Name: Protocole CUBIC Visualise Protein Expression à cellule unique Résolution dans les préparations entières de la peau de montage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Découvrez le protocole CUBIC pour visualiser l'expression protéique à résolution cellulaire unique dans les biopsies de peau de souris en 3D. Cette méthode simple permet d'étudier précisément l'anatomie et la pathologie cutanée.

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Nous remercions Australian Bio-Resources (Garvan Institute, Australie), le Centre de ressources biologiques (UNSW Australie) et le soin des animaux et Comité d&#39;éthique pour le soutien à l&#39;expérimentation animale. Ce travail a été soutenu par le Conseil national de la santé et de la recherche médicale de l&#39;Australie (Grant Project APP1062720). Dr. Cesar P. Canales est récipiendaires d&#39;une bourse CONICYT-Becas Chile (# 72101076). M. Bassem Akladios est récipiendaire du Prix international de l&#39;Université d&#39;études supérieures par UNSW Australie.

Déclaration éthique: Toutes les procédures impliquant des sujets animaux suivent les directives du Comité des soins aux animaux et de l&#39;éthique (ACEC) à UNSW Australie sous protocole approuvé AFIC 13 / 64B. 1. Préparation du tissu transparent de la peau de la souris Remarque: Toutes les souris utilisées dans cette étude étaient sur une C57BL / 6 de fond génétique <ol><li> Collection de tissus de la peau de la souris. <ol><li> Humainement euthanasier les souris par dislocation cervicale. </li><li> Retirez délicatement les poils de la zone de la peau concernée avec une coupe en prenant soin de ne pas blesser la peau. </li><li> Laver la peau à décontaminer avec de l&#39;éthanol à 70% en tampon phosphate salin (PBS). </li><li> Soulevez la peau du cou dorsale avec une pince et de faire l&#39;incision avec des ciseaux. </li><li> Disséquer une grande surface de la peau dorsale de souris (environ 1,5 x 4 cm). </li><li> Aplatir la peau derme vers le bas sur un papier filtre, et prendre note de l&#39;orientation antérieure-postérieure de l&#39;échantillon. </li><li> Tripapier m de filtre autour de la peau disséquée, et placer dans un tube de 15 ml rempli de 4% fraîchement préparé paraformaldéhyde (PFA) solution dans PBS. </li><li> Fixer pendant 1 h à température ambiante, ou une nuit au réfrigérateur à 4 ° C. </li><li> Laver la peau 2 x 5 min dans du PBS dans un tube de 15 ml. Note: Ce qui suit (1.1.10 - 1.1.12) sont des étapes facultatives pour le stockage à long terme des tissus. </li><li> Déshydrater la peau disséqués dans du PBS avec une concentration croissante d&#39;éthanol (25%, 50% à 70%) dans un tube de 15 ml pendant 1 h sur des étapes de lavage à la température ambiante. </li><li> Stocker les peaux déshydratées dans de l&#39;éthanol à 70% dans du PBS dans un tube de 15 ml à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li><li> 4 heures avant le dégagement, réhydrater le tissu cutané dans du PBS avec une concentration décroissante de l&#39;éthanol (70%, 50%, 25%, 0%) dans un tube de 15 ml pendant 1 h sur des étapes de lavage à la température ambiante. </li></ol></li><li> Effacement des biopsies de la peau de la souris <ol><li> Préparer la solution CUBIC1 de compensation en dissolvant 3,85 g d&#39; urée et 3,85 g de N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis (2-hydroxypropyl) éthylènediamine dans 5,38 ml d&#39;eau distillée sur un appareil de chauffage réglé à 60 - 70 ° C. Utiliser un agitateur à chaud. </li><li> Ajouter 2,31 g de polyéthylène glycol éther mono-p-isooctylphényle / Triton X-100 à la solution une fois qu&#39;il est clair et a refroidi à température ambiante. </li><li> Couper la peau de la souris avec une lame de rasoir dans des biopsies de dimensions approximatives de 0,2 x 0,5 cm, et plonger dans 5 ml de solution CUBIC1 de compensation dans un tube de 15 ml. Afin d&#39;optimiser la visualisation des follicules pileux, en sorte que le côté le plus long de la biopsie est découpée le long de la direction de l&#39;échantillon antéro-postérieur. </li><li> Placer sur une plate-forme tournante dans un four d&#39;hybridation à 37 ° C. </li><li> Changer la solution de compensation après 7 jours. Préparer la solution de CUBIC1 frais avant utilisation. </li><li> Vérifier la transparence du tissu après 7 jours. Si nécessaire, laisser des biopsies en solution de compensation CUBIC1 jusqu&#39;à ce que le tissu est complètement transparent. </li><li> Une fois que la biopsie de la peau est transparente,retirer la solution de CUBIC1, et ajouter 4 ml de 1 x PBS pour laver le tissu 4 fois pendant 6 heures à 37 ° C. </li><li> Laver le tissu cutané à 20% p / v de saccharose dans du PBS dans un tube de 15 ml pendant 4 heures à 37 ° C. </li><li> Congeler le tissu en milieu de montage optimal Cutting Temperature (OCT) Le composé dans un tube de 15 ml pendant une nuit dans un congélateur à -80 ° C. Remarque: Cette étape va augmenter la perméabilité de la biopsie pour la pénétration d&#39;anticorps dans les étapes suivantes. </li></ol></li></ol> 2. immunofluorescence <ol><li> Décongeler les tissus de 1.2.9) à la température ambiante pendant 2 - 3 h. </li><li> un tissu de lavage dans le tube de 15 ml avec 5 ml de PBS pendant 8 heures à la température ambiante pour éliminer le composé octobre. </li><li> Des biopsies de transfert à un tube de 2 ml, et on incube le tissu dans 1 ml de lapin anti-Keratin14 lapin ou un anticorps anti-Ki67, tous deux dilués 1: 100 dans PBST (PBS + 0,1% de Triton-X100) pendant 3 jours sur un agitateur dans une 37 ° C four. </li><li> biopsies de transfert à un tube de 15 ml, une laver le tissu 4 fois pendant 6 heures dans 5 ml de PBST sur un agitateur dans un four à 37 °. </li><li> biopsies de transfert à un tube de 2 ml, ajouter 1 ml anti-lapin Alexa594 anticorps secondaire dilué à 1: 100 dans du PBST et incuber 3 jours sur un agitateur dans un four à 37 °. </li><li> Des biopsies de transfert à un tube de 15 ml et on lave 4 fois les tissus pendant 6 heures dans 5 ml de PBST sur un agitateur dans un four à 37 °. </li><li> biopsies de transfert à un tube de 2 ml, ajouter 1 ml 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) solution nucléaire de contraste (1: 1000) dans PBST et incuber pendant la nuit sur un agitateur dans un four à 37 °. </li><li> Enlever la solution de DAPI contre-coloration et ajouter 1 ml de PBST au tube de 2 ml pour laver le tissu 4 fois pendant 6 heures sur un agitateur dans un four à 37 °. Remarque: L&#39;étape facultative: Biopsies peuvent être stockés dans l&#39;obscurité 1x PBS avec l&#39;azoture de sodium à 0,02% pendant au moins 3 semaines. </li></ol> 3. Rouge Nil Staining <ol><li> Dissoudre la poudre rouge Nil dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration finale de 1 mg / ml </li><li> Ajouter 1 pi de solution de rouge Nil à 1 ml de PBS à une concentration finale de 1 pg / ml. </li><li> tissu Thaw de 1.2.9) à la température ambiante pendant 2 - 3 h, et laver avec 5 ml de PBS pendant 8 heures à la température ambiante. </li><li> Transférer les biopsies à un tube de 2 ml et immerger le tissu dans 1 ml de solution de coloration rouge Nil pendant 2,5 heures à la température ambiante. </li><li> Laver les biopsies de peau dans le tube de 2 ml avec 1 ml de PBST 4 fois pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Enlever la solution de PBST du tube de 2 ml, ajouter 1 ml de solution DAPI nucléaire de contre-coloration (1: 1000) dans PBST et incuber une nuit à température ambiante. </li><li> Enlever la solution de DAPI contre-coloration, et ajoutez 1 ml de PBST dans le tube de 2 ml pour laver le tissu de la peau 4 fois pendant 6 heures à la température ambiante. Remarque: L&#39;étape facultative: Biopsies peuvent être stockés dans l&#39;obscurité 1x PBS avec l&#39;azoture de sodium à 0,02% pendant au moins 3 semaines. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Préparer la solution CUBIC2 de compensation, qui contient 50% (P / v) de saccharose, 25% (p / v) d&#39;urée, 10% (p / v) de 2,2 &#39;, 2&#39; &#39;- Nitrilotriéthanol et 0,1% (v / v) de Triton X-100. </li><li> Laisser incuber le tissu cutané dans 1 ml de solution CUBIC2 dans un tube de 2 ml sur un agitateur pendant 24 heures dans un four à 37 ° C. Cette étape sera même l&#39;indice de réfraction du tissu. </li><li> Vérifier la limpidité du tissu. Une fois qu&#39;il est clair, placer l&#39;ensemble de la biopsie cutanée (0,2 x 0,5 cm) sur son côté le plus long sur une lamelle de verre, de telle sorte que la direction de la longueur des follicules pileux est parallèle à la surface de la lamelle couvre-objet (# 1 24 x 60 mm) Note: Etape facultative: biopsies Antibody-colorées peuvent être stockés dans une solution de CUBIC2 pendant environ 7 jours. biopsies du Nil Rouge tachés ne peuvent être stockés dans une solution CUBIC2 jusqu&#39;à 1 jour, et devraient être imagés dès que possible. </li><li> Préparer chambre d&#39;imagerie (Figure 1) Remarque: Consommables nécessaires à la préparation de la chambre d&#39;imagerie sont: tack bleu, pâte à modeler ou similaire, et 2 lamelles (24 x 50 mm) (Figure 1A). <ol><li> Préparer deux bandes minces de tack bleu (diamètre d&#39; environ 1 mm x 2 cm), et deux lamelles (figure 1B). </li><li> Placez des bandes collantes bleues sur un feuillet de couverture, en laissant suffisamment d&#39; espace pour une biopsie de la peau (figure 1C). 4.4.3) </li><li> Placer une biopsie de la peau entre les bandes sur la lamelle dans une goutte de solution CUBIC2 (figure 1C). </li><li> Couvrir la biopsie de la peau avec la deuxième lamelle (figure 1D). </li></ol></li><li> Placez la chambre d&#39;imagerie avec la biopsie de la peau montée sur la scène d&#39;un microscope confocal et déplacer le tissu dans la voie de la lumière. </li><li> Balayez l&#39;échantillon en utilisant une source de lumière au mercure ou un halogène et les filtres à épifluorescence standards (par exemple, DAPI / GFP / CY3 / CY5) pour identifier les régions colorées par fluorescence d&#39;intérêt. </li><li> Régions de l&#39; image d&#39;intérêt en utilisant un objectif 10X et 20X (NA 0,75) et des techniques d&#39;imagerie de fluorescence confocale standards (par exemple., Avec DAéchantillons PI teinté éclairent avec un laser de 405 nm et de recueillir le signal de fluorescence entre 425-475 nm, et avec Alexa Fluor 594 ou des échantillons du Nil rouge-colorés illuminent avec un laser 561 nm et de recueillir le signal de fluorescence entre 570-620 nm). </li><li> Générer l&#39; image Z-piles de chaque région d&#39;intérêt en utilisant Z-stack logiciel d&#39;acquisition d&#39;images de microscope (par exemple., En utilisant des éléments NIS logiciel d&#39; imagerie 4.13 comme décrit ci - dessous). <ol><li> Assurer la puissance laser optimale et PMT HV / Offset paramètres ont été sélectionnés pour collecter la fluorescence de l&#39;échantillon. </li><li> Ouvrez la barre d&#39;outils &quot;ND Acquisition&quot; de &quot;Contrôles d&#39;acquisition&quot;. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet &quot;Z Setup série&quot; (assurer que tous les autres onglets sont désélectionnée). </li><li> Lors de la numérisation en direct, se concentrer sur le haut de l&#39;échantillon et appuyez sur la touche &quot;Haut&quot;. </li><li> Concentrez au fond de l&#39;échantillon et appuyez sur le bouton &quot;Bas&quot;. </li><li> Taille d&#39;entrée requise de l&#39;étape (ou appuyez optimisé étape bouton taille). </li><li> Préss le bouton &quot;maintenant Run&quot;. </li><li> Enregistrer Z-piles résultantes comme Tiff individuelle piles d&#39;images (1 fluorochrome par image Z-stack). </li></ol></li><li> Utilisez l&#39; image Z-piles pour reconstruire les régions de volume 3D d&#39;intérêt en utilisant un logiciel d&#39;analyse 3D (par exemple., En utilisant Imaris x64 7.2.3 , comme décrit ci - dessous). <ol><li> Démarrez le logiciel d&#39;analyse. </li><li> Choisissez le bouton &quot;Surpass&quot; dans la barre d&#39;outils pour la production de volume 3D. </li><li> Ouvrir la première image couleur Z-stack (ex., DAPI). </li><li> Utilisez l&#39;outil &#39;ajouter la chaîne&#39; pour ajouter des canaux de couleurs supplémentaires, un canal par fluorochrome. Ainsi, un échantillon contenant à la fois DAPI et Alexa Fluor 594 fluorochromes aura besoin de deux canaux. </li><li> Utilisez l&#39;outil &quot;Propriétés de l&#39;image&quot; pour régler correctement pixel (voxel) dimensions (XYZ), tel que déterminé à 4.7 ci-dessus. </li><li> Utiliser l&#39; outil &quot;de réglage de l&#39; affichage&quot; pour changer les couleurs de canal selon les besoins (par exemple, régler le canal DAPI au bleu, Alexa Fluor 594 canal rouge). </li><li> Pour poSITION le volume 3D dans la fenêtre d&#39;image, utilisez la souris d&#39;ordinateur pour cliquer et faire glisser le volume au besoin. </li><li> Utilisez l&#39;outil &quot;Snapshot&quot; dans la barre d&#39;outils pour générer des captures d&#39;écran de l&#39;image 3D. </li><li> Utilisez l&#39;outil &quot;Animation&quot; dans la barre d&#39;outils pour générer des films de 3D rotation de l&#39;échantillon. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratching+the+surface+of+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).</li>
<li>Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).</li>
<li>Hardy, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secret+life+of+the+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The secret life of the hair follicle.</a> Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).</li>
<li>Lim, X., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+skin+development%2C+homeostasis%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+controls+stem%2Fprogenitor+cell+proliferation+in+the+mouse+postnatal+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis.</a> J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).</li>
<li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li>
<li>Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment%3A+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li>
<li>Hamilton, E., Potten, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+hair+plucking+on+the+turnover+time+of+the+epidermal+basal+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Kinet%22%5BJournal%5D)">Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer.</a> Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).</li>
<li>Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+a+slowly+cycling+subpopulation+of+adult+murine+epidermal+cells+retains+carcinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen.</a> Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).</li>
<li>Schweizer, J., Marks, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+study+of+the+distribution+and+frequency+of+Langerhans+cells+in+relation+to+formation+of+patterning+in+mouse+tail+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis.</a> J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. (88), e51749(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les mécanismes de régulation contrôlant le développement de la peau et de l&#39;homéostasie sont le plus souvent étudiées en 2D à l&#39;aide de sectionnement des tissus et une coloration histologique ou marquage avec des anticorps, ce qui permet seulement une reconnaissance restreinte de la morphologie de la peau, des populations de cellules ou de l&#39;expression de la protéine. Un certain nombre de méthodes ont été développées pour améliorer la visualisation de l&#39;organisation spatiale des cellules et des protéines...

La peau est essentielle pour notre survie. Il se compose de trois couches principales de l&#39;épiderme les extérieurs, le derme et l&#39;hypoderme. L&#39;épiderme est un tissu très régénérative. Il est un épithélium pavimenteux stratifié, composé principalement de kératinocytes. Les kératinocytes sont nés dans la couche basale, et se déplacent vers le haut à travers les couches suprabasales tout en différenciant, et finalement ils tombent dans la couche externe cornified environ un mois après leur naissance. L&#39;épiderme se développe un certain nombre d&#39;appendices, y compris les follicules pileux et des glandes sébacées. Les follicules pileux se régénèrent également de façon cyclique tout au long de la vie 1. La capacité de régénération de l&#39;épiderme est activé par la présence de cellules souches et progénitrices qui sont situés dans la couche basale de l&#39;épiderme interfolliculaire des follicules pileux et 2. De nombreuses voies de signalisation ont été impliquées dans le développement et la régénération de l&#39;épiderme. Certaines d&#39;entre elles se produisent à l&#39;intérieurseulement l&#39;épiderme, telles que la voie Hedgehog. D&#39; autres événements de signalisation ont lieu entre le derme et l&#39; épiderme 3. Par exemple, les signaux Wnt du derme sont considérées comme importantes pour le développement des follicules pileux, et ils sont sécrétés par la papille dermique au début de la phase anagène pour activer le follicule pileux gonflement souches / progénitrices la prolifération cellulaire et la croissance des follicules pileux 4. Il est important de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent le développement de l&#39;épiderme et de la régénération afin de mieux comprendre comment ils peuvent être perturbés dans les maladies régénératrice de la peau telles que le cancer de la peau. Cet article décrit un lear C, U nobstructed B pluie I cocktails forgemagie et C analyse omputational (CUBIC) protocole 5-7 pour clarifier les préparatifs de la peau de montage entières, et de visualiser les profils d&#39;expression des protéines dans les 3 dimensions à la résolution d&#39;une seule cellule par microscopie confocale. La méthode CUBIC implique l&#39;immersion de la peautissu en deux cocktails chimiques à base de aminoalcools. Ces solutions ajuster les indices de réfraction de l&#39;échantillon de peau, en laissant le tissu transparent et les protéines intactes, ce qui permet immunodétection à une résolution à une seule cellule. En utilisant ce protocole CUBIQUE, la base et la prolifération des populations de kératinocytes dans l&#39;épiderme interfolliculaire et dans les follicules pileux ont été imagées en totalité des biopsies de peau d&#39;épaisseur des souris de type sauvage en utilisant l&#39;anti-Keratin14 (K14) et des anticorps anti-Ki67. Les glandes sébacées dans les biopsies de la peau de type sauvage ont également été visualisés en utilisant du Nil Rouge coloration. Enfin, les populations de kératinocytes basaux de type sauvage et hyperplasiques biopsies cutanées YAP2-5SA-Ac 8 ont été comparés. Ce protocole CUBIC permet une évaluation visuelle de l&#39;expression des protéines dans leur intégralité des biopsies de peau d&#39;épaisseur à la résolution d&#39;une seule cellule, et est un outil important pour apprécier l&#39;anatomie épidermique et défauts morphologiques dans la peau d&#39;organismes génétiquement modifiéssouris, et d&#39;enquêter sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent le développement de l&#39;épiderme et de la régénération.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>P6418</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol à 96 % (non dénaturé)</td><td>Chem-supply</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>72485-100MG</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N' -tétrakis (2-hydroxypropyl)éthylènediamine</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol mono-p-isooctylphényléther</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Température de coupe optimale (OCT) Composé</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-kératine14</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-Ki67&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td></td></tr><tr><td>Âne anti-lapin Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>Merck Millipore</td><td>66612</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime ;,2&prime ; '-nitrilotriéthanol</td><td>Merck Millipore</td><td>137002</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Nikon Instruments Inc</td><td>Nikon A1 - Microscope</td><td></td>confocal</tr><tr><td>cruZer6 Tondeuse pour le visage</td><td>Braun</td><td>Braun cruZer6 Azoture</td> de sodium pour le visage <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td></td><td></td>438456</tr></tbody></table>

protocole cubic visualise protein expression à cellule unique résolution dans les préparations entières de la peau de montage

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

La peau est essentielle pour notre survie. La couche externe est constituée de l&#39;épiderme de l&#39;épiderme interfolliculaire, qui est un épithélium pavimenteux stratifié qui couvre la majeure partie de notre corps, et les phanères comme les follicules pileux et des glandes sudoripares. L&#39;épiderme subit la régénération pendant toute la vie et en réponse à une blessure. Ceci est activé par K14 exprimant des populations souches / cellules progénitrices épidermiques basales qui sont étroitement régulés par des mécanismes de régulation multiples actifs dans l&#39;épiderme et entre l&#39;épiderme et le derme. Cet article décrit une méthode simple pour clarifier plein des biopsies de peau d&#39;épaisseur de la souris, et de visualiser les profils d&#39;expression de la protéine K14, Ki67 étiquetés cellules proliférantes, rouge Nil étiqueté sébocytes, et l&#39;étiquetage nucléaire DAPI à la résolution de la cellule unique en 3D. Cette méthode permet une évaluation précise et la quantification de l&#39;anatomie de la peau et de la pathologie et de phénotypes épidermiques anormales dans des lignées de souris génétiquement modifiées. Le protocole CUBIC est ee meilleure méthode disponible à ce jour pour étudier les interactions moléculaires et cellulaires en pleine épaisseur biopsies de la peau à la résolution d&#39;une seule cellule.

Épaisseur dorsale entière des biopsies de peau de souris adultes de type sauvage ont été clarifiées, colorées avec un anticorps se liant marqueur kératinocytaire de base Keratin14 (K14) , un anticorps, et les noyaux ont été contre -colorées avec une solution de coloration DAPI (Figure 2 et le film 1). Les noyaux DAPI positifs étaient visibles à travers l&#39;échantillon (figure 2A, C) et K14 coloration était visible exclusivement dans la cou...

Ce rapport décrit un protocole CUBIC pour clarifier plein des biopsies de peau d&#39;épaisseur de la souris, et de visualiser les profils d&#39;expression de la protéine, les cellules proliférantes, et sébocytes à la résolution d&#39;une seule cellule en 3D. Cette méthode permet une évaluation précise de l&#39;anatomie de la peau et de la pathologie et de phénotypes épidermiques anormales dans des lignées de souris génétiquement modifiées.

Protocole CUBIC Visualise Protein Expression à cellule unique Résolution dans les préparations entières de la peau de montage

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser les profils de prolifération cellulaire et d'expression protéique au niveau de la cellule unique en trois dimensions, et d'évaluer précisément l'anatomie et la pathologie de la peau. Cette méthode permet de répondre à des questions clés concernant la manière dont les mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlent le développement et la régénération épidermiques, ainsi que la façon dont ces mécanismes sont perturbés lors des maladies cutanées. Le principal avantage de cette technique réside dans sa simplicité technique, offrant un protocole simple pour visualiser des cellules individuelles dans des biopsies cutanées en épaisseur totale en trois dimensions, avec une précision sans précédent.La méthode facilite également l'étude des interactions entre l'épiderme et le derme dans des échantillons complets de peau. En général, les chercheurs novices dans cette méthode peuvent éprouver quelques difficultés à préparer de petites biopsies cutanées plates sans endommager les follicules pileux. La procédure sera démontrée par Betty Maclarios, étudiante en doctorat au sein de l'Unité de dermatologie développementale et régénérative de

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Cette vidéo décrit la technique de visualisation basée sur CUBIC, une technique d’imagerie dépendante du nettoyage tissulaire pour l’évaluation visuelle de l’expression des protéines dans les biopsies cutanées entières à une résolution de cellule unique en 3D. Ce protocole techniquement simple permet de visualiser les protéines de la peau sans préparer de coupes de peau.

Visualisation de l’expression des protéines basée sur CUBIC : une procédure de visualisation de l’expression des protéines dans des biopsies de peau de souris de pleine épaisseur

Nous présentons un protocole pour obtenir des matrices dérivées de cellules riches en protéines de la matrice extracellulaire, en utilisant Crowders macromoléculaires (MMC). En outre, nous présentons un protocole qui incorpore MMC dans organotypique génération de co-culture de la peau 3D, ce qui réduit le temps de la culture tout en maintenant la maturité de la construction.

Améliorer 2D et 3D Skin<em&gt; In vitro</em&gt; Modèles utilisant macromoléculaire Crowding

L’immunohistochimie est une technique de laboratoire puissante pour évaluer la localisation et l’expression des protéines dans les tissus. Les méthodes semi-automatisées actuelles de quantification introduisent de la subjectivité et créent souvent des résultats irreproductibles. Nous décrivons ici des méthodes d’immunohistochimie multiplexée et de quantification objective de l’expression et de la co-localisation des protéines à l’aide de l’imagerie multispectrale.

Quantification de l&#39;expression protéique et co-localisation utilisant multiplexé Immuno-histochimie Coloration et multispectrale Imaging

Nous présentons une solution logicielle pour le suivi semi automatisé de la concentration relative de protéines sur toute la longueur des protrusions cellulaires dynamiques.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Ce travail présente un nouveau protocole de traitement et d'imagerie pour une analyse transversale en tissu tridimensionnelle épaisse qui permet l'exploitation complète des modalités d'imagerie confocal. Ce protocole préserve l'antigénicité et représente un système robuste pour analyser l'histologie de la peau et potentiellement d'autres types de tissus.

Horizontal Whole Mount: un protocole de traitement et d&#39;imagerie géniaux pour les sections transversales épaisses en tissu tridimensionnel

Nous présentons ici des gouttelettes adressable microarrays (SMA), une méthode de tableau basé de gouttelettes en mesure de déterminer l’abondance absolue de protéine dans des cellules individuelles. Nous démontrent la capacité des SMA pour caractériser l’hétérogénéité dans l’expression de la tumeur suppresseur protéine p53 dans une lignée de cellules cancéreuses humaines.

Comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable Microarrays

Ce protocole décrit comment isoler les kératinocytes cutanés des modèles de souris, les tacles avec des anticorps marqués en métal, et analyser les cellules tachées par cytométrie de masse afin de profiler le modèle d'expression des protéines d'intérêt dans les différentes phases du cycle cellulaire.

Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

Les changements morphologiques se produisent dans les cellules de fibroblaste sensibles au système immunitaire après l'activation et favorisent des changements dans le recrutement cellulaire. Utilisation de l'imagerie à 2 photons en conjonction avec une protéine génétiquement modifiée spécifique au fibroblaste 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) ligne de souris et vert fluorescent marqué lipopolysaccharide-FITC, nous pouvons illustrer l'apport très spécifique de lipopolysaccharide...

In Vivo Deux-Couleur 2-Photon Imagerie des cellules de reporter génétiquement marqués dans la peau

Ici, nous décrivons un protocole de réglage fin des régions d’intérêt (ROI) pour les technologies Spatial Omics afin de mieux caractériser le microenvironnement tumoral et d’identifier des populations cellulaires spécifiques. Pour les tests protéomiques, des protocoles personnalisés automatisés peuvent guider la sélection du retour sur investissement, tandis que les tests transcriptomiques peuvent être affinés en utilisant des retours sur investissement aussi petits que 50 μm.

Profilage spatial de l’expression des protéines et de l’ARN dans les tissus : une approche pour affiner la microdissection virtuelle

Une méthodologie cohérente d’imagerie par diffusion Raman pour visualiser et quantifier les composés pharmaceutiques dans la peau est décrite. Cet article décrit la préparation de tissus cutanés (humains et souris) et l’application de formulation topique, l’acquisition d’images pour quantifier les profils de concentration spatio-temporelle et l’analyse pharmacocinétique préliminaire pour évaluer l’administration de médicaments topiques.

Visualisation et quantification de composés pharmaceutiques dans la peau à l’aide de l’imagerie par diffusion Raman cohérente

La combinaison de l’IBEX (Iterative-Bleaching-Extends-Multiplexity) et d’un test commercial de marquage nucléotidique (Click-iT EdU) permet la détection et la catégorisation de types de cellules en division dans des processus hautement dynamiques dans des coupes de tissus murins congelés fixes. De plus, un nouveau pipeline de traitement d’images open source permet l’acquisition et l’analyse d’images à haut débit.

Flux de travail d’imagerie et d’analyse à haut débit pour l’évaluation des phénotypes et des états de prolifération des cellules cutanées dans des échantillons de tissus

Découvrez le protocole CUBIC pour visualiser l'expression protéique à résolution cellulaire unique dans les biopsies de peau de souris en 3D. Cette méthode simple permet d'étudier précisément l'anatomie et la pathologie cutanée.

Protocole CUBIC Visualise Protein Expression à cellule unique Résolution dans les préparations entières de la peau de montage

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