provoquer de saignement. Commencez immédiatement à griffer la greffe en réalisant un croquis. Greffe de peau.

Le rejet est déterminé par le pourcentage de destruction de l'aridol sur la peau greffée. Le greffon doit être examiné tous les deux à trois jours au microscope stéréo. Préparez les cellules tumorales pour la transplantation en les resuspendant dans du milieu de culture tumoral à une densité de cinq fois 10 à la puissance cinq cellules par 300 microlitres.

Transplanter les cellules par injection sous-cutanée sur un côté de la face dorsale de l'animal. Cinq fois 10 à la puissance cinq cellules dans un volume de 300 microlitres sont injectées par grenouille. La croissance tumorale commencera entre deux et trois semaines après l'inoculation de la tumeur.

Noter l'aspect initial de la tumeur. Utiliser un pied à coulisse pour mesurer les dimensions de la tumeur et enregistrer son volume tous les deux à trois jours avant la collecte des leucocytes sanguins chez la grenouille. Préparer des aiguilles en verre en tirant des pâtes capillaires au-dessus d'une flamme.

Après avoir aiguisé l'extrémité fine de la pipette sous le microscope stéréo, reliez la pipette à un tube en plastique d'aspiration. Pour commencer le prélèvement sanguin, incisez la peau au-dessus du pied postérieur de la grenouille anesthésiée afin d'exposer la veine du tarse dorsal. Remplissez l'aiguille en verre avec un à deux millilitres de solution PBS A glacée additionnée d'héparine.

Insérez ensuite l'aiguille en verre dans la veine et commencez à prélever le sang en aspirant lentement par la bouche. On peut obtenir un à deux millilitres de sang à partir d'une grenouille de taille moyenne. La petite incision faite sur la patte de la grenouille n'a pas besoin d'être suturée.

La plaie guérira en une semaine. Les résultats d'une analyse au microscope stéréo du rejet de greffe cutanée 12 jours après la transplantation sont présentés ici. Une grenouille LG six clonée ayant reçu une greffe cutanée d'un donneur LG six identique au niveau du CMH n'a montré aucun rejet.

L'astérisque indique la pince marquée non due au rejet. En revanche, une grenouille clonée LG six ayant reçu une greffe de peau provenant d'un donneur allogène présentant un désappariement au niveau du CMH montre 80 % de rejet. Sur les deux images, les flèches indiquent les cellules pigmentées iridescentes argentées marquant un tissu greffé sain non rejeté.

Dans cette expérience suivante, des lymphocytes de greffe (LG) 15 ont été stimulés soit avec du PBS en tant que contrôle négatif, soit avec la GP 96 recombinante purifiée à partir d'une culture d'Escherichia coli, soit avec la GP 96 purifiée à partir de cellules tumorales 15.0. Ces cellules ont ensuite été transférées de façon adoptive à des receveurs adultes LG 15, et trois jours plus tard, des cellules tumorales 15.0 vivantes ont été transplantées par injection sous-cutanée. Les tumeurs apparues après le défi ont été surveillées, et la taille des tumeurs a été mesurée périodiquement. Sur ces graphiques, chaque courbe représente la cinétique de la croissance tumorale chez une grenouille. Les résultats montrent que les animaux préalablement exposés à 0,5 ou 1 microgramme de GP 96 présentaient un retard significatif dans l'apparition de la tumeur par rapport aux groupes témoins. Par conséquent, la GP 96 facilite la présentation croisée des antigènes tumoraux chez Xenopus.

Nous venons donc de vous montrer comment explorer la capacité de la GP96 à présenter à la fois des antigènes mineurs et des antigènes tumoraux chez la grenouille Xenopus laevis par des tests de greffe cutanée et de transplantation de tumeur. Lors de cette procédure, il est important de ne pas effectuer de lavage péritonéal si un vaisseau sanguin a été endommagé, car la majorité des cellules recueillies seraient alors des érythrocytes et non des macrophages. Il est également essentiel d'éviter de serrer le tissu avec la pince lors de la manipulation de la greffe cutanée afin de prévenir tout dommage.

Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir suivi cette procédure de lavage et bonne chance dans vos expériences.