Protocole CUBIC Visualise Protein Expression à cellule unique Résolution dans les préparations entières de la peau de montage

Ce rapport décrit un protocole CUBIC pour clarifier plein des biopsies de peau d'épaisseur de la souris, et de visualiser les profils d'expression de la protéine, les cellules proliférantes, et sébocytes à la résolution d'une seule cellule en 3D. Cette méthode permet une évaluation précise de l'anatomie de la peau et de la pathologie et de phénotypes épidermiques anormales dans des lignées de souris génétiquement modifiées.

L’objectif général de cette procédure est de visualiser la prolifération cellulaire et les modèles d’expression des protéines au niveau de la cellule unique en trois dimensions et d’évaluer avec précision l’anatomie et la pathologie de la peau. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon dont les mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlent le développement et la régénération de l’épiderme et comment ces mécanismes sont perturbés pendant les maladies de la peau. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un protocole techniquement simple pour visualiser des cellules individuelles dans des biopsies cutanées de pleine épaisseur en trois dimensions avec une précision sans précédent.

La méthode facilite également l’étude des interactions entre l’épiderme et le derme dans des échantillons de peau complète. En général, les chercheurs novices dans cette méthode peuvent avoir un peu de mal à préparer les petites biopsies de peau plate sans endommager les follicules pileux. La démonstration de la procédure sera assurée par Betty Maclarios, étudiante au doctorat à l’unité de dermatologie développementale et régénérative de l’UNSW Australie.

Commencez par utiliser des tondeuses pour raser les poils du cou d’une souris euthanasiée, en prenant soin de ne pas blesser la peau. Décontaminez ensuite la peau avec 70 % d’éthanol et de PBS. Ensuite, soulevez la peau dorsale du cou à l’aide d’une pince et utilisez des ciseaux pour enlever une zone d’environ 1,5 x 4 cm de peau dorsale de souris.

Ensuite, aplatissez la peau côté derme vers le bas sur un morceau de papier filtre en notant l’orientation antérieure et postérieure de l’échantillon et coupez le papier autour de la peau disséquée. Pour une imagerie optimale, les échantillons de peau doivent rester plats avec une orientation constante des follicules pileux. Pour maintenir les échantillons dans la bonne position antérieure postérieure, nous fixons les morceaux de peau sur le papier filtre dans des biopsies rectangulaires.

Transférez les échantillons dans un tube de 15 mL rempli de PFA à 4 % et de PBS fraîchement préparés. Ensuite, lorsqu’ils ont été solidement fixés au papier filtre, transférez les échantillons dans un nouveau tube de 15 ml de PBS pour deux lavages de cinq minutes. Pour dégager les biopsies cutanées, après le deuxième lavage, utilisez une lame de rasoir tranchante pour couper les tissus en morceaux d’environ 0,2 x 0,5 cm, en veillant à ce que les côtés les plus longs des échantillons soient coupés le long de la direction antérieure et postérieure des échantillons.

Couper le long du côté de la biopsie parallèlement à l’orientation des follicules pileux permet également d’éviter des dommages importants aux follicules pileux. Ils immergent les biopsies dans 5 ml de solution cubique fraîchement préparée dans un nouveau tube de 15 ml et placent le tube sur une plate-forme rotative dans un four d’hybridation à 37 degrés Celsius. Une fois que les morceaux de tissu sont transparents, laver les biopsies dans 4 mL de PBS pendant quatre lavages de six heures à 37 degrés Celsius, suivis d’un lavage de quatre heures à 37 degrés Celsius avec 20 % de poids par volume, de saccharose et de PBS.

À la fin de l’incubation, congeler chaque échantillon à la température de coupe optimale dans des tubes individuels de 15 mL pendant la nuit à 80 degrés Celsius afin d’augmenter la perméabilité des tissus à la pénétration des anticorps. Le lendemain matin, colorez les échantillons de peau avec les anticorps appropriés et les colorants vitaux d’intérêt. Ensuite, incubez les échantillons dans 1 mL de solution cubique à deux éclaircies fraîchement préparée dans des tubes de 2 mL sur un agitateur pendant 24 heures dans le four à 37 degrés Celsius pour uniformiser l’indice de réfraction des tissus.

Lorsque les tissus sont clairs, positionnez les biopsies le long du côté le plus long des lamelles de verre individuelles de manière à ce que la direction de la croissance du follicule pileux soit parallèle à la surface de la lamelle. Mettez une goutte de solution cubique deux sur le tissu. Placez deux bandes de 1 mL sur 2 cm de colle bleue sur une lamelle, puis couvrez la biopsie avec une deuxième lamelle.

Ensuite, placez la chambre d’imagerie sur une platine de microscope confocal et déplacez le tissu dans la voie lumineuse. À l’aide de la source lumineuse appropriée et de filtres d’épifluorescence standard, balayez l’échantillon pour identifier les régions d’intérêt colorées par fluorescence, puis acquérez des images confocales fluorescentes des régions d’intérêt. En utilisant cette méthode, les biopsies de la peau dorsale de l’épaisseur des souris adultes de type sauvage peuvent être clarifiées et colorées avec un anticorps contre le marqueur kératinocytaire basal, la kératine 14.

Des noyaux positifs sont visibles dans tout l’échantillon et permettent d’apprécier certaines des caractéristiques anatomiques telles que les papilles dermiques. La coloration K14 est apparente dans la couche basale épaisse d’une cellule de l’épiderme interfolliculaire. Décrivant les glandes sébacées et les gaines radiculaires externes des follicules pileux et dans les germes capillaires secondaires avec seulement de faibles niveaux d’expression de K14 détectés dans la zone de renflement des follicules pileux.

Pour visualiser les cellules proliférantes, les biopsies de la peau dorsale de pleine épaisseur chez les télogènes de souris adultes de type sauvage peuvent être clarifiées et colorées, comme démontré, révélant la présence de kératinocytes proliférants dans l’épiderme interfolliculaire basal et dans l’isthme, mais pas dans la région du renflement des follicules pileux. Pour visualiser les glandes sébacées, des biopsies de la peau dorsale de pleine épaisseur à l’antigène de souris adultes de type sauvage peuvent être clarifiées et colorées, facilitant la détection des glandes sébacées dans la région de l’isthme des follicules pileux. Pour visualiser les changements morphologiques de l’épiderme et des animaux transgéniques, des biopsies de la peau dorsale de pleine épaisseur peuvent être clarifiées et colorées, révélant une hyperplasie de l’épiderme interfolliculaire et des follicules pileux anormaux avec des masses cellulaires marquées K14 s’étendant proximalement dans le derme représentant les populations de cellules souches transgéniques élargies.

Après avoir regardé cette vidéo, nous devrions avoir une bonne compréhension de la façon de préparer et de clarifier les échantillons de peau et de visualiser les modèles d’expression des protéines à la résolution d’une seule cellule en trois dimensions. Cette méthode est simple à mettre en œuvre et utilise des réactifs relativement sûrs et peu coûteux. À l’avenir, d’autres anticorps seront testés pour leur compatibilité avec cette méthode, ce qui permettra d’étendre cette analyse à la visualisation d’un plus grand nombre de protéines et de certains types d’intérêt.

D’autres méthodes d’imagerie, telles que la microscopie à feuillet de lumière, peuvent être réalisées pour visualiser l’anatomie de la peau et les modèles d’expression protéique de plus grands échantillons de peau en trois dimensions. Après son développement, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la dermatologie pour explorer les interactions cellulaires et moléculaires entre le derme et l’épiderme dans l’homéostasie cutanée, dans des modèles murins génétiquement modifiés et dans l’un de nos modèles de maladies de la peau.