Cryoconservation et la récupération des cellules iPS humaines utilisant KnockOut complète Chargeur sans sérum remplacement moyen

L’objectif général de cette procédure est de cryoconserver et de récupérer des cellules IPS dans des conditions de culture basée sur ou sans nourrisseur. Pour ce faire, commencez d’abord à emballer vos IPC comme vous le feriez normalement. La deuxième étape de la procédure consiste à transférer les cellules dans un milieu de congélation sans sérum.

La troisième étape de la procédure consiste à cryoconserver comme vous le feriez normalement. La dernière étape de la procédure consiste à décongeler les cellules et à commencer l’entretien. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent une congélation et une décongélation réussies des cellules IPS dans un milieu de congélation sans sérum grâce à une morphologie saine et à une récupération après décongélation.

Bonjour, je m’appelle Kate Wagner et je travaille sur le site GCO de Life Technologies. La démonstration visuelle de ce protocole est essentielle car les IPC peuvent être très sensibles au gel et à la finesse T. Ce qui facilite ce protocole, c’est que le remplacement du sérum knockout peut être utilisé tout au long de votre flux de travail.

Aujourd’hui, la famille de produits KSR comprend une liste complète de milieux et de réactifs pour la culture sans aliments et sans xéno de vos cellules souches embryonnaires et de vos cellules souches pluripotentes induites. La KSR peut être utilisée pour la croissance par dérivation, la cryo-préservation, l’expansion et les premières étapes initiales de la différenciation. La vidéo suivante vous montrera décongeler et congeler à l’aide de KSR dans une machine sans Peter.

Pour commencer cette procédure. Réchauffez d’abord dans une quantité appropriée de milieu libre d’alimentation complet à 37 degrés Celsius dans un bain-marie, aspirez le milieu épuisé du récipient de culture, qui est une parabole de 60 millimètres. Dans ce cas, rincez deux fois les cellules souches pluripotentes induites humaines avec du DPBS.

Ajoutez ensuite un millilitre de dispa dans le plat. Incuber le plat à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Après cela, aspirez la solution dispa et lavez doucement les cellules avec DPBS.

Ensuite, ajoutez un milieu complet sans alimentateur pour couvrir la boîte et utilisez un grattoir cellulaire pour gratter doucement les cellules de transfert de cellules dans un tube à centrifuger stérile de 15 millilitres. Rincez le plat avec une alimentation complète de milieu libre, en vaporisant doucement les cellules qui ne se sont pas détachées. Transférez la solution de rinçage dans le même tube de 15 millilitres contenant les cellules.

Rincez le plat une deuxième fois avec un fluide et tirez cette solution de rinçage avec les cellules granulées par centrifugation à 1000 tr/min pendant trois minutes à température ambiante. Après la centrifugation, aspirez et jetez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Agitez doucement le tube pour déloger complètement la pastille de cellule du bas du tube.

Ajoutez ensuite un millilitre de produit de congélation A, à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, et remettez les cellules en suspension en pipetant doucement de haut en bas. Après la suspension uniforme des amas de morceaux, ajoutez un millilitre de produit de congélation B dans le tube en goutte à goutte tout en remuant doucement la suspension cellulaire pour mélanger. Allouez un millilitre de suspension cellulaire dans chaque cellule de congélation cryologique à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit dans une chambre d’isopropanol.

Le lendemain, transférez les flacons de cellules dans un réservoir d’azote liquide pour un stockage à long terme. Décongelez rapidement le flacon de cellules congelées en le plaçant dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant environ trois à quatre minutes jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un petit morceau congelé dans le flacon. Après avoir retiré le flacon du bain-marie, vaporisez de l’isopropanol à 70 % pour le décontaminer, utilisez une pipette de cinq millilitres pour transférer aseptiquement tout le contenu du flacon dans un tube conique de 15 millilitres.

L’étape suivante peut être l’aspect le plus difficile de la procédure. Le milieu libre d’alimentation doit être ajouté lentement et soigneusement aux cellules. Pour réduire le choc osmotique, ajoutez lentement quatre millilitres de milieu complet libre d’alimentation goutte à goutte aux cellules du tube conique de 15 millilitres.

Pendant l’ajout du fluide, déplacez doucement le tube d’avant en arrière pour mélanger les cellules. Cela réduira le choc osmotique vers les cellules. Le milieu complet sans alimentateur peut être remplacé par un milieu de remplacement du sérum contenant du milieu conditionné à la méthamphétamine ou un milieu de remplacement du sérum pour une utilisation avec des mangeoires, reportez-vous au texte du protocole pour les instructions de préparation du milieu.

Une fois que les quatre millilitres de milieu ont été ajoutés, centrifugez les cellules à 1000 tr/min pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, aspirez soigneusement et jetez le sane sans perturber la pastille cellulaire. Remettez doucement en suspension la pastille de cellule dans quatre millilitres de milieu complet sans alimentateur.

À l’aide d’une pipette de cinq millilitres, ajoutez délicatement la suspension cellulaire goutte à goutte dans une boîte de culture de 60 millimètres recouverte de gelt trucks. Placez la boîte de culture dans un incubateur de 36 à 38 degrés Celsius avec une atmosphère humidifiée de 4 à 6 % de dioxyde de carbone dans l’air. Faites tourner délicatement la parabole du nord au sud et d’est en ouest pour répartir uniformément les cellules.

24 heures après le dégel. Remplacez le milieu dans le plat par un milieu frais. Remplacez le milieu épuisé tous les jours jusqu’à ce que les cellules deviennent confluentes à environ 70 à 80 %.

Cette image contrastée montre des cellules souches pluripotentes induites humaines cultivées sur des boîtes de culture enrobées de gelt TRX en utilisant un remplacement complet du sérum, sans milieu nourricier. Les IPC présentent une morphologie similaire à celle des cellules souches embryonnaires humaines, caractérisées par de gros noyaux et un cytoplasme rare. Un exemple de cellules post-décongélation et de remplacement sérique knock-out.

Le milieu sans feeder sur gelt TrackX est illustré ici. Lorsque vous suivez cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder toutes vos colonies cellulaires de la même taille. La cryoconservation améliore la récupération cellulaire.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.