Cryoconservation et la récupération des cellules iPS humaines utilisant KnockOut complète Chargeur sans sérum remplacement moyen

L'objectif général de cette procédure est de cryoconserver et de récupérer des cellules IPS en conditions de culture avec ou sans cellules nourricières. Cela est réalisé en commençant tout d'abord par préparer vos IPS comme vous le feriez habituellement. La deuxième étape de la procédure consiste à transférer les cellules dans un milieu de congélation sans sérum.

La troisième étape de la procédure consiste à cryoconserver comme vous le feriez habituellement. L'étape finale de la procédure est de décongeler les cellules et de commencer leur entretien. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant une congélation et une décongélation réussies de cellules IPS dans un milieu de congélation sans sérum, grâce à une morphologie saine et à une récupération après décongélation.

Bonjour, je suis Kate Wagner sur le site GCO de Life Technologies. La démonstration visuelle de ce protocole est essentielle, car les IPC sont très sensibles au gel et à la température fine. Ce qui facilite ce protocole, c'est que le substitut de sérum sans sérum peut être utilisé tout au long de votre flux de travail.

Aujourd'hui, la gamme de produits KSR comprend une liste complète de milieux et de réactifs pour la culture, avec ou sans cellules nourricières, sans sérum et sans composant xénogène, de vos cellules souches embryonnaires et de vos cellules souches pluripotentes induites. Le KSR peut être utilisé pour l'obtention, la croissance, la cryoconservation, l'expansion et les premières étapes de la différenciation. La vidéo suivante vous montrera comment décongeler et congeler vous-même vos échantillons en utilisant le KSR sur une machine Peter free.

Pour commencer cette procédure, réchauffez d'abord une quantité appropriée de milieu complet sans cellules nourricières à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Aspirez le milieu utilisé du récipient de culture, qui est dans ce cas une boîte de 60 millimètres. Rincez ensuite deux fois les cellules souches pluripotentes induites humaines avec du DPBS.

Ensuite, ajoutez un millilitre de dispa dans la boîte. Incubez la boîte à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Après cela, aspirez la solution de dispa et lavez délicatement les cellules avec du DPBS.

Ensuite, ajoutez du milieu complet sans cellules nourricières pour recouvrir la boîte et utilisez un grattoir à cellules pour détacher délicatement les cellules, puis transférez-les dans un tube stérile de centrifugation de 15 millilitres. Rincez la boîte avec du milieu complet sans cellules nourricières, en pulvérisant doucement pour détacher les cellules restantes. Transférez la solution de rinçage dans le même tube de centrifugation de 15 millilitres contenant les cellules.

Rincez la boîte une deuxième fois avec du milieu et récupérez cette solution de rinçage contenant les cellules en centrifugeant à 1000 tr/min pendant trois minutes à température ambiante. Après la centrifugation, aspirez soigneusement et jetez le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Secouez doucement le tube pour détacher complètement le culot cellulaire du fond du tube.

Ensuite, ajouter un millilitre de milieu de congélation A à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres et resuspendre les cellules en pipetant doucement plusieurs fois de haut en bas. Après une suspension uniforme des agrégats, ajouter un millilitre de milieu de congélation B au tube, goutte à goutte, tout en agitant doucement la suspension cellulaire par rotation pour bien mélanger. Répartir un millilitre de suspension cellulaire dans chaque cryotube et congeler les cellules à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit dans une chambre contenant de l’isopropanol.

Le jour suivant, transférez les flacons de cellules dans un réservoir d'azote liquide pour une conservation à long terme. Décongelez rapidement le flacon de cellules congelé en le plaçant dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant environ trois à quatre minutes, jusqu'à ce qu'il ne reste qu'un petit morceau congelé dans le flacon. Après avoir retiré le flacon du bain-marie, vaporisez de l'isopropanol à 70 % pour le désinfecter, puis utilisez une pipette de cinq millilitres pour transférer aseptiquement la totalité du contenu du flacon dans un tube conique de 15 millilitres.

L'étape suivante pourrait être l'aspect le plus délicat de la procédure. Le milieu sans cellules nourricières doit être ajouté lentement et avec précaution aux cellules. Pour réduire le choc osmotique, ajoutez lentement quatre millilitres de milieu complet sans cellules nourricières, goutte à goutte, aux cellules contenues dans le tube conique de 15 millilitres.

Lors de l'ajout du milieu, agitez doucement le tube de droite à gauche pour mélanger les cellules. Cela réduira le choc osmotique subi par les cellules. Le milieu complet sans cellules nourricières peut être remplacé par un milieu conditionné au méthanol contenant un substitut de sérum knockout ou par un milieu contenant un substitut de sérum knockout, à utiliser avec des cellules nourricières ; reportez-vous au texte du protocole pour les instructions de préparation des milieux.

Une fois que les quatre millilitres de milieu ont été ajoutés, centrifuger les cellules à 1000 tr/min pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, aspirer soigneusement et jeter le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Resuspendre délicatement le culot cellulaire dans quatre millilitres de milieu complet sans agents nourriciers.

À l’aide d’une pipette de cinq millilitres, ajoutez doucement la suspension cellulaire goutte à goutte dans une boîte de culture de 60 millimètres revêtue de gelt trucks. Placez la boîte de culture dans un incubateur à 36 à 38 degrés Celsius, avec une atmosphère humidifiée contenant 4 à 6 % de dioxyde de carbone dans l’air. Faites tourner doucement la boîte selon un mouvement nord-sud, est-ouest, afin de répartir uniformément les cellules.

24 heures après le décongélation. Remplacer le milieu dans la boîte par du milieu frais. Remplacer le milieu usagé quotidiennement par la suite jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence d'environ 70 à 80 %.

Cette image de contraste montre des cellules souches pluripotentes induites humaines cultivées sur des boîtes de culture revêtues de gelt TRX, en utilisant un milieu sans sérum complet et sans cellules nourricières. Les CIP présentent une morphologie similaire à celle des cellules souches embryonnaires humaines, caractérisée par de grands noyaux et un cytoplasme réduit. Exemple de cellules après décongélation et remplacement par sérum knockout.

Le milieu sans cellules nourricières sur gel de TrackX est montré ici. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de garder toutes vos colonies cellulaires de la même taille. Lors de la cryoconservation, cela améliore le rendement cellulaire.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.