Name: Lexpérimentation physiologique avec lintestin postérieur écrevisses: un exercice de laboratoire étudiant (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Découvrez les techniques de dissection et de mesure de l'activité péristaltique de l'intestin postérieur de l'écrevisse. Cette méthode permet d'étudier la physiologie musculaire viscérale et la pharmacologie des contractions.

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Soutenue par l&#39;Université du Kentucky, Département de biologie, Bureau des études de premier cycle et le Collège des Arts et des Sciences.

1. Présentation L'aperçu plus récente de l'intestin postérieur écrevisses a été respectée dans une dissertation par le Dr Barbara E. Musolf (2007, Georgia State University, Atlanta, Géorgie, USA), qui portait principalement sur ​​la modulation sérotoninergique et l'innervation (Musolf et al., 2009 ). Hindguts crustacés ont d'abord été étudiée il ya 100 ans par les Alexandrowicz, un pionnier dans l'anatomie comparée (Alexandrowicz, 1909), qui a décrit les divers aspects de leur innervation. La recherche s'est poursuivie au fil des années, d'identifier les types de couches de muscles et de l'architecture, s'adressant à la fonction globale de l'intestin postérieur dans l'osmorégulation chez l'animal entier, et en examinant le contrôle de modulation de la contractilité hindgut par divers composés (voir revue par Musolf, 2007). Il est intéressant de noter que la portion anale de l'intestin postérieur agit non seulement à expulser les selles, mais aussi de prendre l'eau de l'environnement pour l'osmorégulation. Cette région de l'intestin peut subir avant ou arrière selon le péristaltisme besoins de l'animal. Alexandrowicz (1909) ont identifié deux plexus nerveux innervant l'intestin postérieur crustacé, une intérieure et une extérieure du plexus plexus, ce qui s'avéra plus tard être de riches sources pour identifier et caractériser les neurotransmetteurs. Dans le Florey 1950, le Dr Ernst a commencé une série d'études pharmacologiques sur l'intestin postérieur écrevisses et a démontré que les contractions sont modulées par l'acétylcholine et ses composés apparentés et aussi par l'adrénaline et la noradrénaline (Florey, 1954). Florey, le découvreur d'une substance inhibitrice connue comme «facteur-I", ont étudié les effets de cette substance sur diverses préparations, y compris le système gastro-intestinal chez les écrevisses (Florey, 1961). Facteur-I a été démontré plus tard à GABA. Ainsi, l'intestin postérieur écrevisses joué un rôle important dans les premières études de l'inhibition synaptique. Après la découverte du GABA, d'autres émetteurs putatifs ont été également montré pour être associé à l'intestin postérieur plexus et de susciter des réactions physiologiques. Émetteurs comprennent la dopamine (Elekes et al 1988;. Elofsson et al 1968.) Proctoline (RYLPG-OH;. Mercier et al 1997) deux peptides orcokinin (NFDEIDRSGFGFN et AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al, 1994;.. Dircksen et al 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen et al 2000.) et un peptide myosuppressin (Mercier et al, 1997;... pQDLDHVFLRFamide plus probable, cf Stemmler et al 2007). Chacune de ces substances modulant les contractions spontanées hindgut, et tous sauf GABA semble être excitateurs. L'intestin postérieur répond également aux glutamate et quisqualate (Jones, 1962;. Mauvaise et al 2003), mais des preuves claires pour l'innervation glutamatergique n'a pas été signalée. Messagers intracellulaires qui influent sur les effets des émetteurs différents sont en grande partie inexplorée, mais il ya des preuves de l'implication de l'AMPc dans la capacité de la dopamine pour améliorer les contractions (Knotz &amp; Mercier, 1995). Bien que l'intestin postérieur crustacés contrats spontanément après dénervation, ces contractions sont généralement faibles et désorganisés (Pays de Galles, 1982; Winlow &amp; Laverack, 1972a). Le mouvement péristaltique de sortie du moteur nécessite coordonné à partir du système nerveux central, apparemment originaires du dernier ganglion abdominal (Winlow &amp; Laverack, 1972a, b, c). Dans les écrevisses, la puissance du moteur est effectué à l'intestin postérieur par la racine 7 ème abdominale, qui contient 75 axones dont les corps cellulaires sont localisés dans le ganglion dernière abdominale (Kondoh &amp; Hisada, 1986). Au moins certains des peptides semblent être fournis au plexus hindgut à partir de neurones provenant du ganglion dernière abdominale (Dircksen et al 2000;.. Mercier et al, 1991b; Siwicki &amp; Bishop, 1986), mais la dopamine est fournie par les neurones dans plusieurs ganglions antérieure (Mercier et al. 1991a). Depuis la sortie du moteur grâce à la racine 7 ème abdominale est nécessaire pour les grands, les contractions coordonnées, il est probable que certains ou tous les émetteurs putatifs énumérés ci-dessus contribuent d'une certaine façon de péristaltisme. Leur contribution relative, cependant, ne sont pas connus. Certains aperçu peut être acquise par l'étude de leurs effets sur les muscles circulaires et longitudinaux séparément (Mercier &amp; Lee, 2002). En plus de contrôler le mouvement des aliments non digérés, le plexus nerveux associés à l'intestin postérieur crustacés semble jouer une fonction endocrine associée à la mue. L'intestin postérieur du crabe, Carcinus maenas, contient des cellules endocrines qui libèrent l'hormone hyperglycémiques crustacés et de son peptide précurseur liées au cours ecdysis (Webster et al. 2000), suggérant un rôle dans l'absorption d'eau et de gonflement associés à la mue. Ainsi, l'intestin postérieur crustacés participe à plusieurs processus physiologiques importants. Ce rapport est principalement un outil d'enseignement pour l'école secondaire de pointe et les étudiants de premier cycle en cours de physiologie qui participent à l'expérimentation. L'importance ainsi que le mécanisme potentiel derrière comment les contrats hindgut et les fonctions peuvent être abordées par les élèves. Les agents pharmacologiques, les neurotransmetteurs et neurohormones seront utilisés, et les courbes dose-réponse sera construite, ce qui va amener les élèves à la façon d'acquérir et interpréter les données physiologiques et pharmacologiques. Une compréhension générale de la fonction du récepteur à l'égard des agonistes et antagonistes peuvent aussi être atteints. Les étudiants apprendront aussi à présenter des données sous forme graphique pour l'analyse statistique. Il est très facile de disséquer et d'enregistrer les contractions de l'intestin postérieur écrevisses. Dans la préparation disséquée, l'intestin est facilement exposés à des substances exogènes. L'altération de l'activité péristaltique peut être contrôlé visuellement ou avec un capteur de force, qui peut aussi surveiller la force des contractions. En raison de sa simplicité et sa fiabilité en tant que préparation de bio-essais, l'intestin postérieur écrevisses est encore très utile pour étudier les questions de recherche beaucoup sur les mécanismes de péristaltisme, la modulation de puissance du moteur et la contraction musculaire, et la fonction du récepteur. L'intestin postérieur est également utile pour les insecticides tests, crustaceancides, et les polluants pour les mécanismes d'actions spécifiques. 2. Méthodes 2.1) Matières <ul><li> écrevisse </li><li> écrevisses salines </li><li> instruments de dissection (ciseaux grossière et fine, grossière et une pince fine) </li><li> Sylgard à fond plat de Pétri </li><li> tiges d'acier dissection </li><li> béchers (pour retenir des solutions chimiques) </li><li> parafilm (pour couvrir le mélange et solutions) </li></ul> 2.2) Dissection <ol><li> Ecrevisses (Procambarus clarkii) mesurant 6-10 cm de longueur du corps doit être placé sur la glace pendant 5 à 10 minutes à anesthésier l'animal avant dissection débute. </li><li> Tenir les écrevisses anesthésiés par derrière les griffes d'une seule main. Rapidement, coupé de la cavité de l'œil au milieu de la tête sur les deux faces, puis décapiter les écrevisses (Remarque: le sang de la préparation sera collante quand elle sèche, donc lavez les outils une fois rempli). <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Décapitation de l'écrevisse </li><li> Coupez le chélipèdes et les jambes de marche. </li><li> Coupez les ailerons gauche et à droite, ne laissant que la nageoire caudale du milieu (uropode). </li><li> Sur la face dorsale de l'écrevisse coupé ventralement la fois sur le côté gauche et à droite de la cuticule dorsale. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: Retrait de cuticule dorsale </li><li> Couper transversalement sur la face dorsale de la cuticule, en s'assurant que la coupe est peu profonde pour éviter d'endommager l'IG Ensuite, retirer la partie inférieure de la cuticule dorsale abdominale. </li><li> Placez les écrevisses disséqué dans un plat Sylgard fourrées. </li><li> Epingler les écrevisses à l'antenne à la pointe de la nageoire caudale. On peut utiliser plusieurs broches de chaque côté de l'IG en tant que nécessaire pour maintenir le corps vers le bas. </li><li> Remplir le plat avec une solution saline écrevisses couvrant l'IG Assurez-vous de toujours éteindre le GI avec une solution saline à l'aide d'une pipette. Saline est une solution modifiés Van Harreveld (1936), ce qui est fait avec 205 mM de NaCl, 5,3 mM de KCl; 13,5 mM CaCl 2, 2H 2 O; 2,45 mM MgCl 2 6H 2 O, 5 mM d'HEPES et ajusté à pH 7,4. L'écrevisse disséqués doit apparaître comme le montre la figure 3. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3: écrevisses disséqué avec IG intactes. </li></ol> 2.3) Expériences 2.3.1) Les contractions de l'animal <ol><li> Avez-solutions du composé à tester prêt et à la même température que la solution saline de bain. Sur pourraient utiliser des solutions individuelles de la sérotonine (100 nM, 1microM), le glutamate (1microM), et de la dopamine (1microM) faite dans une solution saline écrevisses comme substances de départ pour être testés. </li><li> Autoriser l'écrevisse disséqués à s'asseoir dans la solution des écrevisses pendant environ dix minutes pour lui permettre de s'ajuster au choc de la dissection et l'exposition saline. Les contractions lentes péristaltisme de l'intestin postérieur devrait commencer à produire. </li><li> Une fois les contractions commencent, d'enregistrer le nombre de contractions qui se produisent dans une trentaine de secondes (noter le type de contractions qui se produisent: Type péristaltisme-dire, ou spastique, et la direction de toute ondes péristaltiques). Tableau 1: Les contractions dans les écrevisses Saline <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de contractions </td><td> Type de contractions </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> L'utilisation d'un PIPette, enlever la solution saline dans la cavité de l'abdomen de l'écrevisse exposés, et appliquer une solution saline contenant la substance à examiner directement sur le postérieur. </li><li> Immédiatement après l'ajout de la solution, enregistrer le nombre de contractions qui surviennent après trente secondes et noter le type de contractions qui se produisent (c.-péristaltique, ou spastique). Tableau 2: Contractions à l'exposition aux composés <table border="1"><tbody><tr><td> Composé testé </td><td> Concentration </td><td> Nombre de contractions </td><td> Type de contractions </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Immédiatement après l'enregistrement de la réponse à la substance d'essai, rincer la fois de plusieurs GI avec une solution saline normale écrevisses. Laissez la préparation reposer pendant 5 minutes, tout en rinçant toutes les 30 secondes avec une solution saline écrevisses. </li><li> Avec une pipette, placer quelques saline contenant le composé suivant à examiner ou à une concentration de la substance variée derniers testés directement sur le postérieur. Il est préférable de commencer avec une concentration plus faible et la façon dont une œuvre à des concentrations plus élevées. </li><li> Immédiatement après l'ajout de chaque nouvelle substance ou chaque nouvelle concentration, enregistrer le nombre de contractions qui surviennent après trente secondes et noter le type de contractions. </li></ol> 2.3.2) L'enregistrement des forces de contraction dans les préparations excisées <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4: Installation <ol><li> Fixez le transducteur à la nacelle du pont. </li><li> Fixez le pont à la gousse de 26T PowerLab. </li><li> Fixez le 26T PowerLab au port USB de l'ordinateur. </li><li> Ouvrez LabChart7, en cliquant sur l'icône labchart7 sur le bureau. <ul><li> La zone Centre LabChart Bienvenue apparaîtra ouvert. Fermez-le. </li><li> Cliquez sur Setup </li><li> Cliquez sur Paramètres canal. Changer le nombre de canaux à 1 (en bas à gauche de la boîte) Appuyer sur OK. </li><li> En haut à gauche de la carte de l'ensemble de cycles par seconde à environ 2k. Réglez le volts (axe Y) à environ 500 ou 200 mV. </li><li> Cliquez sur le canal 1 sur la droite du graphique. Cliquez sur l'amplificateur d'entrée. Assurez-vous que les paramètres: single-ended, couplage AC, et inverser (inverse le signal si nécessaire), et d'anti-alias, sont vérifiées. </li><li> Pour commencer l'enregistrement appuyer sur start. </li></ul></li><li> Ramasser la préparation et couper le tube digestif à la jonction entre le thorax et l'abdomen. Puis couper soigneusement autour de la partie telson de la queue. Retirer le tube digestif de l'écrevisse disséqué et le placer dans le plat Sylgard. Il ya un vaisseau sanguin qui longe la face dorsale du tube digestif. Retirez soigneusement ce loin du tractus gastro-intestinal. Verser salines écrevisses fraîches sur la préparation. </li><li> Placez le capteur de force dans la pince à proximité de l'écrevisse disséqués. </li><li> Accrocher le capteur de force dans l'IG écrevisses comme dans la Figure 5. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5: hindgut isolés de l'écrevisse dans une solution saline attachée au crochet du capteur de force </li><li> Attendez jusqu'à ce que l'IG commence à se contracter, et appuyez sur Start sur la LabChart7. </li><li> Laissez le programme fonctionner pendant environ 20 secondes. Poussez "stop", et ajouter un commentaire étiquetés », Saline seulement». Remplissez le tableau 4. Tableau 4: Les contractions avec un composé d'intérêt <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de contractions </td><td> L'amplitude des contractions (mV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Ajouter les composés à tester d'intérêt, et immédiatement push "démarrer" sur le LabChart7. </li><li> Laissez le programme fonctionner pendant environ 20 secondes. Poussez «stop» et d'ajouter un commentaire directement sur le fichier graphique de ce que la substance a été ajoutée et sa concentration. Remplissez le tableau ci-dessous. Tableau 5: Les contractions avec le composé _________ <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de contractions </td><td> L'amplitude des contractions (mV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Rincer la préparation avec une solution saline d'écrevisses à l'aide d'une pipette. </li><li> Ajouter d'autres substances ou diverses concentrations d'une manière semblable. Immédiatement push "démarrer" sur le LabChart7. </li><li> Laissez le programme fonctionner pendant environ 20 secondes. Poussez "stop", et ajoutez un commentaire et l'étiquette directement sur le fichier graphique indiquant le compound utilisé et la concentration. </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> De 2.3.1 de l'expérience, un graphique le nombre de contractions de chaque solution (une solution saline, la sérotonine, glutamate) en fonction du temps. Expliquez toutes les tendances. </li><li> De 2.3.2 de l'expérience, un graphique le nombre de contractions de chaque solution (une solution saline, la sérotonine, glutamate) vs l'amplitude des contractions en mV. Expliquez toutes les tendances. </li></ol> 3.1) Mesure de la vitesse et la force des contractions Pour indexer les tarifs des contractions sur le pouvez mesurer le temps depuis le début sur une flèche au début de la prochaine ou compter les débattements total sur une ou deux minutes. Les valeurs peuvent ensuite être mis en termes de contractions par minute ou seconde par fonction de la rapidité de leur apparition. Pour indexer la force des contractions d'une mesure relative pourrait être utilisé pour comparer différentes conditions. Sur le fichier enregistré, on peut utiliser le marqueur «M» et de passer à la ligne de base. Utilisez ensuite le curseur et de passer à l'apogée de la déviation et prendre note de la valeur indiquée en haut à droite de l'écran comme une valeur delta (la différence de M à la pointe). Notez le curseur doit être maintenu immobile pendant la mesure du changement. Puis déplacez le M de la forme la prochaine vague d'intérêt et de répéter la mesure.

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<li>Wrong, A. D., Sammahin, M., Richardson, R., Mercier, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+properties+of+glutamate+receptors+associated+with+the+crayfish+hindgut%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological properties of glutamate receptors associated with the crayfish hindgut.</a> J. Comp. Physiol. 189, 371-378 (2003).</li>
</ol>

Les détails fournis dans le film et le texte associé décrivent les étapes clés nécessaires pour enregistrer l&#39;activité dans l&#39;intestin postérieur de l&#39;écrevisse in situ ainsi que in vitro. Un des objectifs de notre rapport est d&#39;augmenter la sensibilisation au potentiel de cette préparation dans gérée par des étudiants des laboratoires d&#39;investigation qui enseigner les concepts fondamentaux en physiologie et pharmacologie. Ces préparations peuvent être utilisées pour enquêter sur un certain nombre de questions expérimentales qui mèneront à une meilleure compréhension des fonctions physiologiques de l&#39;intestin postérieur. Les mécanismes sous-jacents réglementation des ondes péristaltiques et de son retournement ne sont pas encore connues. Les mécanismes de renforcement du contrôle sur l&#39;ensemble du tractus gastro-intestinal sont également pas entièrement comprise. La question de savoir comment les centres supérieurs d&#39;intégrer leurs activités avec la sortie nerveux autonome qui contrôle directement le système gastro-intestinal reste un espace ouvert d&#39;enquête (Shuranova et al., 2006). En outre, les capacités de l&#39;intestin postérieur osmorégulation crustacés et les fonctions d&#39;osmorégulation au cours du stress mue et l&#39;environnement n&#39;ont pas été complètement élucidée. Il ya encore beaucoup de questions en attente de réponses dans cette préparation.

<ol><li> Ecrevisses (Procambarus clarkii). Atchafalaya biologique Supply Co., Raceland, LA., USA. </li><li> Standard écrevisses salin: modification de la solution Van Harreveld (1936). (En mm) 205 NaCl, 5,3 KCl; 13,5 CaCl 2, 2H 2 O; 2,45 MgCl 2 6H 2 O; HEPES 5 et ajusté à pH 7,4. La sérotonine, glutamate et la dopamine sont faites dans une solution saline écrevisses. Tous les produits chimiques sont obtenus chez Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). </li><li> Des outils de dissection: Beaux # 5 pinces, ciseaux fins, porte-lame de couteau, des broches # 26002-20 insectes (tous obtenus à partir des outils Fine Science (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) </li><li> Sylgard à fond plat de Pétri </li><li> Béchers (pour retenir des solutions chimiques) </li><li> Les signaux électriques sont enregistrées sur la ligne à une interface PowerLab 26T à un ordinateur (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). Nous utilisons un logiciel standard de ADInstruments nommé Chart ou la portée. <li> Pont pod pour le capteur de force (gousses Pont différentes sont nécessaires pour différents types de capteurs de force). </li><li> MLT0402 transducteur force (deux grammes) est le grade de recherche comme le montre la vidéo. MLT 0210 / D (10 mg-25 grammes) et la MLT 500 / A (0-500g) sont les transducteurs éducatif grades (ADInstruments). </li></ol>

l&#39;expérimentation physiologique avec l&#39;intestin postérieur écrevisses: un exercice de laboratoire étudiant

Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

Le but du rapport est de décrire les techniques de dissection pour la préparation de l&#39;intestin postérieur écrevisses et pour montrer comment faire des enregistrements physiologiques avec un capteur de force pour contrôler la force de contraction. En outre, nous démontrons comment surveiller visuellement l&#39;activité péristaltique, qui peut être utilisé comme un test biologique pour les différents peptides, amines biogènes et des neurotransmetteurs. Cette préparation se prête à des laboratoires étudiant la physiologie et de démontrer des concepts pharmacologiques pour les étudiants. Cette préparation a été en usage depuis plus de 100 ans, et il offre encore beaucoup comme un modèle pour étudier la génération et la régulation des rythmes péristaltique et pour décrire les mécanismes sous-jacents de leur modulation. Les essais pharmacologiques et des récepteurs de sous-typage qui ont commencé il ya 50 ans sur le hindgut contribuent toujours à la recherche d&#39;aujourd&#39;hui. Cette préparation robuste est bien adapté à la formation des étudiants en physiologie et pharmacologie.

Dans ce rapport, nous démontrons techniques qui peuvent être utilisées pour étudier la biologie de l&#39;intestin postérieur écrevisses. Nous montrons comment disséquer un abdomen écrevisses et étudier l&#39;anatomie associés, la physiologie et la modulation de l&#39;activité. L&#39;activité péristaltique et la force des contractions sont mesurées en utilisant un capteur de force.

L&#39;expérimentation physiologique avec l&#39;intestin postérieur écrevisses: un exercice de laboratoire étudiant

L'objectif de ce rapport est de décrire les techniques de dissection pour la préparation de l'intestin postérieur de l'écrevisse et de démontrer comment effectuer des enregistrements physiologiques...

L'objectif général de ce rapport est de servir d'outil pédagogique pour les élèves de niveau avancé au lycée et les étudiants du premier cycle universitaire inscrits à des cours de physiologie qui participent à des expérimentations physiologiques. Les étudiants apprennent à exposer et à enregistrer les contractions de l'intestin postérieur de l'écrevisse. Une étape supplémentaire consiste à exciser l'intestin postérieur de l'animal, ce qui permet l'application directe de composés.Ensuite, la force et le rythme des contractions du muscle lisse de l'intestin postérieur sont surveillés tout en appliquant divers agents pharmacologiques afin d'examiner les mécanismes qui modifient l'intensité de la contraction. Des résultats sont obtenus, montrant l'action de modulateurs soit sur l'innervation nerveuse, soit directement sur le muscle, selon des dosages pharmacologiques et un sous-typage des récepteurs. Bonjour, je suis le Dr J. Mercier du Département des sciences biologiques de l'Université Brock.J'utilise depuis longtemps l'intestin postérieur de l'écrevisse comme préparation pour mener des recherches sur les neurotransmetteurs qui contrôlent les muscles viscéraux. J'utilise également cette préparation comme outil pédagogique, et dans le cadre d'une collaboration avec le laboratoire du Dr Robin Cooper à l'Université du Kentucky, nous perfectionnons plusieurs expériences réalisées par les étudiants à des fins d'enseignement. Cette méthode peut fournir des informations sur la fonction de l'intestin postérieur de l'écrevisse.Il peut également être appliqué dans des études de maladies telles que celles impliquant des rythmes péristaltiques. Il peut aussi être utilisé pour décrire les mécanismes sous-jacents à la modulation de l'innervation musculaire et neuronale. Les étudiants apprendront à interpréter des données physiologiques et pharmacologiques à l'aide d'agents pharmacologiques, de neurotransmetteurs et de neurohormones, et acquerront une compréhension générale du fonctionnement des récepteurs.En ce qui concerne les agonistes et les antagonistes, les étudiants établiront des courbes dose-réponse et présenteront les données sous forme graphique pour une analyse statistique. Pour anesthésier l'animal, placez un écrevisse mesurant de six à dix centimètres de longueur corporelle sur de la glace pendant cinq à dix minutes. Tenez l'écrevisse anesthésiée par-derrière les pinces avec une main. Coupez rapidement de l'orbite oculaire jusqu'au milieu de la tête des deux côtés, puis décapitez l'écrevisse.Le sang du spécimen sera collant lors de la préparation, il faut donc laver les outils une fois l'opération terminée. Ensuite, coupez les pattes et les pinces. Puis retirez les nageoires caudales gauche et droite, en laissant la nageoire caudale médiane, et incisez le long du côté dorsal de l'abdomen jusqu'au dernier segment.Ensuite, coupez le long du dernier segment et descendez de l'autre côté. Retirez la carapace dorsale. Placez l'écrevisse disséquée dans la boîte de Pétri doublée de papier absorbant.Sérum physiologique pauvre pour écrevisses. Pour recouvrir la préparation, utilisez des épingles de dissection afin de fixer celle-ci sur la boîte de Pétri. L'intestin postérieur est généralement entouré par un réseau de vaisseaux sanguins et de tissu conjonctif.Retirez-les avec des pinces en prenant soin de ne pas endommager l'intestin. L'intestin postérieur est désormais visible le long de l'abdomen.Laisser le préparat de crevette disséquée reposer dans la solution saline pendant environ 10 minutes afin qu’il puisse se remettre du choc de la dissection et de l’exposition à la solution saline. Observer les contractions péristaltiques lentes de l’intestin postérieur. Pour commencer, la fréquence des contractions peut désormais être calculée.Comptez le nombre de contractions survenant en 30 secondes et enregistrez-le dans un journal de bord. Notez également le type de contractions observées et indiquez s’il s’agit de contractions péristaltiques ou spasmodiques. Précisez le sens de propagation des éventuelles ondes péristaltiques.Comptez la fréquence des contractions près de l'anus et à mi-longueur de l'abdomen, et vérifiez s'il existe des différences de fréquence entre ces deux régions. Préparez une variété de solutions de test, toutes à la même température que la solution saline de bain. La première solution testée ici sera de la sérotonine à un micromolaire, préparée dans de la saline pour écrevisse.À l’aide d’une pipette, retirez la solution saline de la cavité de l’abdomen exposé de l’écrevisse et appliquez directement la solution de sérotonine à une micromolaire sur l’intestin postérieur. Immédiatement après l’ajout de la nouvelle solution, attendez 30 secondes, puis comptez les contractions sur une durée de 30 secondes dans la région proche de l’anus, puis comptez les contractions des 30 secondes suivantes au milieu de l’abdomen. Notez ces valeurs dans un tableau et indiquez également le type de contractions observées. Suivant.Versez la solution d'essai hors de la cuve d'enregistrement et rincez l'intestin postérieur plusieurs fois avec du sérum physiologique normal pour écrevisse. Rincez ensuite le prélèvement toutes les 30 secondes pendant cinq minutes. À ce stade, vous pouvez ajouter la solution d'essai suivante, qui, dans cette démonstration, est de l'Topamine à une micromolaire.Enregistrez vos observations comme précédemment et répétez ce processus pour les composés test restants. Lorsque vous utilisez plusieurs concentrations d'une même substance, veillez à commencer par la concentration la plus faible puis à passer aux concentrations plus élevées. Le montage permettant de mesurer la force des contractions de l'intestin grêle comprend un ordinateur portable équipé du logiciel Lab Chart 7, le Bridge Pod, le PowerLab 26T et le transducteur de force.Avant de pouvoir mesurer la force des contractions musculaires du tube digestif, vous devez isoler le tractus gastro-intestinal. Pour ce faire, découpez les muscles du dernier segment abdominal, insérez deux épingles ou plus à travers la cuticule ventrale molle de chaque côté de l'anus, puis retirez le reste de l'abdomen, en laissant le tube digestif postérieur et l'anus attachés à un petit morceau de cuticule. Le tube digestif doit être sectionné près de la jonction entre le thorax et l'abdomen.Déplacez maintenant le tube digestif vers une coupelle peu profonde dont le fond est recouvert de sard. Un vaisseau sanguin parcourt l'aspect dorsal du tube digestif. Écartez-le soigneusement du tube digestif.Appliquez une solution saline fraîche pour écrevisses sur le montage. Déplacez le transducteur de force au-dessus du montage. Examinez attentivement la broche fixée au bas du transducteur de force.L'extrémité qui s'accroche à l'intestin présente une légère courbure. Accrochez la légère courbure de l'épingle à l'extrémité coupée de l'intestin postérieur. Après avoir accroché l'intestin postérieur, déplacez légèrement la boîte jusqu'à ce que l'intestin postérieur soit tendu.Soignez cette étape car l'intestin doit être tendu, mais pas trop. Un excès de tension pourrait endommager le muscle. Lorsque la boîte est en position optimale, utilisez de la cire ou de l'argile pour maintenir la boîte en place.Ensuite, lancez le logiciel. Pour commencer l'enregistrement, ouvrez le logiciel LabChart. Fermez LabChart et le centre d'accueil.Allez dans la configuration en haut à gauche. Cliquez sur les paramètres de canal en bas à gauche. Modifiez les paramètres de canal pour n'avoir qu'un seul canal.Cliquez sur OK à droite de l'écran. Allez au canal un, ouvrez le module de pont. Réglez la plage sur le réglage le plus sensible, 200 microvolts dans ce cas, en haut du graphique dans le coin droit.Régler les cycles par seconde sur 2K. Vous êtes maintenant prêt à enregistrer. Cliquez sur démarrer pour vous assurer que le dispositif fonctionne correctement.Effleurez légèrement la pointe du transducteur avec une pipette. Vous devriez observer un changement de force enregistré par le logiciel. Cliquez sur arrêter dans le logiciel, puis cliquez sur démarrer et laissez le programme s'exécuter.Pendant environ 20 secondes, cliquez sur arrêt et ajoutez un commentaire intitulé saline. Calculez uniquement la fréquence des contractions en mesurant le temps entre le début d'une déviation et le début de la suivante, ou en comptant le nombre total de déviations sur une ou deux minutes. Exprimez la fréquence en contractions par minute ou en contractions par seconde, selon la rapidité avec laquelle elles se produisent.Pour mesurer la force des contractions, utilisez une mesure relative afin de comparer les contractions dans différentes conditions à partir du fichier enregistré. Déplacez le marqueur M jusqu'à la ligne de base, puis déplacez le curseur jusqu'au sommet de la déviation et notez la valeur indiquée en haut à droite de l'écran. Il s'agit d'une valeur delta, correspondant à la différence entre M et le sommet.Remarquez que le curseur doit rester immobile au sommet afin de mesurer le changement. Ensuite, déplacez le marqueur M et le curseur vers la prochaine forme d'onde d'intérêt et répétez la mesure pour examiner l'effet des modulateurs. Sur ce montage, changez lentement la solution saline pour une solution de test.Dans ce cas, ajouter un micromolaire de sérotonine et continuer l'enregistrement de la fréquence et de l'amplitude des contractions comme dernier test. Pour ce test de préparation, vérifier si les inhibiteurs des jonctions communicantes modifient la fréquence ou l'amplitude des contractions ; les inhibiteurs des jonctions communicantes comprennent un héptanol ou du sérum physiologique qui a été saturé en dioxyde de carbone. Ces composés sont utilisés en dernier car ils peuvent endommager les fibres musculaires après une exposition prolongée. Pour comparer l'effet des différents composés, représenter les données sur un graphique.Une autre utilisation intéressante de ce prélèvement consiste à enregistrer la force générée par les muscles circulaires. Toutefois, si vous avez appliqué des inhibiteurs des jonctions communicantes à votre prélèvement, ces inhibiteurs peuvent avoir endommagé les muscles circulaires ; dans ce cas, vous devez utiliser un nouveau prélèvement de tube digestif postérieur pour tester les muscles circulaires. Pour exposer les muscles circulaires, incisez longitudinalement le tube intestinal à l’aide de fines ciseaux. Utilisez des épingles fines pour fixer solidement un côté sur la boîte. Fixez l'épingle crochue du transducteur à l'autre extrémité du fragment. Exposez la préparation aux mêmes composés qui ont été testés sur les muscles longitudinaux ; la relation entre les composés testés et le nombre ainsi que le type de contractions est indiquée ici.Vous pouvez représenter graphiquement le nombre de contractions en fonction du temps pour les solutions de sérum physiologique, de sérotonine et de glutamate. Vous pouvez également tracer le nombre de contractions en fonction de la force des contractions en millivolts pour les solutions de sérum physiologique, de sérotonine et de glutamate. Ces graphiques peuvent être réalisés pour les muscles longitudinaux et circulaires afin de tester si les muscles longitudinaux et circulaires des différentes régions de l'intestin présentent des réponses différentes aux divers modulateurs.Les expériences ci-dessus peuvent être répétées sur différentes régions allant de l'anus vers le haut le long de l'abdomen. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de faire attention à ne pas endommager le tube digestif avec la pince et à ne pas tirer trop fort avec le transducteur de force après cette procédure. D'autres méthodes, telles que les enregistrements électrophysiologiques du muscle, peuvent être effectuées afin d'étudier d'autres aspects, comme les fonctions et les modulations des canaux ioniques, et peuvent servir de modèle pour d'autres tissus dans d'autres modèles animaux.

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