Comparative In vivo Etude de gp96 adjuvanticité de la grenouille Xenopus laevis

L’objectif global de cette procédure est d’étudier la capacité évolutive de conservation de la protéine de choc thermique G 96 à promouvoir les réponses des lymphocytes T CD huit spécifiques de l’antigène dans les manchons du xénope de la grenouille. Ceci est accompli en récoltant d’abord les leucocytes péritonéaux par lavage péritonéal. La deuxième étape de la procédure consiste à pulser les leucocytes péritonéaux avec le GP 96 dérivé de la tumeur qui chaperonne les antigènes mineurs et tumoraux après l’incubation et les lavages.

Les leucocytes péritonéaux sont transférés adoptivement par injection intrapéritonéale chez des grenouilles naïves afin de préparer ces grenouilles contre les antigènes tumoraux ou mineurs d’histocompatibilité. La troisième étape de la procédure consiste à effectuer une greffe de peau ou un défi tumoral chez les grenouilles amorcées et à surveiller le début de la greffe de peau, du rejet ou de l’apparition de la tumeur. La dernière étape de la procédure consiste à obtenir du sang périphérique pour caractériser les lymphocytes T impliqués dans le rejet cutané et les réponses antitumorales.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent une accélération significative du rejet de la greffe de peau, ainsi que des retards dans l’apparition de la tumeur chez les grenouilles amorcées GP 96 grâce à la greffe de peau et aux tests de provocation tumorale respectivement. Bonjour, je m’appelle Christina Koska et je travaille dans le laboratoire du Dr Jacque Robert au Département de microbiologie et d’immunologie du Centre médical de l’Université de Rochester. Je suis Tanya Cruz, également du laboratoire du Dr River.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’amorçage des grenouilles clones par transfert adoptif de leucocytes péritonéaux, suivi d’une greffe de peau et de tests de transplantation tumorale. De plus, nous vous montrerons également comment obtenir du sang périphérique de ces animaux. Nous utilisons cette procédure dans notre administration pour étudier la capacité de la chaleur de votre protéine GP 96 à promouvoir les cellules CDAT spécifiques de l’antigène chez Salla ainsi que pour étudier les types de cellules impliqués.

D’accord, alors commençons. Les grenouilles utilisées dans nos expériences sont des clones génétiques ISO de notre colonie de reproduction à l’Université de Rochester. Pour obtenir des leucocytes péritonéaux ou des pls pour la récolte, utilisez une aiguille cinq huit de calibre 25 pour injecter la grenouille anesthésiée par voie intrapéritonéale avec une préparation d’e coli tuée par la chaleur Trois jours après l’injection, les pls sont récoltés par lavage intrapéritonéal.

Pour commencer cette procédure, désinfectez l’abdomen de la grenouille anesthésiée avec une petite quantité d’éthanol à 70 %. Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 18 et 1,5 pour injecter cinq millilitres de solution saline tamponnée au phosphate d’amphibien stérile, ou un PBS d’avant-guerre à température ambiante dans la cavité péritonéale. Retirez l’aiguille et massez doucement la grenouille pendant une minute pour vous assurer que le tampon injecté correspond au liquide dans la cavité corporelle.

Ensuite, insérez une nouvelle aiguille de calibre 18 1,5 sans seringue dans l’abdomen de la grenouille. Tout en évitant les vaisseaux sanguins, recueillez le liquide péritonéal qui s’écoulera de l’arrière de l’aiguille dans un tube conique propre de 50 millilitres. Assurez-vous de récupérer autant que possible le volume initial injecté après la récolte.

Mettez la grenouille dans un récipient avec de l’eau peu profonde jusqu’à ce qu’elle soit réveillée, après quoi elle peut être remise dans sa cage. Une fois que les pls ont été récoltés, centrifugez à 1000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, retirez le sup, le natant et le resus. Suspendez les pls à froid A PBS.

Transférez les pls RESUSPENDED dans un micro-tube à déchets de 1,5 millilitre. Pour pulser le PLS avec GP 96. Ajoutez la quantité appropriée de GP 96 aux pls et mélangez par pipetage, incubez sur de la glace pendant une heure après une heure.

Centrifugez les cellules à 14 000 tr/min pendant une minute. Pour retirer tout GP 96 non lié, retirez le surnageant. Ajouter le rhume A PBS et la réussature.

Suspendez à nouveau la centrifugeuse PLS. Lavez le S avec A-P-B-S-A froid au total trois fois pour vous assurer qu’il ne reste aucun résidu de G 96 après le lavage final. Resus suspendre les pls pulsés à une concentration de cinq fois 10 aux cinq pls par 300 microlitres d’un PBS pour transférer adoptivement les pls dans les naïfs LG six receveurs.

Injection intrapéritonéale de 300 microlitres de pls pulsés par animal. Les grenouilles doivent être amorcées au moins trois jours avant la greffe de peau ou les expériences de provocation tumorale, qui seront présentées ensuite. La peau pour la greffe est obtenue à partir d’une grenouille donneuse LG 15 anesthésiée.

Utilisez des ciseaux pour couper et retirer un petit morceau de peau ventrale, qui est la peau abdominale qui semble argentée. En raison de la présence d’IRA, quatre cellules pigmentées lors de la manipulation du greffon. Il est crucial d’avoir le moins de manipulation possible du tissu, car cela causera des dommages au greffon.

Tenez la peau très doucement avec la pince et placez-la dans une boîte de Pétri contenant du rhume A PBS. Gardez la boîte de Pétri allumée. Placez la peau sur une lame de verre fraîche et utilisez un rasoir pour couper les greffons individuels en morceaux de cinq millimètres sur cinq millimètres.

Conservez les fragments dans un PBS sur de la glace pour greffer la peau sur la grenouille receveuse LG six. Tout d’abord, faites une petite incision sur la peau dorsale du receveur anesthésié. Insérez ensuite la greffe de cinq millimètres sur cinq millimètres sous la peau avec le côté argenté vers le haut.

Assurez-vous de noter les marques de ciseaux et de pince sur les greffons, car elles ne sont pas comptées comme un rejet de greffon. Une fois que l’entaillage commence 24 heures plus tard, une partie de la peau de l’hôte qui se superpose doit être retirée du greffon. Utilisez des ciseaux pour découper une fenêtre autour de la greffe afin que la greffe puisse être visualisée librement.

Veillez à ne pas toucher la peau du donneur ou à ne pas provoquer de saignement. Commencez à marquer le greffon tout de suite en prenant un croquis. Greffe de peau.

Le rejet est déterminé par le pourcentage de destruction de l’aridol sur la peau greffée. Le greffon doit être vérifié tous les deux à trois jours au stéréomicroscope. Préparez les cellules tumorales pour la transplantation par résus, en les suspendant dans un milieu de culture tumorale à une densité de cinq fois 10 à cinq cellules par 300 microlitres.

Transplantez les cellules par injection sous-cutanée sur un côté de la face dorsale de l’animal. Cinq fois 10 aux cinq cellules dans un volume de 300 microlitres sont injectés par grenouille. La croissance tumorale commencera dans les deux à trois semaines suivant la provocation tumorale.

Notez l’apparence initiale de la tumeur. Utilisez des pieds à coulisse pour mesurer les dimensions de la tumeur et notez son volume tous les deux à trois jours avant le prélèvement des leucocytes sanguins de la grenouille. Préparez des aiguilles de verre en tirant des peppes de pâtes sur une flamme.

Après avoir affûté l’extrémité fine de la pipette au stéréomicroscope, connectez la pipette à un tube d’aspiration en plastique. Pour commencer la collecte de sang, coupez la peau au-dessus du pied postérieur de la grenouille anesthésiée pour exposer la veine dorsale du tarse. Remplissez l’aiguille de verre avec un à deux millilitres de solution glacée de PBS et d’héparine.

Insérez ensuite l’aiguille de verre dans la veine et commencez à recueillir le sang en aspirant lentement avec la bouche. Un à deux millilitres de sang peuvent être obtenus à partir d’une grenouille de taille moyenne. La petite incision sur la patte de la grenouille n’a pas besoin d’être cousue.

La plaie guérira en une semaine. Les résultats d’une analyse stéréomicroscopique du rejet du greffon cutané 12 jours après la transplantation sont présentés ici. Une grenouille clonée LG six qui a reçu une greffe de peau d’un donneur LG six identique au CMH n’a montré aucun rejet.

L’astérisque indique que la pince marqueur n’est pas due à un rejet. En revanche, une grenouille clonée LG six qui a reçu une greffe de peau d’un donneur hétéroclite du CMH présente un rejet de 80 %. Dans les deux images, les flèches indiquent des cellules pigmentées argentées et iriques marquant le tissu greffé sain non rejeté.

Dans cette expérience suivante, LG 15 pls ont été pulsés avec soit un PBS en tant que contrôle négatif, le GP 96 recombinant purifié à partir d’une culture d’e coli ou le GP 96 purifié à partir de 15 cellules de tissu tumoral zéro ont ensuite été transférés adoptivement dans des receveurs adultes LG 15 et trois jours plus tard, des cellules tumorales vivantes 15 zéro ont été transplantées par injection sous-cutanée. Ces graphiques, chaque courbe représente la cinétique de croissance tumorale chez une grenouille. Les résultats montrent que les animaux amorcés avec 0,5 ou un microgramme de GP 96 présentaient un retard significatif dans l’apparition de la tumeur par rapport aux groupes témoins. Par conséquent, le GP 96 facilite la présentation croisée des antigènes tumoraux chez le xénope.

Nous venons donc de vous montrer comment explorer la capacité de GP 96 à représenter à la fois les antigènes mineurs et tumoraux dans le xap lavis de grenouille par greffe de peau et tests de transplantation tumorale. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’éviter de collecter un lavage péritonéal si un vaisseau sanguin a été endommagé car la majorité des cellules à l’intérieur des érythrocytes et non des macrophages. Il est également important d’éviter de presser le tissu avec la pince lors de la manipulation de la greffe de peau afin d’éviter de l’endommager.

Donc c’est tout. Merci pour le lavage et bonne chance dans vos expériences.