Visualisation de l’expression des protéines basée sur CUBIC : une procédure de visualisation de l’expression des protéines dans des biopsies de peau de souris de pleine épaisseur

- La peau est un organe complexe composé de populations cellulaires variées disposées en plusieurs couches. CUBIC, une technique d’imagerie tridimensionnelle basée sur le nettoyage des tissus, aide à visualiser les modèles d’expression des protéines à l’intérieur de ces cellules cutanées à l’aide de biopsies de peau entière. Commencez par prendre une souris euthanasiée et enlever les poils de la région dorsale de son cou. Excisez un morceau de peau et coupez-le en petits morceaux.

Immergez les morceaux dans une solution de nettoyage CUBIC1 et incuberez. Les cellules de la peau ne sont pas transparentes, en raison de la présence de chromophores et de lipides qui provoquent la diffusion de la lumière. Les produits chimiques contenus dans la solution CUBIC éliminent ces molécules, réduisant ainsi la diffusion de la lumière et rendant le tissu transparent.

Ensuite, traitez le tissu avec les anticorps primaires souhaités qui se lient spécifiquement à leurs protéines intracellulaires cibles exprimées dans les cellules de la peau. De plus, traitez avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence qui se lient aux complexes protéine-anticorps primaires. Contre-colorez le tissu avec un colorant de liaison à l’ADN qui colore le noyau.

Enfin, immergez l’échantillon dans une solution CUBIC2. La solution réduit davantage la diffusion de la lumière dans le tissu, ce qui le rend plus transparent pour l’imagerie. Observez au microscope confocal pour visualiser les régions d’intérêt marquées par fluorescence dans l’échantillon tridimensionnel. Le protocole suivant permet de visualiser l'expression des marqueurs de prolifération des kératinocytes dans les biopsies cutanées entières à l'aide du protocole CUNIC.

- Commencez par utiliser des tondeuses pour raser les poils du cou d’une souris euthanasiée, en prenant soin de ne pas blesser la peau. Ensuite, décontaminez la peau avec de l’éthanol à 70 % dans du PBS. Ensuite, soulevez la peau dorsale du cou avec des pinces et utilisez des ciseaux pour retirer une zone d’environ 1,5 centimètre sur 4 centimètres de peau dorsale de souris. Ensuite, aplatissez la peau, côté derme vers le bas, sur un morceau de papier filtre, en notant l’orientation antéro-postérieure de l’échantillon et coupez le papier autour de la peau disséquée.

- Pour une imagerie optimale, les échantillons de peau doivent rester plats avec une orientation constante des follicules pileux. Pour maintenir les échantillons dans une position antéro-postérieure correcte, nous fixons les morceaux de peau sur du papier filtre lors de biopsies rectangulaires.

- Transférez les échantillons dans un tube de 15 millilitres rempli de PFA à 4 % fraîchement préparé dans du PBS. Ensuite, lorsqu’ils ont été fermement fixés au papier filtre, transférez les échantillons dans un nouveau tube de 15 millilitres de PBS pour deux lavages de 5 minutes.

Pour éliminer les biopsies cutanées après le deuxième lavage, utilisez une lame de rasoir tranchante pour couper les tissus en morceaux d’environ 0,2 par 0,5 centimètre, en veillant à ce que les côtés les plus longs des échantillons soient coupés le long de la direction antéro-postérieure des échantillons.

- Couper le côté le plus long de la biopsie parallèlement à l’orientation des follicules pileux permet également d’éviter des dommages importants aux follicules pileux.

- Ensuite, immergez les biopsies dans 5 millilitres de solution de clarification CUBIC1 fraîchement préparée dans un nouveau tube de 15 millilitres et placez le tube sur une plate-forme rotative dans un four d’hybridation à 37 degrés Celsius. Une fois que les morceaux de tissu sont transparents, lavez les biopsies dans 4 millilitres de PBS pour quatre lavages de 6 heures à 37 degrés Celsius suivis d’un lavage de 4 heures à 37 degrés Celsius avec 20 % de poids par volume de saccharose dans du PBS.

À la fin de l’incubation, congelez chaque échantillon dans un composé à température de coupe optimale dans des tubes individuels de 15 millilitres pendant la nuit à moins 80 degrés Celsius pour augmenter la perméabilité des tissus à la pénétration des anticorps.

Le lendemain matin, colorez les échantillons de peau avec les anticorps appropriés et les colorants vitaux d’intérêt. Ensuite, incubez les échantillons dans 1 millilitre de solution éclaircissante CUBIC2 fraîchement préparée dans des tubes de 2 millilitres sur un agitateur pendant 24 heures dans le four à 37 degrés Celsius pour égaliser l’indice de réfraction des tissus.

Lorsque les tissus sont clairs, positionnez les biopsies le long du côté le plus long des lamelles de verre individuelles de sorte que la direction de la croissance du follicule pileux soit parallèle à la surface de la lamelle. Mettez une goutte de solution CUBIC2 sur le tissu. Placez deux bandes de 1 millimètre sur 2 centimètres de punaise bleue sur une lamelle. Ensuite, couvrez la biopsie avec un deuxième feuillet

Ensuite, placez la chambre d’imagerie sur une platine de microscope confocal et déplacez le tissu dans la voie lumineuse. À l’aide de la source lumineuse appropriée et de filtres d’épifluorescence standard, balayez l’échantillon pour identifier les régions d’intérêt colorées par fluorescence. Ensuite, acquérez des images confocales fluorescentes des régions d’intérêt.