Métastases expérimentales et CTL Modèle adoptifs souris Transfert immunothérapie

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer l'efficacité d'une immunothérapie par transfert adoptif de lymphocytes T spécifiques de tumeur in vivo. Cela est réalisé en premier lieu en transplantant des cellules tumorales par injection dans la veine caudale latérale des souris afin d'induire des métastases pulmonaires. La deuxième étape de la procédure consiste à traiter les souris porteuses de tumeur par des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) spécifiques de la tumeur.

La dernière étape consiste à utiliser de l'encre de Chine afin de visualiser et de quantifier les nodules tumoraux. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant l'efficacité induite par le traitement (CIE) de différentes thérapies, en mesurant la taille de la tumeur et en quantifiant le nombre de nodules tumoraux. Bonjour, je m'appelle Mary Zimmerman et je suis membre du laboratoire du Dr Kevin Lu au Collège de Médecine de Géorgie.

Bonjour, je m'appelle Shelene Hu. Je suis étudiante en deuxième année et je travaille également dans le laboratoire du Dr Lou. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes traditionnelles, telles que les courbes de survie, est que cette procédure est à la fois qualitative et quantitative. Les implications de cette technique pourraient s'étendre à la thérapie anticancéreuse, car elle imite l'immunothérapie adoptive par lymphocytes T chez les patients humains atteints de cancer.

Commençons donc. La veille des injections de cellules tumorales, ensemencez un flacon T75 avec jusqu'à 1 × 10⁷ cellules CMS4-MET dans 10 millilitres de milieu RPMI contenant 10 % de sérum. Pour obtenir des cellules tumorales en prolifération rapide, incubez toute la nuit à 37 °C le jour de l'injection.

Retirer le milieu et rincer les cellules une fois avec du PBS, puis récolter les cellules tumorales avec une solution de trypsine-EDTA à 0,05 % à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Arrêter la réaction avec 10 millilitres de milieu RPMI contenant 10 % de sérum. Transférer les cellules dans un tube conique.

Faire centrifuger les cellules à 1300 tr/min dans une centrifugeuse val legend RT pendant trois minutes. À température ambiante, retirer le surnageant, resuspendre les cellules dans 10 millilitres de milieu frais 1 XHB Ss pour un lavage. Puis centrifuger à nouveau et resuspendre de la même manière.

Compter les cellules tumorales au hémocytomètre. Diluer les cellules dans du HBSS afin que les cellules nécessaires pour chaque injection soient resuspendues. Dans un volume total de 100 microlitres, réchauffer les souris B SEA âgées de six à huit semaines dans un bécher immergé dans de l'eau tiède.

Pour dilater la veine de la queue, placer la souris dans un dispositif de contention de la veine caudale sur la paillasse. Utiliser une seringue micros pour injecter 100 microlitres de cellules tumorales dans la veine caudale latérale. Appliquer une technique aseptique afin d'éviter toute infection après l'injection.

Appliquez une légère pression sur le site d'injection jusqu'à l'arrêt du saignement. Replacez la souris dans la cage et laissez la tumeur se développer jusqu'au stade souhaité. Le jour du transfert, pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas afin de resuspendre les lymphocytes T cytotoxiques purifiés, ou CTL, préparés.

Comme décrit dans le texte, transférez toutes les cellules d'une plaque dans un tube conique de 15 millilitres, sans que le volume n'excède les deux tiers du tube. Insérez une pipette Pasteur stérile dans le tube conique et superposez le milieu de séparation des lymphocytes, ou LSM, sous les cellules jusqu'à ce que le volume total approche 14 millilitres.

Veillez à ne pas perturber les couches. Centrifugez à 2000 tr/min pendant 20 minutes à température ambiante. N'utilisez pas le frein pour ralentir le rotor après la rotation ; transférez les CTL dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.

Ajouter du HBSS jusqu'à un volume d'environ 10 millilitres. Pour laver. Compter les cellules, centrifuger à 1300 tr/min pendant cinq minutes. À température ambiante, resuspendre dans du HBSS à la densité cellulaire requise pour les injections.

En maintenant le volume total par injection à 100 microlitres. Utilisez la même technique d'injection caudale que celle observée précédemment dans cette vidéo. Pour injecter les CTL chez des souris porteuses de tumeur, remettez la souris dans la cage et laissez les CTL interagir avec la tumeur.

Les souris sont généralement sacrifiées pour analyse entre 14 et 21 jours après le traitement par les LTC. Pour visualiser les métastases pulmonaires, placez une souris sacrifiée sur le dos sur une planche en polystyrène. Fixez les pattes avec des épingles afin d'assurer un accès dégagé à la trachée.

Pulvérisez la face ventrale avec de l'éthanol à 70 % en partant de l'abdomen médian. Utilisez des ciseaux pour inciser le long de la ligne médiane à travers la cage thoracique et remonter vers les glandes salivaires. Exposez la trachée.

Utilisez une pince pour retirer les tissus entourant la trachée. Passez la pointe d'une pipette de 200 microlitres sous la trachée en tenant la pointe d'une main. Soulevez délicatement la trachée vers le haut et loin du corps.

Faites pivoter la plateforme de 180 degrés. Utilisez une seringue de 50 millilitres pour injecter de l'encre de Chine dans les poumons par la trachée. Gonflez complètement les poumons avec l'encre jusqu'à ce que vous ressentiez une forte résistance.

Utilisez des ciseaux pour couper la trachée. Glissez une paire de forceps sous les poumons et soulevez-les hors de la souris. Rincez brièvement les poumons dans un bécher d'un litre d'eau sous une hotte chimique.

Transférez les poumons vers une installation en verre contenant cinq millilitres de solution FTI. Le tissu tumoral apparaîtra sous forme de nodules blancs sur les poumons noirs. Après quelques minutes, les tumeurs peuvent désormais être comptées et conservées indéfiniment dans la solution FTI ici.

Poumons de souris transfectées avec un carcinome mammaire. La lignée cellulaire four T one présente des taches blanches indiquant des tumeurs. Les souris transfectées avec un mutant dominant négatif d'IRF eight résistant au K 79 E montrent un potentiel métastatique accru des cellules tumorales.

Ces images montrent une analyse histologique de l'efficacité de l'immunothérapie par transfert adoptif de CTL. Chez les souris porteuses de tumeurs injectées avec une solution saline, on observe plusieurs tumeurs six jours plus tard, indiquées par des flèches. En revanche, chez les souris injectées avec des lymphocytes T spécifiques de la tumeur, on constate une réduction des tumeurs au cours de la même expérience.

Le traitement à l'encre de Chine offre un moyen plus simple de mesurer l'efficacité du transfert adoptif de CTL. Ici, les nodules tumoraux blancs présents sur les poumons porteurs de tumeur les distinguent clairement des poumons ayant subi avec succès un transfert adoptif de CTL, et le décompte des nodules permet une quantification impossible à obtenir par histologie. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de réchauffer les souris afin de faciliter et d'améliorer la précision des injections intraveineuses par la queue.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment évaluer l'efficacité du traitement à l'aide de cette procédure simple permettant de quantifier la taille et le nombre de tumeurs. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.