Protocole CUBIC Visualise Protein Expression à cellule unique Résolution dans les préparations entières de la peau de montage

L'objectif général de cette procédure est de visualiser les profils de prolifération cellulaire et d'expression protéique au niveau de la cellule unique en trois dimensions, et d'évaluer précisément l'anatomie et la pathologie de la peau. Cette méthode permet de répondre à des questions clés concernant la manière dont les mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlent le développement et la régénération épidermiques, ainsi que la façon dont ces mécanismes sont perturbés lors des maladies cutanées. Le principal avantage de cette technique réside dans sa simplicité technique, offrant un protocole simple pour visualiser des cellules individuelles dans des biopsies cutanées en épaisseur totale en trois dimensions, avec une précision sans précédent.

La méthode facilite également l'étude des interactions entre l'épiderme et le derme dans des échantillons complets de peau. En général, les chercheurs novices dans cette méthode peuvent éprouver quelques difficultés à préparer de petites biopsies cutanées plates sans endommager les follicules pileux. La procédure sera démontrée par Betty Maclarios, étudiante en doctorat au sein de l'Unité de dermatologie développementale et régénérative de l'UNSW Australie.

Commencez par utiliser des tondeuses pour raser les poils du cou d'une souris euthanasiée, en prenant soin de ne pas blesser la peau. Désinfectez ensuite la peau avec de l'éthanol à 70 % et du PBS. Soulevez ensuite la peau du dos du cou à l'aide de pinces et utilisez des ciseaux pour prélever une zone d'environ 1,5 cm par 4 cm de peau dorsale de souris.

Ensuite, aplatir l'épiderme de la peau vers le bas sur un morceau de papier filtre en notant l'orientation antéro-postérieure de l'échantillon, puis découper le papier autour de la peau disséquée. Pour une imagerie optimale, les échantillons de peau doivent rester plats avec une orientation constante des follicules pileux. Afin de maintenir les échantillons dans la bonne position antéro-postérieure, nous fixons les morceaux de peau sur le papier filtre sous forme de biopsies rectangulaires.

Transférez les échantillons dans un tube de 15 mL contenant du PFA 4 % fraîchement préparé dans du PBS. Une fois que les échantillons seront solidement fixés sur le papier filtre, transférez-les dans un nouveau tube de 15 mL contenant du PBS pour deux lavages de cinq minutes chacun. Pour préparer les biopsies cutanées, après le deuxième lavage, utilisez une lame de rasoir bien aiguisée pour découper les tissus en morceaux d’environ 0,2 sur 0,5 cm, en veillant à ce que les côtés les plus longs des échantillons soient coupés dans le sens antéropostérieur des échantillons.

Sectionner le long du côté de la biopsie parallèlement à l'orientation des follicules pileux permet également d'éviter des dommages étendus aux follicules pileux. Ensuite, plonger les biopsies dans 5 mL de solution de clarification cubique fraîchement préparée dans un nouveau tube de 15 mL et placer le tube sur une plateforme rotative dans un four d'hybridation à 37 degrés Celsius. Une fois que les fragments de tissu sont devenus transparents, laver les biopsies dans 4 mL de PBS selon quatre lavages de six heures chacun à 37 degrés Celsius, suivis d'un lavage de quatre heures à 37 degrés Celsius dans du saccharose à 20 % poids par volume dans du PBS.

À la fin de l'incubation, congeler chaque échantillon dans du composé optimal pour la coupe en température (OCT) dans des tubes individuels de 15 mL, puis les laisser à l'air libre toute la nuit à 80 degrés Celsius afin d'augmenter la perméabilité des tissus à la pénétration des anticorps. Le lendemain matin, colorer les échantillons de peau avec les anticorps appropriés et les colorants vitaux d'intérêt. Incuber ensuite les spécimens dans 1 mL de solution de clarification cubique deux fraîchement préparée, dans des tubes de 2 mL, sur un agitateur pendant 24 heures dans une étuve à 37 degrés Celsius, afin d'homogénéiser l'indice de réfraction des tissus.

Lorsque les tissus sont translucides, positionner les biopsies le long du côté le plus long de lamelles en verre individuelles de manière à ce que la direction de la croissance du follicule pileux soit parallèle à la surface de la lamelle. Déposer une goutte de solution cubique deux sur le tissu. Placer deux bandes de colle bleue de 1 mL par 2 cm sur une lamelle, puis recouvrir la biopsie d'une deuxième lamelle.

Placez ensuite la chambre d’imagerie sur la platine d’un microscope confocal et positionnez le tissu dans le trajet lumineux. À l’aide de la source lumineuse appropriée et des filtres standards d’épifluorescence, balayez l’échantillon pour identifier les régions d’intérêt marquées par fluorescence, puis acquérez des images confoncales fluorescentes des régions d’intérêt. Grâce à cette méthode, des biopsies cutanées dorsales épaisses de souris adultes de type sauvage peuvent être clarifiées et marquées par un anticorps dirigé contre le marqueur des kératinocytes basaux, la kératine 14.

Les noyaux positifs pour Dappy sont visibles dans tout l'échantillon et permettent d'apprécier certaines caractéristiques anatomiques telles que les papilles dermiques. La coloration K14 est apparente dans la couche basale, d'un seul épithélium interfolliculaire, et délimite les glandes sébacées ainsi que les gaines externes des follicules pileux, ainsi que les bourgeons pileux secondaires, avec seulement de faibles niveaux d'expression de K14 détectés dans la région du bulbe des follicules pileux.

Pour visualiser les cellules en prolifération, des biopsies de peau dorsale en épaisseur totale au stade télogène de souris adultes de type sauvage peuvent être clarifiées et colorées, comme démontré, révélant la présence de kératinocytes en prolifération dans l'épiderme interfolliculaire basal et dans l'isthme, mais pas dans la région du bulbe des follicules pileux. Pour visualiser les glandes sébacées, des biopsies de peau dorsale en épaisseur totale au stade anagène de souris adultes de type sauvage peuvent être clarifiées et colorées, facilitant la détection des glandes sébacées dans la région de l'isthme des follicules pileux. Pour visualiser les modifications morphologiques de l'épiderme et chez les animaux transgéniques, des biopsies de peau dorsale en épaisseur totale peuvent être clarifiées et colorées, révélant une hyperplasie de l'épiderme interfolliculaire et des follicules pileux anormaux avec des masses cellulaires marquées par K14 s'étendant de façon proximale dans le derme, représentant les populations accrues de cellules souches transgéniques.

Après avoir visionné cette vidéo, nous devrions avoir une bonne compréhension de la manière de préparer et de clarifier des échantillons de peau, ainsi que de visualiser les profils d'expression protéique avec une résolution au niveau cellulaire unique, en trois dimensions. Cette méthode est simple à réaliser et utilise des réactifs relativement sûrs et peu coûteux. À l'avenir, davantage d'anticorps seront testés pour évaluer leur compatibilité avec cette méthode, ce qui permettra d'étendre cette analyse à la visualisation de davantage de protéines et de types particuliers d'intérêt.

D'autres méthodes d'imagerie, telles que la microscopie à feuillet lumineux, peuvent être utilisées pour visualiser l'anatomie de la peau et les profils d'expression protéique d'échantillons cutanés plus larges en trois dimensions. Après son développement, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la dermatologie pour explorer les interactions cellulaires et moléculaires entre le derme et l'épiderme dans l'homéostasie cutanée, dans des modèles de souris génétiquement modifiées et dans l'un de nos modèles de maladie cutanée.