Métastases expérimentales et CTL Modèle adoptifs souris Transfert immunothérapie

Une métastase pulmonaire expérimentale et CTL modèle de souris d'immunothérapie pour l'analyse de l'interaction des cellules tumorales des cellules-T

L’objectif global de cette procédure est d’examiner l’efficacité de l’immunothérapie de transfert adoptif de cellules T spécifiques de la tumeur in vivo. Ceci est accompli d’abord en transplantant des cellules tumorales par injection latérale de la veine de la queue chez les souris afin d’établir des métastases pulmonaires. La deuxième étape de la procédure consiste à traiter les souris porteuses de tumeurs avec des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de la tumeur.

La dernière étape consiste à utiliser l’encre de Chine comme moyen de visualiser et de quantifier les nodules tumoraux. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent la CIE de différents traitements en mesurant la taille de la tumeur et en quantifiant le nombre de nodules tumoraux. Bonjour, je m’appelle Mary Zimmerman et je suis membre du laboratoire du Dr Kevin Lu au Medical College of Georgia.

Bonjour, je m’appelle Shelene Hu.Je suis étudiante en deuxième année et je travaille également dans le laboratoire du Dr.Lou. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes traditionnelles telles que les courbes de survie est que cette procédure est à la fois qualitative et quantitative. L’implication de ces techniques peut s’étendre à la thérapie anticancéreuse, car elle imite l’immunothérapie adoptive par cellules T chez les patients atteints de cancer humain.

La veille des injections de cellules tumorales, ensemencez une fiole T 75 avec jusqu’à une fois 10 puissance septième. CMS quatre cellules rencontrées dans 10 millilitres de milieu RPMI contenant 10 % de sérum. Pour obtenir des cellules tumorales à croissance rapide, incubez pendant la nuit à 37 degrés Celsius le jour de l’injection.

Retirez le milieu et rincez les cellules une fois avec du PBS, puis récoltez les cellules tumorales avec 0,05 % de trypsine EDTA à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Arrêtez la réaction avec 10 millilitres de milieu RPMI contenant 10 % de sérum. Transférez les cellules dans un tube conique.

Faites tourner les cellules à 1300 tr/min dans une centrifugeuse RT val legend pendant trois minutes. À température ambiante, retirez le snat, remettez en suspension les cellules dans 10 millilitres d’un XHB Ss frais à laver. Ensuite, tournez à nouveau vers le bas et resuspendez de la même manière.

Comptez les cellules tumorales sur un hémo. Cytomètre. Diluer les cellules dans HBSS afin que les cellules nécessaires à chaque injection soient remises en suspension. Dans un volume total de 100 microlitres, réchauffez les souris B SEA âgées de six à huit semaines dans un bécher, immergées dans de l’eau chaude.

Pour dilater la veine de la queue, placez la souris dans un dispositif de contention de la veine de la queue sur le banc. Utilisez une micro-seringue pour injecter 100 microlitres de cellules tumorales dans la veine latérale de la queue. Utilisez une technique septique pour éviter l’infection après l’injection.

Exercez une légère pression sur le site d’injection jusqu’à ce que le saignement cesse. Remettez la souris dans la cage et laissez la tumeur se développer jusqu’au stade souhaité. Le jour du transfert, pipeter de haut en bas pour remettre en suspension les lymphocytes T cytotoxiques purifiés ou CTL préparés.

Comme décrit dans le texte, transférez toutes les cellules d’une plaque dans un tube conique de 15 millilitres, sans laisser le volume dépasser plus des deux tiers du tube. Insérez une pipette Pasteur stérile dans le tube conique et couchez la séparation des lymphocytes. Milieu ou LSM sous les cellules jusqu’à ce que le volume total approche 14 millilitres.

Attention à ne pas déranger les couches. Centrifugez à 2000 tr/min pendant 20 minutes à température ambiante. N’utilisez pas le frein pour ralentir le rotor après l’essorage, transférez les CTL dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.

Ajouter HBSS à un volume d’environ 10 millilitres. Laver. Comptez les cellules tourner à 1300 tr/min pendant cinq minutes À température ambiante, remettez en suspension un HBSS à la densité cellulaire requise pour les injections.

Maintien du volume total par injection à 100 microlitres. Utilisez la même technique d’injection de queue que celle vue plus haut dans cette vidéo. Pour injecter les CTL dans des souris porteuses d’une tumeur, retournez la souris dans la cage et permettez aux CTL d’interagir avec la tumeur.

Les souris sont généralement sacrifiées pour l’analyse 14 à 21 jours après le traitement par CTL. Pour visualiser les métastases pulmonaires, placez une souris sacrifiée sur son dos sur une planche de polystyrène. Épinglez les jambes pour assurer un accès libre à la trachée.

Vaporisez la face ventrale avec de l’éthanol à 70 % en commençant par le milieu de l’abdomen. À l’aide de ciseaux, coupez le long de la ligne médiane à travers la cage thoracique et vers les glandes salivaires. Exposez la trachée.

Utilisez des pinces pour enlever les tissus entourant la trachée. Enfilez une pointe de pipette de 200 microlitres sous la trachée en tenant l’embout d’une main. Soulevez doucement la trachée vers le haut et éloignez-la du corps.

Faites pivoter la plate-forme de 180 degrés. À l’aide d’une seringue de 50 millilitres, injectez de l’encre de Chine dans les poumons par la trachée. Gonflez complètement les poumons avec de l’encre jusqu’à ce que vous ressentiez une forte résistance.

Utilisez des ciseaux pour couper la trachée. Glissez une paire de pinces sous les poumons et retirez-les de la souris. Rincez brièvement les poumons dans un bécher d’un litre d’eau dans une hotte chimique.

Transférez les poumons dans une bile d’installation en verre contenant cinq millilitres de solution FTI. Le tissu tumoral émergera sous forme de nodules blancs sur les poumons noirs. Après quelques minutes, les tumeurs peuvent maintenant être comptées et commencer indéfiniment dans la solution FTI. Ici.

Poumons de souris atteintes d’un carcinome mammaire. La lignée cellulaire quatre T un montre des taches blanches indiquant des tumeurs. Des souris transfectées avec un IRF à huit dominantes négatives immunisées à K 79 E montrent le potentiel métastatique accru des cellules tumorales.

Ces images montrent une analyse histologique de l’efficacité de l’immunothérapie par transfert adoptif CTL. Des souris porteuses de tumeurs injectées avec une solution saline ont montré de multiples tumeurs six jours plus tard indiquées par des flèches. Des souris injectées avec des cellules T spécifiques de la tumeur, en revanche, ont montré une réduction des tumeurs dans la même expérience.

Le traitement à l’encre de Chine offre un moyen plus simple de mesurer l’efficacité du transfert adoptif CTL. Ici, les nodules tumoraux blancs sur les poumons porteurs de tumeurs les distinguent clairement des poumons qui ont subi avec succès un transfert adoptif CTL et le comptage des nodules permet un degré de quantification impossible avec l’histologie. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de réchauffer les souris pour des injections plus faciles et plus précises dans la veine de la queue.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer l’efficacité du traitement grâce à cette procédure simple pour quantifier la taille et le nombre de tumeurs. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.