Name: Cryoconservation et la récupération des cellules iPS humaines utilisant KnockOut complète Chargeur sans sérum remplacement moyen (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Apprenez la cryoconservation et la récupération des cellules iPS humaines en utilisant le milieu KnockOut SR sans sérum. Cette méthode garantit la viabilité cellulaire et une morphologie saine après décongélation.

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Remarque: Pour maintenir des conditions de culture stérile, toutes les procédures dans ce protocole sont réalisées en utilisant des pratiques de laboratoire stérile et réalisée sous hotte à flux laminaire. Avant de commencer, s&#39;assurer que tout média est équilibré à 37 ° C et de manière appropriée gazés. Préparation des boîtes de culture Geltrex enduits Note: voir l&#39;annexe pour l&#39;utilisation de boîtes de culture CELLstart couché. <ol><li> Dégeler un tube de Geltrex (1 ml) lentement à 2-8 ° C et diluer 1:100 c&#39;est dans 99 ml de Knockout D-MEM/F-12. Mélanger délicatement la solution. Remarque: Certaines des lignées de cellules iPS peuvent nécessiter une dilution différente Geltrex pour une croissance optimale. Voir l&#39;annexe pour des dilutions alternatives. </li><li> Couvrir toute la surface de chaque boîte de culture avec la solution Geltrex (1 ml pour un plat de 35 mm, 1,5 ml pour un plat de 60 mm). </li><li> Sceau chaque plat avec du Parafilm pour éviter le dessèchement et incuber les plats pendant 1 heure à 37 ° C. Remarque: À ce stade, vous pouvez stocker les boîtes de culture Geltrex enduits à 4 ° C jusqu&#39;à un mois. Sceau chaque plat avec du Parafilm pour empêcher la Geltrex de se dessécher. </li><li> Avant d&#39;utiliser, de transférer les plats Geltrex enduits d&#39;une hotte à flux laminaire et de leur permettre de s&#39;équilibrer à température ambiante (environ 1 heure). </li></ol> Préparation complète d&#39;alimentation sans SR KnockOut Medium <ol><li> Pour préparer 1 mL de 10 ug / ml solution FGF basique, de façon aseptique mélanger les composants énumérés ci-dessous. Aliquoter la solution et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à 6 mois. <table border="0"><tbody><tr><td> FGF basique </td><td> 10 ug </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10% de BSA </td><td> 10 uL </td></tr></tbody></table> Remarque: BSA peut être substitué avec HSA ou SR Knockout à la même concentration. </li><li> Pour préparer 50 ml de solution 2 Dispase mg / mL, de façon aseptique mélanger les composants énumérés ci-dessous. Filtre stériliser la solution et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Pour préparer 100 ml de SR KnockOut complète Feeder-Free (KSR-FF) aseptiquement combiner les composants répertoriés dans le tableau ci-dessous. <table border="1"><tbody><tr><td> Composante </td><td> Concentration Stock </td><td> Concentration finale </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Knockout DMEM/F12 (Cat. no. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76,8 ml </td></tr><tr><td> Glutamax-I (cat. n ° 35050-061) </td><td> 200 mM </td><td> 2 mM </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> KnockOut SR (Cat. no. 10828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> KnockOut SR-GFC (Cat. no. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> bFGF (Cat. no. PHG0024). </td><td> 10 ug / ml </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 uL </td></tr></tbody></table> Vous pouvez ranger le support KSR-FF à 2-8 ° C jusqu&#39;à une semaine. </li><li> Juste avant la pré-équilibration du milieu complet à la température et de gaz, ajouter aseptiquement le volume requis de 2 mercaptoéthanol (55 mM de concentration des stocks) pour une concentration de 0,1 mM final. Par exemple, pour préparer 100 ml de KSR-FMoyenne F ajoutez 182 uL de 55 mM de 2-mercaptoéthanol (1:550 dilution) Alternativement, le 2-mercaptoéthanol peuvent être ajoutés au milieu de 1X terminé et stocké à 2-8 ° C jusqu&#39;à une semaine. </li></ol> Préparation de congélation / Cryoconservation Medium Le milieu de cryopréservation se compose de deux médias; milieu de congélation A et B. milieu de congélation Ils sont ajoutés aux cellules à différents moments et doivent rester séparés. Ils sont chacun 50% du volume total des moyennes Cryoconservation nécessaire. Le volume total des moyennes Cryoconservation nécessaire est de 1 mL pour chaque flacon d&#39;être gelés. Un plat de 90% confluentes 60mm de CSEh peuvent être utilisés pour la banque 2 flacons de CSEh dans les médias cryoconservation. Préparer une quantité suffisante de chaque milieu de congélation avec un supplément de 2 à 5 ml pour assurer excédent. <table border="1"><tbody><tr><td> Un milieu de congélation (50% du volume final): </td><td> 50% DMEM/F12 </td><td> KSR 50% </td></tr><tr><td> Milieu de congélation B (50% du volume final): </td><td> 80% DMEM/F12 </td><td> 20% de DMSO </td></tr></tbody></table> Exemple: Si vous êtes de congélation 20 flacons de cellules, vous aurez besoin de 20 ml de Medium cryoconservation. Ajouter 4 ml d&#39;excédent pour un total de cryoconservation moyen 24ml. Cela signifie que vous aurez besoin 12 mL de milieu de congélation A. (50% de 24ml) et 12 mL de milieu B de congélation (50% de 24ml) <table border="1"><tbody><tr><td> Un milieu de congélation (12 ml): </td><td> 6 ml DMEM/F12 </td><td> 6 ml KSR </td></tr><tr><td> Milieu de congélation B (12 ml): </td><td> 9,6 ml DMEM/F12 </td><td> 2,4 ml de DMSO </td></tr></tbody></table> La composition finale du milieu cryoconservation est de 65% DMEM/F12, KSR 25%, et 10% de DMSO. Cryoconservation iPSCs <ol><li> Pré-chauffer le volume requis de Dispase dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. Se reporter au Tableau 1 ci-dessous pour plus de détails sur les volumes requis. </li><li> Pré-équilibrer le volume requis de KSR-FF dans un bain à 37 ° C pendant 15 min de l&#39;eau. Reportez-vous au tableau 1below pour des détails sur les volumes requis. </li><li> Aspirer le milieu épuisé du récipient de culture à l&#39;aide d&#39;une pipette, et rincer les cellules deux fois avec du D-PBS. </li><li> Ajouter délicatement solution de dispase préchauffée à la cuve de culture (par exemple, 1 ml de solution de dispase par boîte de culture de 60 mm). Agiter le récipient de culture pour enrober la surface des cellules entières. </li><li> Incuber le récipient de culture à 37 ° C pendant 3 minutes. </li><li> Retirez le récipient de l&#39;incubateur, aspirer la solution Dispase, et laver délicatement les cellules avec du D-PBS. </li><li> Gratter délicatement les cellules de la surface de la boîte de culture cellulaire à l&#39;aide d&#39;un grattoir, et le transfert des cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml stérile. </li><li> Rincer la boîte de culture à deux reprises avec KSR-FF, doucement &quot;pulvériser off&quot; toutes les cellules qui n&#39;ont pas détaché. Piscine de rinçage moyenne avec des cellules dans le tube de 15ml. </li><li> Centrifuger le tube à 200 xg pendant 5 minutes à température ambiante pour un culot cellulaire. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant sans perturber le culot cellulaire et le jeter. </li><li> Préparer une quantité suffisante de cryotubes. Une fois que les cellules sont en contact avec le DMSO, ils devraient être aliquotés et congelés dans les 2-3 minutes. </li><li> Tapotez doucement le tube, pour bien déloger le culot cellulaire du fond du tube et remettre en suspension les cellules dans un milieu de congélation A. [par un léger pipetage de haut en bas en utilisant un 5-mL pipette sérologique]. Suite à la suspension uniforme de touffes, ajouter un volume égal de milieu de congélation B à elle, d&#39;une manière goutte à goutte, tout en douceur tourbillonnant la suspension cellulaire à se mélanger. Remarque: À ce stade, les cellules sont en contact avec le DMSO, et les travaux doivent être effectués de manière efficace. Une fois que les cellules sont en contact avec le DMSO, ils devraient être aliquotés et congelés dans les 2-3 minutes. </li><li> Aliquote de 1 ml de la suspension cellulaire dans chaque cryovial. </li><li> Placer rapidement les flacons dans un Mr. Frosty [rapidement geler] et de le transférer à -80 ° C la nuit. </li><li> Après une nuit à -80 ° C, le transfert des cellules à un réservoir d&#39;azote liquide pour le stockage à long terme. </li></ol> dégel du flacon IPSC et la récupération des cellules Remarque: KSR-FF peuvent être remplacés par KSR contenant MEF milieu conditionné ou moyennes KSR pour une utilisation avec les mangeoires. Voir l&#39;annexe pour les instructions pour la préparation des supports. Préchauffer 10mL de KSR-FF moyennes dans un tube de 50 ml. <ol><li> Equilibrer la quantité appropriée de Geltrex enduit de plats à la température ambiante et aspirer le liquide de la vaisselle juste avant plaquager cellules. </li><li> Retirez délicatement la CSEh (ou COPSi) flacon de réservoir d&#39;azote liquide de stockage. </li><li> Rapidement dégel flacon congelé des cellules dans un bain à 37 ° C l&#39;eau, jusqu&#39;à ce que juste un petit morceau congelé reste dans le flacon. </li><li> Vaporiser flacon avec 70% d&#39;isopropanol de décontaminer et de le transférer à la hotte de culture de tissus stériles. </li><li> Transférer de façon aseptique le contenu entier du flacon dans un tube de 15 ml conique à l&#39;aide d&#39;une pipette 5 ml. </li><li> Rincer la fiole avec 1 ml de KSR-FF et ajoute à cela le tube de 15 ml centrifugeuse. </li><li> Lentement, ajouter 4 ml de KSR-FF goutte à goutte à des cellules dans le tube de 15 ml conique. Tout en ajoutant le support, déplacez doucement le tube avant et en arrière de mélanger les cellules. (Ce qui réduit le choc osmotique dans les cellules). </li><li> Centrifuger le tube 15 ml avec la suspension cellulaire à 1000rpm (200 x g) pendant 2 minutes à température ambiante. </li><li> Soigneusement aspirer et jeter le surnageant sans perturber le culot cellulaire. </li><li> Re-suspendre le culot cellulaire dans la pré-chauffé KSR-FF (p.ex. plats mm 4mL/60) en utilisant une pipette 5 ml et doucement la pipette les cellules de haut en bas jusqu&#39;à ce culot cellulaire est complètement dispersée. A la viabilité supérieure à 70% est attendue, cependant, si la viabilité est inférieure à 70%, il peut prendre plus de temps pour les cellules pour atteindre la confluence. </li><li> En utilisant la même pipette, transférer la suspension cellulaire goutte à goutte à boîte de culture Geltrex enduits pré-équilibrée à la température ambiante. </li><li> Placez la boîte de culture dans un incubateur à 37 ° C, avec une atmosphère humidifiée de 4 à 6% de CO 2 dans l&#39;air. Navire dans un tourbillon soigneusement nord au sud, d&#39;est en ouest, afin de répartir uniformément les cellules. </li><li> Doucement fluides changer la boîte de culture de 24 heures après décongélation et quotidiennement par la suite pour éliminer les débris cellulaires et de fournir des nutriments frais jusqu&#39;à ce que le plat est d&#39;environ 70-80% de confluence. Pour la culture continue et repiquage de vos cellules iPS, reportez-vous à notre protocole intitulé «Feeder-Free Culture et repiquage des cellules iPS humaines utilisant remplacement complet KnockOut Sérum Feeder milieu exempt&quot; </li></ol> Résultats attendus Les cellules doivent être à peu près 70-80% confluentes avant cryoconservation. Dispase résultats de digestion dans le curling et pliage des colonies le long des marges colonie. Après la récolte des cellules, ils sont gelés tant que petites touffes dans les médias cryoconservation. Une fois le flacon est décongelé, les cellules de récupérer et de joindre à l&#39;antenne de pré-revêtu comme de petites touffes. Ils grandissent rapidement conduit à un plat confluentes en 5-6 jours. Tableau 1 - Volumes recommandée <table border="1"><tbody><tr><td> Composante </td><td> Plat 35mm </td><td> Plat 60mm </td><td> Plat 100mm </td></tr><tr><td> Remplissez KnockOut SR moyennes </td><td> 2 ml </td><td> 4 ml </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Solution Geltrex </td><td> 1 ml </td><td> 1,5 ml </td><td> 4-5 ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 0,5 ml </td><td> 1 ml </td><td> 3-4 ml </td></tr><tr><td> D-PBS pour le rinçage </td><td> 2 ml </td><td> 4 ml </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">cliquez ici pour voir l&#39;appendice</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 sans gène</td><td></td><td>12660-012</td><td>Remarque : voir l'annexe pour l'utilisation de produits DMEM alternatifs, GlutaMAX-I (n° de catalogue 35050-061)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail de facteurs de croissance de remplacement du sérum KnockOut</td><td></td><td>A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF basique, protéine recombinante humaine, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>PHG0024</td><td>Remarque : voir l'annexe pour les autres tailles d'emballage du bFGF.</td></tr><tr><td>2-mercapto&amp;#8211;éthanol</td><td></td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>17105-041</td><td>Remarque : voir l'annexe pour des méthodes alternatives de relèvement</td></tr><tr><td>Geltrex Matrice basale à facteurs de croissance réduits, qualifié pour cellules souches embryonnaires humaines, 1 mL</td><td></td><td>A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) sans calcium ni magnésium</td><td></td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 500 mL</td><td>JT Baker</td><td>JT9224-1</td><td></td></tr><tr><td>Hotte stérile pour culture de tissus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur réglé à 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie réglé à 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques stériles (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuger</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 15 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire de 60 mm traitées</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réservoir de stockage d'azote liquide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conteneurs de congélation à l'isopropanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vials cryogéniques de 1,5 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cryoconservation et la récupération des cellules ips humaines utilisant knockout complète chargeur sans sérum remplacement moyen

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

La découverte en 2006 que les fibroblastes humains et de souris pouvaient être reprogrammées pour produire des cellules iPS 1-3 avec des qualités remarquablement similaires aux cellules souches embryonnaires a créé une nouvelle source précieuse de cellules pluripotentes pour la découverte de médicaments, la thérapie cellulaire, et la recherche fondamentale. Les médias et les réactifs GIBCO ont été à la pointe de la recherche de cellules souches pluripotentes pendant des années. Knockout DMEM supplémenté avec remplacement Knockout sérum est le média de choix pour la croissance des cellules souches embryonnaires et maintenant la culture de cellules iPS 3-9. Cet or média standard du système peut maintenant être utilisé pour le chargeur sans la culture avec l&#39;ajout de SR Knockout facteur de croissance cocktail. Traditionnelle ES humaines et des méthodes de culture de cellules iPS nécessite l&#39;utilisation de la souris ou humains couches nourricières de fibroblastes, ou le chargeur milieu conditionné. Ces méthodes de culture sont une main-d&#39;œuvre, dur à l&#39;échelle et il est difficile de maintenir les cellules indifférenciées hanches à cause des conditions indéfini. Invitrogen a développé SR Knockout facteur de croissance cocktail pour vous permettre de passer facilement de vos hanches et des cultures de cellules hES d&#39;alimentation sans tout en conservant votre utilisation du SR Knockout.

Ce protocole décrit la procédure détaillée pour la cryoconservation de cellules iPS humaines dans un milieu de cryoconservation KnockOut SR et la récupération de ces cellules en complète KnockOut Feeder SR gratuit (KSR-FF) moyen ou le chargeur milieu à base de SR huitièmes de finale.

Cryoconservation et la récupération des cellules iPS humaines utilisant KnockOut complète Chargeur sans sérum remplacement moyen

La découverte en 2006 que les fibroblastes humains et murins pouvaient être reprogrammés pour générer des cellules iPS 1-3, avec des qualités remarquablement similaires à celles des cellules souches embryonnaires...

L'objectif général de cette procédure est de cryoconserver et de récupérer des cellules IPS en conditions de culture avec ou sans cellules nourricières. Cela est réalisé en commençant tout d'abord par préparer vos IPS comme vous le feriez habituellement. La deuxième étape de la procédure consiste à transférer les cellules dans un milieu de congélation sans sérum.La troisième étape de la procédure consiste à cryoconserver comme vous le feriez habituellement. L'étape finale de la procédure est de décongeler les cellules et de commencer leur entretien. En définitive, des résultats peuvent être obtenus, montrant une congélation et une décongélation réussies de cellules IPS dans un milieu de congélation sans sérum, grâce à une morphologie saine et à une récupération après décongélation.Bonjour, je suis Kate Wagner sur le site GCO de Life Technologies. La démonstration visuelle de ce protocole est essentielle, car les IPC sont très sensibles au gel et à la température fine. Ce qui facilite ce protocole, c'est que le substitut de sérum sans sérum peut être utilisé tout au long de votre flux de travail.Aujourd'hui, la gamme de produits KSR comprend une liste complète de milieux et de réactifs pour la culture, avec ou sans cellules nourricières, sans sérum et sans composant xénogène, de vos cellules souches embryonnaires et de vos cellules souches pluripotentes induites. Le KSR peut être utilisé pour l'obtention, la croissance, la cryoconservation, l'expansion et les premières étapes de la différenciation. La vidéo suivante vous montrera comment décongeler et congeler vous-même vos échantillons en utilisant le KSR sur une machine Peter free.Pour commencer cette procédure, réchauffez d'abord une quantité appropriée de milieu complet sans cellules nourricières à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Aspirez le milieu utilisé du récipient de culture, qui est dans ce cas une boîte de 60 millimètres. Rincez ensuite deux fois les cellules souches pluripotentes induites humaines avec du DPBS.Ensuite, ajoutez un millilitre de dispa dans la boîte. Incubez la boîte à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Après cela, aspirez la solution de dispa et lavez délicatement les cellules avec du DPBS.Ensuite, ajoutez du milieu complet sans cellules nourricières pour recouvrir la boîte et utilisez un grattoir à cellules pour détacher délicatement les cellules, puis transférez-les dans un tube stérile de centrifugation de 15 millilitres. Rincez la boîte avec du milieu complet sans cellules nourricières, en pulvérisant doucement pour détacher les cellules restantes. Transférez la solution de rinçage dans le même tube de centrifugation de 15 millilitres contenant les cellules.Rincez la boîte une deuxième fois avec du milieu et récupérez cette solution de rinçage contenant les cellules en centrifugeant à 1000 tr/min pendant trois minutes à température ambiante. Après la centrifugation, aspirez soigneusement et jetez le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Secouez doucement le tube pour détacher complètement le culot cellulaire du fond du tube.Ensuite, ajouter un millilitre de milieu de congélation A à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres et resuspendre les cellules en pipetant doucement plusieurs fois de haut en bas. Après une suspension uniforme des agrégats, ajouter un millilitre de milieu de congélation B au tube, goutte à goutte, tout en agitant doucement la suspension cellulaire par rotation pour bien mélanger. Répartir un millilitre de suspension cellulaire dans chaque cryotube et congeler les cellules à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit dans une chambre contenant de l’isopropanol.Le jour suivant, transférez les flacons de cellules dans un réservoir d'azote liquide pour une conservation à long terme. Décongelez rapidement le flacon de cellules congelé en le plaçant dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant environ trois à quatre minutes, jusqu'à ce qu'il ne reste qu'un petit morceau congelé dans le flacon. Après avoir retiré le flacon du bain-marie, vaporisez de l'isopropanol à 70 % pour le désinfecter, puis utilisez une pipette de cinq millilitres pour transférer aseptiquement la totalité du contenu du flacon dans un tube conique de 15 millilitres.L'étape suivante pourrait être l'aspect le plus délicat de la procédure. Le milieu sans cellules nourricières doit être ajouté lentement et avec précaution aux cellules. Pour réduire le choc osmotique, ajoutez lentement quatre millilitres de milieu complet sans cellules nourricières, goutte à goutte, aux cellules contenues dans le tube conique de 15 millilitres.Lors de l'ajout du milieu, agitez doucement le tube de droite à gauche pour mélanger les cellules. Cela réduira le choc osmotique subi par les cellules. Le milieu complet sans cellules nourricières peut être remplacé par un milieu conditionné au méthanol contenant un substitut de sérum knockout ou par un milieu contenant un substitut de sérum knockout, à utiliser avec des cellules nourricières ; reportez-vous au texte du protocole pour les instructions de préparation des milieux.Une fois que les quatre millilitres de milieu ont été ajoutés, centrifuger les cellules à 1000 tr/min pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, aspirer soigneusement et jeter le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Resuspendre délicatement le culot cellulaire dans quatre millilitres de milieu complet sans agents nourriciers.À l’aide d’une pipette de cinq millilitres, ajoutez doucement la suspension cellulaire goutte à goutte dans une boîte de culture de 60 millimètres revêtue de gelt trucks. Placez la boîte de culture dans un incubateur à 36 à 38 degrés Celsius, avec une atmosphère humidifiée contenant 4 à 6 % de dioxyde de carbone dans l’air. Faites tourner doucement la boîte selon un mouvement nord-sud, est-ouest, afin de répartir uniformément les cellules.24 heures après le décongélation. Remplacer le milieu dans la boîte par du milieu frais. Remplacer le milieu usagé quotidiennement par la suite jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence d'environ 70 à 80 %.Cette image de contraste montre des cellules souches pluripotentes induites humaines cultivées sur des boîtes de culture revêtues de gelt TRX, en utilisant un milieu sans sérum complet et sans cellules nourricières. Les CIP présentent une morphologie similaire à celle des cellules souches embryonnaires humaines, caractérisée par de grands noyaux et un cytoplasme réduit. Exemple de cellules après décongélation et remplacement par sérum knockout.Le milieu sans cellules nourricières sur gel de TrackX est montré ici. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de garder toutes vos colonies cellulaires de la même taille. Lors de la cryoconservation, cela améliore le rendement cellulaire.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Le protocole suivant fournit des instructions pour l'adaptation humaine souches pluripotentes induites (iPS) à la desserte de culture sans l'aide complète d'alimentation sans remplacement KnockOut Sérum moyennes (KSR-FF). Une fois adaptée, des instructions pour l'entretien continu sont également fournis.

Chargeur sans adaptation, de la Culture et de repiquage des cellules iPS humaines à l&#39;aide complète d&#39;alimentation sans remplacement KnockOut Sérum Medium

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Efficace sur les Cellules iPS génération de sang à l&#39;aide qu&#39;épisomes et les inhibiteurs de HDAC

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Ici, nous rapportons un protocole pour développer un système tridimensionnel (3-D) à partir de cellules souches induites par l'homme-pluripotent (hiPSC) appelé le corps embryoïde sans sérum (SFEB). Ce modèle 3-D peut être utilisé comme une culture de tranche organotypique pour modéliser le développement cortical humain et pour l'interrogation physiologique des circuits neuronaux en développement.

Développer des corps embryoïdes libres de sérum dérivés dérivés de HiPSC pour l&#39;interrogation de cultures cellulaires souches 3-D à l&#39;aide de tests physiologiquement pertinents

La production de cellules spécialisées de la rétine de cellules souches pluripotentes est un tournant dans le développement de la thérapie à base de cellules souches pour les maladies de la rétine. Le présent document décrit une méthode simple pour une génération efficace d’organoïdes rétinienne et l’épithélium pigmentaire rétinien pour la recherche fondamentale, translationnelle et clinique.

Xeno-libre défini et exempte d’engraissement des Conditions de Culture pour les modèles de cellule rétinienne Generation of Human dérivés iPSC

Les cellules germinales primordiales (PGC) sont des précurseurs communs du sperme et des œufs. PGC embryonnaires humaines est spécifiées de pluripotentes épiblaste grâce à des interactions des cytokines. Nous décrivons ici un protocole 13 jours d’induire les cellules humaines transcriptomally ressemblant à des PGC à la surface du corps embryoïdes d’apprêté-induite la pluripotence des cellules souches pluripotentes.

Génération de cellules humaines de ressemblant cellules germinales primordiales à la Surface du corps embryoïdes de pluripotence amorcée induite par les cellules souches pluripotentes

Les progéniteurs endothéliaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPS-EP) ont le potentiel de révolutionner les traitements des maladies cardiovasculaires et de permettre la création de modèles de maladies cardiovasculaires plus fidèles. Ici, l'encapsulation des iPSC-EPs dans les microenvironnements tridimensionnels (3D) de collagène et une analyse quantitative du potentiel vasculogenic de ces cellules sont décrites.

Un modèle 3D in vitro et un pipeline computationnel pour quantifier le potentiel vasculogénique des progéniteurs endothéliaux dérivés de l'iPSC

La reprogrammation cellulaire nécessite l'introduction de gènes clés, qui régulent et maintiennent l'état cellulaire pluripotent. Le protocole décrit permet la formation de colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de fibroblastes dermiques humains sans méthodes virales/intégratrices, mais en utilisant des ARN non modifiés (NM-ARN) combinés à des facteurs d'évasion immunitaire réduisant les mécanismes de défense cellulaire.

Isolement des fibroblastes dermiques humains adultes de la peau abdominale et génération de cellules souches pluripotentes induites à l'aide d'une méthode de non-intégration

Nous présentons ici un protocole pour un système automatisé de culture cellulaire. Ce système de culture automatisé réduit la main-d’œuvre et profite aux utilisateurs, y compris les chercheurs qui ne sont pas familiers avec la manipulation des cellules souches pluripotentes induites (iPS), de l’entretien des cellules iPS à la différenciation en différents types de cellules.

Système de culture automatisé pour le maintien et la différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Cette étude fournit un protocole détaillé pour la cryoconservation efficace des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches humaines.

Cryoconservation de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines au stade optimal

Ici, nous présentons une méthode pour différencier et étendre les cellules tueuses naturelles exprimant le récepteur de l’antigène chimérique (CAR) humain dérivé de l’iPSC avec une meilleure destruction contre diverses tumeurs malignes. Ce protocole démontre la différenciation et l’expansion des cellules CAR-NK dérivées d’iPSC optimisées pour les tueurs naturels (NK) et la mesure de l’activité antitumorale contre diverses lignées cellulaires tumorales.

Progrès dans les cellules tueuses naturelles exprimant le récepteur de l’antigène chimérique dérivé de cellules souches pluripotentes humaines induites

Apprenez la cryoconservation et la récupération des cellules iPS humaines en utilisant le milieu KnockOut SR sans sérum. Cette méthode garantit la viabilité cellulaire et une morphologie saine après décongélation.

Cryoconservation et la récupération des cellules iPS humaines utilisant KnockOut complète Chargeur sans sérum remplacement moyen (Vidéo) | JoVE Journal

Cryoconservation et la récupération des cellules iPS humaines utilisant KnockOut complète Chargeur sans sérum remplacement moyen

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